Name: protein kinase c-delta inhibitor peptide formulation using gold nanoparticles
Uploaded: 2019-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles at JoVE.com

Detta arbete stöds av forskningsanslag från kanadensiska institut för hälsa forskning (PJT-148847), ministeriet för forskning och Innovation av Ontario (RE-08-029) och Kanada första forskning av Excellence Program, medicin genom Design vid University of Toronto. Dr. Mingyao Liu är James och Mary Davie stol i lungskada, reparation och förnyelse.

1. beredning av peptid lösningar
<ol><li>Hämta peptiderna (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) från-20 ° C frysen och Tina i rumstemperatur (RT). Obs: Håll flaskan stängd för att förhindra att fukt från kondenserande på peptiderna.</li>
	<li>Väga 0,01 g av varje peptid på en hur provtagningsutrustningen skall. Tas varje peptid i ett separat 50 mL koniska rör.</li>
	<li>Tillsätt 18.74 mL avjoniserat vatten (DI) vatten till P2-röret.</li>
	<li>Tillsätt 16.93 mL DI vatten till P4 röret.</li>
	...

<ol>
	<li>Yusen, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation:+thirty-first+adult+lung+and+heart-lung+transplant+report--2014;+focus+theme:+retransplantation.">The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).</li><li>Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+graft+dysfunction:+definition,+risk+factors,+short-+and+long-term+outcomes.">Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes.</a> Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).</li><li>Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-related+mechanosignaling+with+lung+ischemia:+lessons+from+basic+research+can+inform+lung+transplantation.">Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).</li><li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+delta-protein+kinase+C+protects+against+reperfusion+injury+of+the+ischemic+heart+in+vivo.">Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo.</a> Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).</li><li>Lincoff, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+delta-protein+kinase+C+by+delcasertib+as+an+adjunct+to+primary+percutaneous+coronary+intervention+for+acute+anterior+ST-segment+elevation+myocardial+infarction:+results+of+the+PROTECTION+AMI+Randomized+Controlled+Trial.">Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial.</a> European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deltaV1-1+Reduces+Pulmonary+Ischemia+Reperfusion-Induced+Lung+Injury+by+Inhibiting+Necrosis+and+Mitochondrial+Localization+of+PKCdelta+and+p53.">deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).</li><li>Lin, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derangements+of+post-ischemic+cerebral+blood+flow+by+protein+kinase+C+delta.">Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta.</a> Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).</li><li>Lin, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+delta+modulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+after+cardiac+arrest.">Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest.</a> Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-tat+protein+is+a+heparin-binding+angiogenic+growth+factor.">HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor.</a> Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).</li><li>Kim, H., Moodley, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAT+cell-penetrating+peptide+modulates+inflammatory+response+and+apoptosis+in+human+lung+epithelial+cells.">TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells.</a> Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).</li><li>Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+effects+of+Tat+cell-penetrating+peptide:+a+multifunctional+Trojan+horse.">Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse.</a> Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).</li><li>Auffan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+definition+of+inorganic+nanoparticles+from+an+environmental,+health+and+safety+perspective.">Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective.</a> Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).</li><li>Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+in+delivery+applications.">Gold nanoparticles in delivery applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).</li><li>Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+the+cellular+uptake+of+physiologically+stable+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+with+single+amino+acids.">Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+delivery+of+a+rationally+designed+intracellular+peptide+drug+with+gold+nanoparticle-peptide+hybrids.">Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids.</a> Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).</li><li>Cheng, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnologies+for+biomolecular+detection+and+medical+diagnostics.">Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).</li><li>Rosi, N. L., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructures+in+biodiagnostics.">Nanostructures in biodiagnostics.</a> Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).</li><li>Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+in+chemical+and+biological+sensing.">Gold nanoparticles in chemical and biological sensing.</a> Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).</li><li>Boisselier, E., Astruc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+in+nanomedicine:+preparations,+imaging,+diagnostics,+therapies+and+toxicity.">Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity.</a> Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Dependent+Attenuation+of+Toll-like+Receptor+Signaling+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids.">Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+pH+modulation+by+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+enables+potent+anti-inflammatory+activity+in+phagocytic+immune+cells.">Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells.</a> Biomaterials. 111, 90-102 (2016).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Structure+Determines+the+Immune+Responses+Generated+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids.">Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> Particle &amp; Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).</li><li>Pamies, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+behaviour+of+gold+nanoparticles+in+saline+aqueous+media.">Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media.</a> Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).</li><li>Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediating+tumor+targeting+efficiency+of+nanoparticles+through+design.">Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design.</a> Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).</li><li>Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles+are+taken+up+by+human+cells+but+do+not+cause+acute+cytotoxicity.">Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity.</a> Small. 1 (3), 325-327 (2005).</li><li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+Hydrophobic+Drugs+in+Nanoparticle+Monolayers+with+Efficient+Release+into+Cancer+Cells.">Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).</li><li>Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+colloidal+gold+nanoparticles+after+intravenous+administration:+Effect+of+particle+size.">Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size.</a> Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).</li><li>Balasubramanian, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+gold+nanoparticles+and+gene+expression+changes+in+the+liver+and+spleen+after+intravenous+administration+in+rats.">Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats.</a> Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).</li><li>Lipka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+PEG-modified+gold+nanoparticles+following+intratracheal+instillation+and+intravenous+injection.">Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection.</a> Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).</li></ol>

För att säkerställa korrekt formulering, är det viktigt att δPKCi lösningen genomgår den ultraljudsbehandling steg beskrivs i 1.6. ΔPKCi peptid sekvens innehåller hydrofoba delarna, så en någon sonikator bistår i upplösning PKCi i 50% acetonitril lösningen. Dessutom är det mycket viktigt att blanda spädningsvätskan minutiöst, som beskrivs i steg 2,7.  GNP/PKCi hybrid kommer inte vara väl formulerade om dessa steg inte göras ordentligt, på grund av aggregering av den δPKCi peptid23...

Lungtransplantation sparar patienter med slutstadiet lung sjukdom1. Allvarliga komplikationer efter lungtransplantation är dock ett hinder. I ett tidigt skede efter lungtransplantation, primära transplantatdysfunktion är den mest skadliga komplikation1och dess primära orsak är ischemi-reperfusion (IR)-inducerad akut lung skada2.
Under kalla konservering är metabolism i en donator lunga begränsad till en mycket låg nivå. Dock aktiveras reaktiva syreradikaler och kväveoxid syntesen på grund av upphörande av blod flöde3. Efter transplantation, blodcirkulationen är återställd, och reaktiva syreradikaler och kväveoxid som genereras under kall ischemi öka inflammation och celldöd död, vilket resulterar i vävnadsskada.
För att förhindra IR skada, har en Cδ proteinkinashämmare (PKCδi) använts i hjärta, hjärna och lungor4,5,6,7,8. Dessa studier visade att PKCδi minskade inflammation och apoptos under reperfusion. Det har också förhindrat pulmonell IR skada i råttor och en lung transplantation modell6. PKCδi är vanligtvis konjugerat med en cell-penetrerande peptid, TAT, för intracellulära leverans. Det har dock visat att TAT peptiden ensam har ospecifika biologiska effekter, inbegripet främjande av angiogenes, apoptos och hämning av flera cytokiner9,10,11. Nanopartiklar, små partiklar som sträcker sig från 1 till 100 nm i diameter12, har undersökts som kandidater för att underlätta drogen leverans13. I synnerhet betraktas guld nanopartiklar (BNI) som icke-invasiv och giftfritt. Därför har vi utvecklat BNI som drogen leverans bärare för peptid-baserad droger14,15.
Ytan av BNI kan manipuleras för specifika applikationer såsom molekylär igenkänning16,17, kemiska fjärranalys18, imaging19och drug delivery. En GNP/peptid hybrid-systemet har utvecklats, som innehåller 20 nm BNI och två korta peptider (P2: CAAAAE och P4: CAAAAW) i förhållandet 95:5, att ändra ytegenskaper av BNI. P2 peptiden, med negativt laddad glutaminsyra (E) i slutet, stabiliserar BNI i vattenlösning, och P4 peptiden, med den hydrofoba tryptofan (W) i slutet, hjälper BNI hänrycka in i celler14. Cysteinrest (C) vid den N ändstationen av dessa peptider innehåller en tiolgrupp som kan böja till guld ytor14. Denna peptid/GNP hybrid användes ytterligare att leverera PKCδi (CSFNSYELGSL). Optimerad molar förhållandet av P2:P4 till PKCδi är 47.5:2.5:50. BNI konjugerat med PKCδi (GNP/PKCi) är stabil i destillerat vatten, 0,9% NaCl och PBS som innehåller bovint albumin eller fetalt bovint serum14. Intravenös injektion av GNP/PKCi har visat sig förhindra ischemi-reperfusionsskada av lungcancer15. Denna artikel beskriver en metod för att formulera GNP/PKCi och beskriver hur du utvärdera GNP/PKCi fysikalisk-kemiska egenskaper. Vi har använt liknande metoder för att formulera andra peptidbaserade droger konjugerat till GNP20,21,22. Vi hoppas att denna artikel kommer att dra mer uppmärksamhet åt denna nya formulering för intracellulära drogen leverans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:603px;" width="603">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">negatively charged glutamic acid peptide (P2)</td>
			<td style="width:189px;">CanPeptide</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;">Sequence: CAAAAE-NH2 
			Length: 6aa 
			Modification: C-terminal amidation 
			Quantity: 50mg 
			Purity: &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">hydrophobic tryptophan peptide (P4)</td>
			<td>CanPeptide</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;">Sequence: CAAAAW-NH2 
			Length: 6aa 
			Modification: C-terminal amidation 
			Quantity: 50mg 
			Purity: &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#948;PKCi peptide</td>
			<td>CanPeptide</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;">Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 
			Length: 11aa 
			Modification: C-terminal amidation 
			Quantity: 50mg 
			Purity: &#62;95%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube(50ml)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3582070</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube(15ml)</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3582096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">271004-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:71px;">Branson Ultrasonics Corp.</td>
			<td style="width:119px;">Branson 2510MTH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtube</td>
			<td>Diamed.ca</td>
			<td style="width:119px;">AD 150-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold nanoparticle solution</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">15705-5</td>
			<td>A particle size is 20nm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Rocking Platform shaker</td>
			<td style="width:71px;">VWR international</td>
			<td style="width:119px;">40000-304&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Acryl cuvette</td>
			<td style="width:71px;">SARSREDT</td>
			<td align="right" style="width:119px;">67.758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">Caty 60 UV-Vis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein kinase c-delta inhibitor peptide formulation using gold nanoparticles

C-delta proteinkinashämmare (PKCδi) är en lovande läkemedel för att förhindra ischemi-reperfusion-inducerad organ skada. Det är oftast konjugerat till en cell-penetrerande peptid, TAT, för intracellulära leverans. TAT har emellertid visat ospecifika biologiska aktiviteter. Guldnanopartiklar (BNI) kan användas som drogen leverans bärare utan erkända toxicitet. Därför har vi använt en GNP/peptid hybrid för att leverera PKCδi. Två korta peptider (P2: CAAAAE och P4: CAAAAW), i förhållandet 95:5, användes för att modifiera ytegenskaper av BNP. BNI konjugerat med PKCδi (GNP/PKCi) är stabila i destillerat vatten, 0,9% NaCl och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande bovint serum albumin eller fetalt bovint serum. Intravenös injektion av GNP-PKCi var tidigare visat att förhindra ischemi-reperfusionsskada i lungan. Denna artikel beskriver ett protokoll för att formulera GNP/PKCi och bedöma fysiokemiska egenskaper GNP/PKCi. Vi har använt liknande metoder för att formulera andra peptidbaserade droger med BNP. Denna artikel kommer förhoppningsvis dra mer uppmärksamhet till denna roman intracellulära drogen leverans teknik och dess tillämpningar i vivo.

Försiktighet bör iakttas att utvärdera biofysiska egenskaper av GNP/PKCi hybrid, eftersom GNP tenderar att aggregera i lösningsmedel. När GNP aggregeras, ändras färgen på lösningen från rosa till lila (figur 1a). UV-Vis spektrofotometer är kunna identifiera ändringarna känsligare. Om den GNP/PKCi inte sammanställs toppen av absorption bör vara på 525 nm (figur 1b). Om BNP aggregeras, att toppen av absorption skift...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles at JoVE.com

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Vi har tidigare använt en guld nanopartiklar peptid hybrid intravenöst leverera en syntetisk peptid, C-delta proteinkinashämmare, vilket minskade ischemi-reperfusion-inducerad akut lungskada. Här visar vi det detaljerade protokollet av drogen formuleringen. Andra intracellulära peptider kan formuleras på samma sätt.

Protein Kinase C-delta hämmare peptid Formula använder Guldnanopartiklar

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Vårt unika drug delivery system, som använder 20 nanometer guldpartiklar i två specifika korta peptider, kan stabilisera guld nano partiklar i fysiologisk lösning och förbättra dess cellulära upptag, och därmed effektivt leverera peptid-baserade eller andra läkemedel i celler. Vår GNP peptid hybrid är lätt att syntetisera och stabil. Genom att använda guld nanopartikel peptid hybrid som läkemedelsbärare, vi kan överföra peptid läkemedel i cellerna effektivt och i överflöd.Vi behandlade ischemi-reperfusion skada i lungorna med vår GNP/PKCi hybrid. GNP ger PKC-hämmare peptider i cytoplasman. Denna leveransmetod kunde minska mer allvarlig lungskada med hjälp av en lägre dos av PKCi än andra leveransmetoder.Till att börja detta förfarande, hämta peptiderna från en frys vid minus 20 grader Celsius, och tina dem i rumstemperatur. Använd en mikrovåg för att väga 0,01 gram av varje tinad peptid, och överför varje peptid till ett separat koniskt rör på 50 milliliter. Tillsätt 18,74 milliliter avjoniserat vatten till P2-röret, och 16,93 milliliter avjoniserat vatten till P4-röret.Tillsätt 8,21 milliliter av 50%acetonitril utspädd i avjoniserat vatten till PKC delta inhibitorröret. Virvel peptidlösningarna kort. Placera sedan rören i en soniker på 40 megahertz i fem minuter.Efter detta överför du lösningarna till ett biosäkerhetsskåp. Det är kritiskt att sätta 50 mL koniska röret i en sonicator i fem minuter. Om det här steget hoppas över kommer GNP/PKCi att bilda aggregeringar.Överför en milliliter av varje peptidlösning till sitt egna nya koniska rör på 50 milliliter. Tillsätt 19 milliliter avjoniserat vatten till de rör som innehåller P2 och P4. Och tillsätt 19 milliliter av 50%acetonitril till röret som innehåller PKC delta inhibitor. Tillsätt 475 milliliter av P2-lösningen, 25 mikroliter av P4-lösningen, 500 mikroliter av PKC delta inhibitorlösning till ett 15 milliliterrör.Tillsätt sedan nio milliliter av en 20 nanometer-GNP-lösning till samma rör. Ta bort den kombinerade lösningen från biosäkerhetsskåpet och linda in röret i aluminiumfolie. Placera röret på en shaker över natten.Nästa dag, lämna tillbaka proverna till biosäkerhetsskåpet. Överför en milliliter alikvoter av GNP/PKCi-lösningen till 1,5 milliliter mikrorör. Centrifugera mikrorören vid en mikrocentrifug vid 15294 gånger g och vid fyra grader Celsius i 30 minuter.Överför tillbaka mikrorören till biosäkerhetsskåpet, och ta bort supernatenten från varje rör, samtidigt som man ser till att GNP-pelleten inte störs. Resuspend varje pellet i önskat lösningsmedel enligt den koncentration som krävs. För att bedöma BNI/PKCi hybridlösligheten häller du 0,5 milliliter av BNI/PKCi-lösningen i en periodiserad cuvette.Placera cuvette på en UV-Vis spektrometer och testa toppabsorptionen. I denna studie, proteinkinas C-delta-hämmare är konjugerad med guld nanopartiklar för att bilda en GNP / PKCi hybrid. Försiktighet måste tas med att utvärdera hybridens biofysiska egenskaper, eftersom guldnanopartiklar tenderar att aggregera i ett lösningsmedel.När nanopartiklarna aggregat, kommer färgen på lösningen ändras från rosa till lila. Proverna analyseras med en UV-Vis spektrofotometer som kan upptäcka med en hög grad av känslighet. Om hybriden inte aggregeras bör toppen av en absorption vara vid 525 nanometer.Om BNI aggregeras kommer absorptionstoppen att flyttas åt höger. Som kan ses, när aggregat har bildats, den delta optiska densiteten minskar. Vid utformningen av GNP peptid hybrider, är det viktigt att komma ihåg förhållandet mellan peptider till GNP-lösning bör vara en till nio.Denna BNI/PKCi-formula kan användas för ischemi-reperfusionsskada i andra organsystem än lungan. Eventuella peptider kan fästa på GNP om dessa peptider har en cystein rester vid N-ändstationen. Detta innebär ATT GNP peptid hybrid kan användas för att transportera andra peptid läkemedel i cellen.Rationellt utformade peptider är ny teknik som kan föra specifika protein-protein interaktion inuti dessa celler. Denna teknik, som utvecklats här, kan användas för leverans av nya peptidläkemedel eller för modifierade versioner av befintliga läkemedel.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering av Diblock polymera nanopartiklar genom Nanoprecipitation Teknik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Syntes, församling, och karakterisering av monolager skyddade guld nanopartiklar Films för protein monolager Elektrokemi

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Analys av riktad virala protein Nanopartiklar levereras till HER2 + tumörer

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Microfabrication av nanoporösa Guld Mönster för Cell-material interaktionsstudier

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmerings stamceller i terapeutiska Angiogenes använda biologiskt nedbrytbara polymera nanopartiklar

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartiklar för regenerativ forskning

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Korrelat Ljus- och elektronmikroskopi Använda Quantum Dot Nanopartiklar

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Ytan funktionalisering av hepatit E Virus nanopartiklar med kemiska konjugation metoder

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

I Vesiculo syntes av peptid membran prekursorer för autonoma vesikler tillväxt

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Produktion av E. coli-uttryckt Självassemblerande Proteinnanopartiklar för vacciner som kräver trimeric Epitope presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...