Name: protein kinase c-delta inhibitor peptide formulation using gold nanoparticles
Uploaded: 2019-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door onderzoekssubsidies uit de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek (PJT-148847), ministerie van onderzoek en innovatie van Ontario (RE-08-029) en Canada eerste onderzoek of Excellence Program, geneeskunde door Design aan de Universiteit van Toronto. Dr. Mingyao Liu is James en Mary Davie Chair in Long letsel, reparatie en regeneratie.

1. bereiding van Peptide oplossingen
<ol><li>Ophalen van de peptiden (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) uit de diepvries van-20 ° C en ontdooien bij kamertemperatuur (RT). Opmerking: Houd de fles gesloten om te voorkomen dat vocht condenserend op de peptiden.</li>
	<li>Weeg 0.01 g van elk peptide op een microscale. Zet elke peptide in een aparte 50 mL conische buis.</li>
	<li>Voeg 18.74 mL gedeïoniseerd water (DI) aan de P2-buis.</li>
	<li>Voeg 16.93 mL DI water aan de P4-buis.</li>
	<li>Voeg 8.21 mL ac...

<ol>
	<li>Yusen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation:+thirty-first+adult+lung+and+heart-lung+transplant+report--2014;+focus+theme:+retransplantation.">The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).</li><li>Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+graft+dysfunction:+definition,+risk+factors,+short-+and+long-term+outcomes.">Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes.</a> Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).</li><li>Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-related+mechanosignaling+with+lung+ischemia:+lessons+from+basic+research+can+inform+lung+transplantation.">Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).</li><li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+delta-protein+kinase+C+protects+against+reperfusion+injury+of+the+ischemic+heart+in+vivo.">Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo.</a> Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).</li><li>Lincoff, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+delta-protein+kinase+C+by+delcasertib+as+an+adjunct+to+primary+percutaneous+coronary+intervention+for+acute+anterior+ST-segment+elevation+myocardial+infarction:+results+of+the+PROTECTION+AMI+Randomized+Controlled+Trial.">Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial.</a> European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deltaV1-1+Reduces+Pulmonary+Ischemia+Reperfusion-Induced+Lung+Injury+by+Inhibiting+Necrosis+and+Mitochondrial+Localization+of+PKCdelta+and+p53.">deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).</li><li>Lin, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derangements+of+post-ischemic+cerebral+blood+flow+by+protein+kinase+C+delta.">Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta.</a> Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).</li><li>Lin, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+delta+modulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+after+cardiac+arrest.">Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest.</a> Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-tat+protein+is+a+heparin-binding+angiogenic+growth+factor.">HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor.</a> Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).</li><li>Kim, H., Moodley, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT+cell-penetrating+peptide+modulates+inflammatory+response+and+apoptosis+in+human+lung+epithelial+cells.">TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells.</a> Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).</li><li>Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+effects+of+Tat+cell-penetrating+peptide:+a+multifunctional+Trojan+horse.">Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse.</a> Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).</li><li>Auffan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+definition+of+inorganic+nanoparticles+from+an+environmental,+health+and+safety+perspective.">Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective.</a> Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).</li><li>Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+in+delivery+applications.">Gold nanoparticles in delivery applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).</li><li>Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+the+cellular+uptake+of+physiologically+stable+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+with+single+amino+acids.">Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+delivery+of+a+rationally+designed+intracellular+peptide+drug+with+gold+nanoparticle-peptide+hybrids.">Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids.</a> Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).</li><li>Cheng, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+for+biomolecular+detection+and+medical+diagnostics.">Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).</li><li>Rosi, N. L., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructures+in+biodiagnostics.">Nanostructures in biodiagnostics.</a> Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).</li><li>Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+in+chemical+and+biological+sensing.">Gold nanoparticles in chemical and biological sensing.</a> Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).</li><li>Boisselier, E., Astruc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+in+nanomedicine:+preparations,+imaging,+diagnostics,+therapies+and+toxicity.">Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity.</a> Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Dependent+Attenuation+of+Toll-like+Receptor+Signaling+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids.">Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+pH+modulation+by+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+enables+potent+anti-inflammatory+activity+in+phagocytic+immune+cells.">Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells.</a> Biomaterials. 111, 90-102 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Structure+Determines+the+Immune+Responses+Generated+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids.">Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> Particle &amp; Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).</li><li>Pamies, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+behaviour+of+gold+nanoparticles+in+saline+aqueous+media.">Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media.</a> Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).</li><li>Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediating+tumor+targeting+efficiency+of+nanoparticles+through+design.">Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design.</a> Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).</li><li>Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+are+taken+up+by+human+cells+but+do+not+cause+acute+cytotoxicity.">Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity.</a> Small. 1 (3), 325-327 (2005).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+Hydrophobic+Drugs+in+Nanoparticle+Monolayers+with+Efficient+Release+into+Cancer+Cells.">Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).</li><li>Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+colloidal+gold+nanoparticles+after+intravenous+administration:+Effect+of+particle+size.">Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size.</a> Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).</li><li>Balasubramanian, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+gold+nanoparticles+and+gene+expression+changes+in+the+liver+and+spleen+after+intravenous+administration+in+rats.">Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats.</a> Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).</li><li>Lipka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+PEG-modified+gold+nanoparticles+following+intratracheal+instillation+and+intravenous+injection.">Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection.</a> Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).</li></ol>

Om ervoor te zorgen de juiste formulering, is het van cruciaal belang dat de oplossing van de δPKCi het ultrasoonapparaat stap beschreven in 1.6 ondergaat. ΔPKCi peptide reeks bevat hydrofobe wordt, dus een ultrasoonapparaat helpt bij het oplossen van PKCi in de oplossing van 50% acetonitril. Bovendien is het zeer belangrijk te mengen het oplosmiddel minutieus, zoals beschreven in stap 2.7.  De GNP/PKCi hybrid zal niet goed worden geformuleerd indien deze stappen zijn niet behoorlijk gedaan, als gevolg van de samenvoe...

Longtransplantatie slaat patiënten met einde-fase Long ziekte1. Ernstige complicaties na longtransplantatie blijven echter een obstakel. In de vroege stadia na longtransplantatie, primaire graft disfunctie is de meest schadelijke complicatie1, en de primaire oorzaak is ischemie-reperfusie (IR)-geïnduceerde acute lung injury2.
Onder koude bewaring is stofwisseling in een donor Long beperkt tot een zeer laag niveau. Echter, reactieve zuurstof soorten en synthese van stikstofmonoxide worden geactiveerd als gevolg van de beëindiging van de bloed stroom3. Na de transplantatie, bloedcirculatie wordt hersteld, en reactieve zuurstof soorten en stikstofmonoxide gegenereerd tijdens koude ischemie verbeteren ontsteking en cel dood, wat resulteert in weefsel schade.
IR om letsel te voorkomen, is een proteïne kinase Cδ inhibitor (PKCδi) gebruikt in het hart, hersenen en longen4,5,6,7,8. Deze studies toonden aan dat PKCδi ontsteking en apoptosis tijdens reperfusie daalde. Het heeft ook verhinderd pulmonaire IR letsel bij ratten en in een Long transplantatie model6. PKCδi is meestal geconjugeerd met een cel-penetrating peptide, TAT, voor intracellulair levering. Het heeft echter aangetoond dat de TAT peptide alleen aspecifieke biologische effecten heeft, met inbegrip van de bevordering van de angiogenese, apoptosis en remming van meerdere cytokines9,10,11. Nanodeeltjes, kleine deeltjes, variërend van 1 tot 100 nm in diameter12, werden onderzocht als kandidaten bij het vergemakkelijken van de drug delivery13. Gouden nanodeeltjes (BNP) worden met name beschouwd als noninvasive en niet giftig. Daarom hebben wij van het BNP als drug delivery dragers voor peptide gebaseerde drugs14,15ontwikkeld.
Het oppervlak van het BNP kan gemanipuleerd worden voor specifieke toepassingen zoals moleculaire erkenning16,17, chemische sensing18, imaging19en drug delivery. Een GNP/peptide hybridesysteem heeft ontwikkeld, met 20 nm BNP en twee korte peptides (P2: CAAAAE en P4: CAAAAW) op een 95:5-verhouding, wijzigen van de oppervlakte-eigenschappen van het BNP. De P2-peptide, met de negatief geladen glutaminezuur (E) aan het eind, stabiliseert het BNP in een waterige oplossing, en de P4-peptide, met de hydrofobe tryptofaan (W) aan het eind, helpt het BNP ingang in cellen14. Het residu van cysteïne (C) in het N-terminus van deze peptides bevat een thiol-groep die tot en met de gouden oppervlakken14 conjugaat kan. Deze hybride peptide/BBP werd verder gebruikt voor het leveren van PKCδi (CSFNSYELGSL). De geoptimaliseerde molaire verhouding van P2:P4 naar PKCδi is 47.5:2.5:50. BNP geconjugeerd met PKCδi (GNP/PKCi) zijn stabiele in gedistilleerd water, 0.9% NaCl en PBS met boviene albumine of foetale runderserum14. Intraveneuze injectie van GNP/PKCi heeft aangetoond dat het voorkomen van ischemie-reperfusie blessures van de Long-15. Dit artikel beschrijft een methode om te formuleren GNP/PKCi en wordt beschreven hoe om te evalueren van de fysisch-chemische eigenschappen van de GNP/PKCi. We hebben soortgelijke methoden gebruikt voor het formuleren van andere peptide gebaseerde drugs geconjugeerd met GNP20,21,22. Hopelijk dat dit artikel zal meer aandacht vestigen op deze nieuwe formulering voor intracellulaire drug delivery.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:603px;" width="603">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">negatively charged glutamic acid peptide (P2)</td>
			<td style="width:189px;">CanPeptide</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;">Sequence: CAAAAE-NH2 
			Length: 6aa 
			Modification: C-terminal amidation 
			Quantity: 50mg 
			Purity: &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">hydrophobic tryptophan peptide (P4)</td>
			<td>CanPeptide</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;">Sequence: CAAAAW-NH2 
			Length: 6aa 
			Modification: C-terminal amidation 
			Quantity: 50mg 
			Purity: &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#948;PKCi peptide</td>
			<td>CanPeptide</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;">Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 
			Length: 11aa 
			Modification: C-terminal amidation 
			Quantity: 50mg 
			Purity: &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube(50ml)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3582070</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube(15ml)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3582096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">271004-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:71px;">Branson Ultrasonics Corp.</td>
			<td style="width:119px;">Branson 2510MTH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtube</td>
			<td>Diamed.ca</td>
			<td style="width:119px;">AD 150-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold nanoparticle solution</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">15705-5</td>
			<td>A particle size is 20nm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Rocking Platform shaker</td>
			<td style="width:71px;">VWR international</td>
			<td style="width:119px;">40000-304&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Acryl cuvette</td>
			<td style="width:71px;">SARSREDT</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67.758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">Caty 60 UV-Vis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein kinase c-delta inhibitor peptide formulation using gold nanoparticles

Protein kinase C-delta remmer (PKCδi) is een veelbelovende drug ter voorkoming van ischemie-reperfusie-veroorzaakte orgel schade. Het is meestal geconjugeerd met een cel-penetrating peptide, TAT, voor intracellulair levering. TAT heeft echter aangetoond dat niet-specifieke biologische activiteit. Gouden nanodeeltjes (BNP) kan worden gebruikt als drug delivery dragers zonder erkende toxiciteit. Daarom hebben we een hybride GNP/peptide gebruikt voor PKCδi. Twee korte peptides (P2: CAAAAE en P4: CAAAAW), op een 95:5-verhouding, werden gebruikt voor het wijzigen van de oppervlakte-eigenschappen van het BNP. Geconjugeerd met PKCδi (GNP/PKCi) van het BNP zijn stabiel in gedistilleerd water, 0.9% NaCl, en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende bovien serumalbumine of foetale runderserum. Intraveneuze injectie van GNP-PKCi werd eerder aangetoond dat het voorkomen van ischemie-reperfusie blessures van de longen. Dit artikel schetst een protocol voor het formuleren van GNP/PKCi en het beoordelen van de physiochemical eigenschappen van GNP/PKCi. We hebben soortgelijke methoden gebruikt voor het formuleren van andere drugs peptide gebaseerde met BNP. Dit artikel zal hopelijk meer aandacht vestigen op deze roman intracellulaire drug delivery technologie en haar toepassingen in vivo.

Moet worden gezorgd voor de evaluatie van de biofysische eigenschappen van de hybride GNP/PKCi, als GNP neiging om statistische in oplosmiddel. Wanneer de GNP wordt samengevoegd, verandert de kleur van de oplossing van roze tot paars (Figuur 1a). UV-Vis spectrofotometer is kundig voor speurder naar de veranderingen meer gevoelig. Als de GNP/PKCi is niet gecumuleerd het hoogtepunt van de absorptie dient bij 525 nm (Figuur 1b). Als...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles at JoVE.com

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Wij hebben vroeger een gouden nanoparticle peptide hybride intraveneus leveren een synthetische peptide, proteïne kinase C-delta Inhibitor van de omwenteling, die verminderd acute lung ischemie-reperfusie-veroorzaakte schade. Hier laten we het gedetailleerde protocol van de formulering van de drug. Andere intracellulaire peptiden kunnen ook worden geformuleerd.

Protein Kinase C-delta remmer Peptide formulering met gouden nanodeeltjes

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Ons unieke drug leveringssysteem, dat 20 nanometer gouddeeltjes in twee specifieke korte peptiden gebruikt, kan gouden nanodeeltjes in fysiologische oplossing stabiliseren en zijn cellulaire opname verbeteren, en zo, effectief peptide-gebaseerde of andere drugs in cellen leveren. Onze GNP peptide hybride is eenvoudig te synthetiseren en stabiel. Door het gebruik van gouden nanodeeltjes peptide hybride als drug dragers, kunnen we de overdracht peptide drugs in de cellen effectief en in overvloed.We behandelden ischemie-reperfusieletsel in de longen met onze GNP/PKCi hybride. HET BNP brengt PKC-repterpeptiden in het cytoplasma. Deze leveringsmethode was in staat om meer ernstige longschade te verminderen met behulp van een lagere dosering van PKCi dan andere leveringsmethoden.Om deze procedure te beginnen, haal de peptiden uit een vriezer bij min 20 graden Celsius, en ontdooi ze bij kamertemperatuur. Gebruik een microschaal om 0,01 gram van elk ontdooid peptide te wegen en breng elk peptide over in een aparte conische buis van 50 milliliter. Voeg 18,74 milliliter gedeïsoniseerd water toe aan de P2-buis en 16,93 milliliter gedeïsized water aan de P4-buis.Voeg 8,21 milliliter van 50%acetonitrilverdund in gedeïsized water toe aan de PKC deltaremmerbuis. Vortex de peptide oplossingen kort. Plaats de buizen vervolgens vijf minuten in een sonicator op 40 megahertz.Breng hierna de oplossingen over naar een bioveiligheidskast. Het is van cruciaal belang om de 50 mL conische buis vijf minuten in een sonicator te plaatsen. Als deze stap wordt overgeslagen, vormt het BNP/PKCi aggregaties.Breng een milliliter van elke peptide oplossing aan zijn eigen nieuwe 50 milliliter conische buis. Voeg 19 milliliter gedeïsized water toe aan de buizen met P2 en P4. En voeg 19 milliliter van 50% acetonitril toe aan de buis met PKC deltaremmer. Voeg 475 milliliter van de P2-oplossing, 25 microliter van de P4-oplossing, 500 microliter van de PKC deltaremmeroplossing toe aan een buis van 15 milliliter.Voeg vervolgens negen milliliter van een 20 nanometer BNP-oplossing toe aan dezelfde buis. Haal de gecombineerde oplossing uit de bioveiligheidskast en wikkel de buis in aluminiumfolie. Plaats de buis 's nachts op een shaker.De volgende dag, breng de monsters terug naar de biosafety kabinet. Breng een milliliter aliquots van de GNP / PKCi oplossing in 1,5 milliliter microbuizen. Centrifugeren de microbuizen bij een microcentrifuge op 15294 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten.Breng de microbuizen terug in de bioveiligheidskast en verwijder de supernatent van elke buis, terwijl de GNP-pellet niet wordt verstoord. Resuspend elke pellet in het gewenste oplosmiddel volgens de vereiste concentratie. Om het BNP/PKCi hybride oplosbaarheid te beoordelen, giet 0,5 milliliter van de GNP/PKCi-oplossing in een opbouw cuvette.Plaats de cuvette op een UV-Vis spectrofotometer en test de piekabsorptie. In deze studie wordt eiwitkinase C-deltaremmer geconjugeerd met gouden nanodeeltjes om een GNP/PKCi hybride te vormen. Zorg moet worden genomen met de evaluatie van de biofysische eigenschappen van de hybride, zoals goud nanodeeltjes hebben de neiging om te aggregaat in een oplosmiddel.Wanneer de nanodeeltjes zich optellen, verandert de kleur van de oplossing van roze naar paars. De monsters worden geanalyseerd met een UV-Vis spectrofotometer die in staat is om te detecteren met een hoge mate van gevoeligheid. Als de hybride niet wordt samengevoegd, moet de piek van een absorptie op 525 nanometer liggen.Als het BNP wordt samengevoegd, wordt de piek van absorptie naar rechts verschoven. Zoals te zien is, wanneer aggregaten zijn gevormd, neemt de delta optische dichtheid af. Bij het formuleren van de GNP peptide hybriden, is het belangrijk om te onthouden de verhouding van peptiden tot BNP oplossing moet een tot negen.Deze GNP/PKCi-formule kan worden gebruikt voor ischemie-reperfusieletsel in andere orgaansystemen dan de long. Alle peptiden kunnen hechten aan het BNP als deze peptiden hebben een cysteïne residu op de N-terminus. Dit betekent dat GNP peptide hybride kan worden gebruikt om andere peptide drugs te vervoeren in de cel.Rationeel ontworpen peptiden zijn nieuwe technologie die specifieke eiwit-eiwit interactie in die cellen kan brengen. Deze techniek, hier ontwikkeld, kan worden gebruikt voor de levering van nieuwe peptide drugs of voor aangepaste versies van bestaande geneesmiddelen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering van diblok polymere nanodeeltjes door middel van Nanoprecipitation Techniek

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthese, Vergadering, en de karakterisatie van monolaag Protected gouden nanodeeltjes Films voor eiwit monolaag Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Microfabricage van Nanoporeuze Gold Patronen voor Cell-materiaal Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonische Nanodeeltjes voor Regeneratieve Onderzoek

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...