Name: an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience at JoVE.com

تمويل من "صندوق العلوم النمساوية"، FWF، المشروع رقم B27 29370 ف

<ol>
	<li>Howard, V., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , (1998).</li><li>Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-changes+of+brain+synapses+and+synaptic+plasticity+in+response+to+an+enriched+environment.">Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment.</a> Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).</li><li>Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+in+adult+barrel+cortex+following+naturalistic+environmental+enrichment.">Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment.</a> Neuroscience. 199, 143-152 (2011).</li><li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+unbiased+counting+method+for+the+quantification+of+synapses+in+the+mouse+brain.">A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).</li><li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+induces+behavioural+disturbances+in+neuropeptide+Y+knockout+mice.">Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice.</a> Scientific Report. 6, 28182 (2016).</li><li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Tissue+Samples+from+the+Placenta:+An+Illustration+of+Principles+and+Strategies.">Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies.</a> Placenta. 29, 1-14 (2008).</li><li>Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Golgi+structure+using+EM:+combing+volume-SEM+and+stereology+for+higher+throughput.">Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput.</a> Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).</li><li>Lewis, P. R., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Staining Methods for Sectioned Material. , (1988).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice.">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li><li>Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+induces+synaptic+structural+modification+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats.">Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).</li><li>Lonetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+environmental+enrichment+moderates+the+behavioral+and+synaptic+phenotype+of+MeCP2+null+mice.">Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice.</a> Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

سير العمل المقدمة هنا يسمح للباحث للحصول على البيانات على ميزات ultrastructural بطريقة غير متحيزة. وهذا وقتاً أقل بكثير من حجم التحقيقات من مقاطع المسلسل. وتستخدم العديد من التطبيقات المختلفة لتحقيق هذا الهدف. في البداية، برنامجنا RPS مصنوعة خصيصا (للاطلاع على تفاصيل بشأن توافر، الرجاء الاتصال بكاتب المقابلة) ويستخدم لإدخال تحولاً مرحلة عشوائية لتحديد إحداثيات المنطقة أخذ العينات. وهذا ما يسمح عينة عشوائية منهجية موحدة للعائد على الاستثمار. المقبل، لعد هياكل محددة، نحن تكييف طريقة ديسيكتور، حيث مقارنة المقاطع على التوالي 2 مع المسافة المعروفة، بطريقة رواية مقارنة بالدراسات السابقة13،،من1415 كما كنا نحن البرمجيات RPS مصنوعة خصيصا لمنهجية موحدة عينة عشوائية. وهذا يوفر الوقت بالمقارنة مع 3D تعمير وحدات تخزين كاملة من مقاطع المسلسل. على وجه التحديد هو تطوير هذا البرنامج RPS مصنوعة خصيصا لنوع واحد من المجهر الذي يعتبر عاملاً مقيداً لاستنساخ سير العمل. بديل من هذا البرنامج محددة سيكون تطبيق الذي يسمح البرمجة النصية وهو متوافق مع نماذج أخرى المجهر.
أننا استخدمت بنجاح هذا النهج لأن الدراسات المقارنة4،5. في أقسام رقيقة جداً من الأنسجة العصبية، كان مجال الاهتمام والصور التي اتخذتها المنتظمة عينة عشوائية موحدة في هذا المجال. قد تجدر الإشارة إلى أن مجال الاهتمام، طبقة polymorph المغزلي المسنن، منطقة صغيرة بدلاً من ذلك التحقيق الذي قد يكون مفيداً للنهج الذي نتبعه. داخل ديسيكتور موضوعة عشوائياً، يمكننا تقييم عدد DCV والعديد من الميزات ultrastructural من نقاط الاشتباك العصبي في دجبل الفئران الكبار يوجد في سراج الدين وهه فضلا عن وزن البالغين الفئران مقابل الفئران خروج المغلوب نبي الكبار. باستخدام النهج الذي نتبعه، أظهرت البيانات التي تم جمعها تغييرات في بعض المعلمات التحقيق. وأكدت هذه النتائج تلك من دراسات أخرى مماثلة في الحيوانات الأحداث2.
عيوب استخدام تجريبي لسير العمل هذا قد يكون أن هذا المتعددة application النهج ليس مثاليا من حيث سهولة الاستخدام، المستخدمين بحاجة للحصول على راحة مع واجهات المستخدم مختلفة (في حالتنا، واجهة المستخدم، و "قسم المسلسل تيم" ، RPS البرمجيات، والبرمجيات سيرياليم). تعلم كيفية التعامل مع جميع الطلبات بطريقة فعالة هو مضيعة للوقت وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. ومع ذلك، استثمار الوقت في تعلم كيفية استخدام سير العمل هذا لا تزال وضوح مواتية مع مرور الوقت اللازم لتحليل وحدات التخزين كله مع قسم المسلسل تيم. طريقة استخدام ديسيكتور بمنهجية أخذ العينات العشوائية موحدة في مجال الاهتمام كافية لتقديم بيانات موثوقة1 دون الحاجة إلى التحقيق على كمية عالية من الأقسام/وحدة التخزين.
لتحقيق أقصى قدر من النتائج في دراساتنا، من الضروري اتخاذ الرعاية الجيدة أثناء إعداد عينة، كالحفاظ على الأنسجة والهياكل ليست فقط أمرا حاسما لتقييم السمات الهيكلية، بل أيضا لتحديد مجال الاهتمام لا لبس فيه. عاملاً محوريا، وعيب آخر ربما كان هذا الأسلوب، أن جودة عالية لأزواج مقاطع رقيقة جداً مطلوب: يجب أن يكون هناك لا ثقوب أو التجاعيد التي تغطي المنطقة الخاضعة للتحقيق في أي من الأقسام، ويجب أن يكون سمك الفرع تحتفظ متجانسة. الباحث يجب أن يكون المدربين تدريبا جيدا في أولتراميكروتومي. أيضا الرعاية التي يجب اتخاذها عند تصوير المقاطع في ال، كما المقاطع حساسة لأضرار شعاع الإلكترون ويمكن أن تمزق بسهولة. وعلاوة على ذلك، من المهم أن تختار العدد الصحيح من مناطق أخذ العينات في العائد على الاستثمار. وقد تكبير ميكروجرافس إلكترون تبعاً لهدف التجريبية، يحدد بدقة. لتجاربنا على وجه التحديد، عد نقاط الاشتباك العصبي في الجهاز العصبي المركزي، 20 المناطق ذات الاهتمام في مقطع واحد مع مجال 30.25 ميكرومتر2 الأمثل. فإنه ينصح تدريب جيد في الاعتراف بالميزات المذكورة (في حالة الاشتباكات العصبية وميزات متشابك و DCV) للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. الحويصلات متشابك بغية تحديد نقاط الاشتباك العصبي، يجب أن تكون قابلة للتحديد، وهذا يتطلب قرارا من مالا يقل عن 10 نانومتر. لهذا، بير 5000 X الأمثل، ولكن يمكن ملاحظة أن التكبير يعتمد على معلمات الأجهزة مثل النوع والموقف من الكاميرات، وسيكون من الضروري تكييف أنواع المجهر و/أو كاميرا أخرى. كما أنه تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول يستخدم تطبيقات محددة لل واحد وأن يكون لدى المستخدمين مع نماذج أخرى للنظر في الاختلافات في برنامج الإعداد.
ونحن نعتقد أن لدينا سير العمل يمكن تكييفها للعديد من التطبيقات الأخرى ليس فقط في علم الأعصاب ولكن في مجال واسع من العلوم البيولوجية والعلوم المادية أيضا (عند الحاجة إلى دقة عالية) كلما كان السؤال البحثي يتطلب منهجية موحدة أخذ عينات عشوائية وكمية العينات لفحصها يسأل عن وسيلة فعالة لوقت للتحليل. على سبيل المثال، نحن مهتمون حاليا في إضفاء الطابع المحلي على مخازن الحديد في الدماغ البشري. لهذا، نحن تكيفت مؤخرا سير العمل لدينا، لتمكين تحليل عنصري على مقاطع رقيقة جداً في المناطق المختارة عشوائياً. من أجل تقليل عدد الطلبات اللازمة لسير العمل، ونحن تهدف إلى تطبيق باستخدام البرمجيات سيرياليم فقط، لأنه يمكن برمجتها للانتقال المرحلة المحددة مسبقاً النقاط التي يمكن تحديدها بطريقة عشوائية. قمنا بإنشاء برامج نصية مخصصة للتحكم ال، بهدف أوتوماتيزينج سير العمل تماما. أثبت ذلك عمليا باستثناء autofocusing في وضع التصوير التي تمت تصفيتها، والتي لم تسفر عن نتائج مرضية. وهكذا كنا البرمجيات مارك ألماني للتركيز، والحصول على الصور التي تمت تصفيتها الطاقة.
وباختصار، نحن نقدم حلول البرمجيات التي تساعد في الحصول على ميكروجرافس الإلكترون بطريقة غير متحيزة.

في المجهر الإلكتروني، أنها غالباً ما تشكل تحديا للعينة المناطق تمثيلاً داخل الأقسام. ونحن، كمراقب، غالباً ما متحيزة لإلقاء نظرة على مناطق محددة يسترعى انتباهنا بميزات واضحة للعينة، منع توزيعها جيدا وغير متحيز لأخذ عينات. أخذ العينات التحيز يمكن فقط تجنب إذا كان كل جزء من المنطقة لمصلحة يحصل على نفس الفرصة لينتهي بهم المطاف في صورة مجهرية إلكترون1. من الممكن تجنب التحيز أخذ العينات دون حل برمجيات، على سبيل المثال، عن طريق دفع trackball المجهر يدوياً دون النظر في الصورة، بغية تحديد مناطق أخذ العينات أينما توقف المرحلة. ولكن المعني الدقيق للكلمة، ويرجع عدم إجراء عشوائي، عمدا أو لا شعوريًا، المستخدم يمكن أن يكون لها تأثير على حركة المسرح، وعلاوة على ذلك، هذه ليست طريقة متطورة لتحديد مناطق أخذ العينات. أخذ عينات عشوائية يصبح أهمية خاصة في حالة استخدام أزواج من المقاطع لتقييم العدد الهياكل في حجم معين، على سبيل المثال، ستيريولوجي1، الأمر الذي يتطلب أزواج من المقاطع، مسافة معروفة وبصرف النظر. من الممكن أيضا ننظر فقط في قسم واحد وتقدير عدد2من هياكل محددة، ولكن مع هذا النهج المحققين يميلون إلى المغالاة في تقدير الكثافة العددية للهياكل الكبيرة، إذا لم تكن الهياكل صغيرة جداً في مقارنة سمك مقطع. هي نهج بديلة لإعادة بناء كميات من الأنسجة من مقاطع المسلسل وهكذا الحصول على البيانات المطلوبة3. ولكن هذا هو المستهلكة للوقت جداً وليس نهجاً عمليا للدراسات المقارنة (أكبر).
للتغلب على هذه المشاكل، قمنا بتطوير سير عمل الذي يسمح للباحث تلقائياً تحديد العينات للحصول على ميكروجرافس إلكترون في المباعدة بين الولادات العادية داخل أقسام رقيقة جداً. وموقف ميكروجرافس الإلكترون عشوائي، مما يتيح أخذ العينات غير متحيزة. والنهج مناسبة سواء بالنسبة لتحديد الكثافة العددية لهياكل (على سبيل المثال، نقاط الاشتباك العصبي داخل بعض نيوروبيل حجم4،5)، والأبعاد للسمات الهيكلية (على سبيل المثال، عرض المشقوق متشابك، أو القطر من4،بوستسينابتيك الكثافة5).
سير العمل يستخدم نقطة عشوائية مصنوعة خصيصا أخذ العينات (RPS) البرمجيات (كتب في جافا سكريبت استخدام البرمجيات البرمجة النصية المتوفرة مع لدينا المجهر) الذي يقوم تلقائياً بحساب مواقع الشبكة داخل منطقة محددة مسبقاً للفائدة في قسم رقيقة جداً. ينقل البرنامج RPS مرحلة المجهر الإلكتروني إلى هذه النقاط المحددة مسبقاً، حتى يمكن إجراء صورة مجهرية الإلكترون في كل نقطة. أولاً، تعريف المستخدم منطقة الاهتمام داخل قسم رقيقة. بعد ذلك، يحسب البرنامج RPS مواقع الشبكة داخل هذه المنطقة. X/y إحداثيات المركز الأول يتم إنشاؤها عشوائياً، ويتم وضع الوظائف المتبقية على فترات منتظمة الشبكة فيما يتعلق بالمركز الأول. لأن كل جزء من المنطقة لمصلحة له نفس الفرصة ليجري بحثها، وهذا ما يسمح جمع الحد الأدنى من البيانات. ويسمى هذا النهج لأخذ العينات أيضا منهجية موحدة عينة عشوائية (انظر مراجع6،7 لمزيد من التفاصيل).
لتحديد الكثافة العددية للهياكل، ونحن نعمل مع أزواج من المقاطع عن بعضها مسافة معروفة. بعد الحصول على صورة مجهرية إلكترون من المقطع الأول في واحدة من مواقف محددة سلفا، "قسم المسلسل تيم" البرمجيات (جزء من المجموعة من البرامج المتوفرة مع المجهر الإلكتروني لدينا) ينتقل إلى النقطة المقابلة في القسم الثاني، ومن أجل الحصول صورة مجهرية إلكترون من موقع المقابلة. ويتكرر هذا لكل موقع في شبكة محددة سلفا. في نهجنا، يستخدم لحساب عدد الجسيمات في كل زوج من الإلكترونات ميكروجرافس8،9ديسيكتور. ديسيكتور يتكون من زوج من الإطارات العد، واحد لكل8،الباب9. تتحدد الكثافة العددية للكائنات فقط عد الكائنات المرئية على القسم الأول (أو قسم المراجع) ولكن ليس على القسم الثاني (أو قسم البحث). وهذا يسمح بتقدير الكثافة العددية للكائنات ب طريقة سريعة وفعالة8،9. بالإضافة إلى ذلك على أبواب واحدة، يمكن قياس السمات الهيكلية ثنائي الأبعاد.
وقد طبقنا سير العمل هذا بنجاح لتقييم الاختلافات في الأرقام المشبك في الحصين الفئران المعرضة إلى بيئة المخصب (EE) مقارنة ببيئة القياسية (SE) الإسكان شروط4،5، ظروف السكن وأيضا تقييم الاختلافات ultrastructural بين نوع البرية (WT) الفئران والفئران neuropeptide Y (نبي) كو أبقى تحت سراج الدين وهه5. وكان هدفنا إلقاء نظرة على وجه التحديد على السمات الهيكلية للخلايا العصبية، مثل الكثافة العددية متشابك، الأطوال من منطقة نشطة في المقاطع العرضية وكثافة بوستسينابتيك، وعرض المشقوق متشابك، والعدد من الحويصلات متشابك، من أجل تقييم التغييرات في اتصال الخلايا العصبية وتنشيط بين ظروف تجريبية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، نحن مهتمون في الكثافة العددية من حويصلات كثيفة الأساسية (DCV) في الخلايا العصبية لتحديد مقدار neuropeptides المخزنة في منطقة معينة في الدماغ.
استناداً إلى نجاح النهج الذي نتبعه للدراسات المذكورة أعلاه، في خطوتنا القادمة، أننا قد تكيفت لدينا سير العمل لتحديد مجالات لإجراء تحاليل عنصري غير متحيز داخل عينات المخ البشري. وقد تم ذلك بصورة الحديد، التي يتم تخزينها في جزيئات فيريتين في كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. لهذا، نحن ترجمة البرنامج نصي الذي يسمح لنا بأتمتة معظم العمليات لعملية فحص عشوائي لأقسام الدماغ في منطقة محددة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:611px;" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Pentobarbital</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:135px;">P3761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutardialdehyde</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 16210</td>
			<td>25%; 100ml; EM grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cacodylate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C4945</td>
			<td style="width:167px;">250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thionine acetate/Ceristain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>861340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1000631000</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1064951000</td>
			<td>1 kg, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">osmium tetraoxide</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 19110</td>
			<td>10x1g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TAAB embedding resin</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAT001</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DMP-30</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD024</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DDSA</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD025</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>19481</td>
			<td>depleted, 25g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Ultrastain 2</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td>Lead citrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Toluidine blue solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td>10g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pioloform</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1275</td>
			<td>10g Powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proylenoxide</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>82320-1L</td>
			<td>1L</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;">DPX embedding medium</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1320</td>
			<td style="width:167px;">embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vibratome, Leica VT 1000</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Leica Ultracut UCT, ultramicrotom</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tecnai G2 20</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Megaview wide angle camera</td>
			<td>Olympus Soft Imaging Solution, M&#252;nster, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">US 1000 digital camera</td>
			<td>Gatan, Pleasanton, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEM Imaging Analysis Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FEI Serial Section Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiji, ImageJ 1.52e</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPSS 20.0</td>
			<td>SPSS Inc., Chicago, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SerialEM</td>
			<td>Regents of the University of Colorado</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPS (random point sampling) software 0.9a</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disector v1.0.2 (ImageJ macro)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EFTEMSerialEM (SerialEM script)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience

تحقيقات الميزات ultrastructural من الخلايا العصبية وهذه الاشتباكات العصبية الوحيدة الممكنة مع الميكروسكوب الإلكتروني. خاصة بالنسبة للدراسات المقارنة للتغيرات في كثافة وتوزيع هذه الميزات، على بروتوكول أخذ عينات غير منحازة أمر حيوي لنتائج يمكن الاعتماد عليها. نقدم هنا، سير عمل للحصول على صورة عينات المخ. سير العمل يسمح منهجية موحدة عينة عشوائية داخل منطقة محددة من الدماغ، ويمكن تحليل الصور باستخدام ديسيكتور. هذا الأسلوب هو أسرع بكثير من دراسة مستفيضة لمقاطع المسلسل ولكن لا يزال يقدم نهجاً عمليا لتقدير كثافة وتوزيعات من ميزات أولتراستروكتوري. قبل الدمج، استخدمت أقسام فيبرتوم الملون كمرجع لتحديد منطقة الدماغ قيد التحقيق، الذي ساعد في تسريع إعداد العينة الإجمالية عملية. تم استخدام هذا النهج للدراسات المقارنة للتحقيق في تأثير بيئة الإسكان أثرت على العديد من المعلمات ultrastructural في الدماغ الماوس. استناداً إلى الاستخدام الناجح لسير العمل، يمكننا تكييفه غرض عنصري تحليل العينات الدماغ. نحن الأمثل في البروتوكول من حيث الوقت لتفاعل المستخدم. أتمتة جميع الخطوات التي تستغرق وقتاً طويلاً بترجمة البرنامج نصي لبرمجيات المصدر المفتوح سيرياليم تساعد المستخدم على التركيز على العمل الرئيسي للحصول على خرائط عنصري. كما هو الحال في سير العمل الأصلي، ونحن اهتماما للنهج الذي أخذ العينات غير منحازة لضمان نتائج موثوقة.

هنا، يمكننا وصف سير عمل لتحديد المجالات لل بطريقة تلقائية وغير متحيزة. المستخدم يقوم بتحديد مجال الاهتمام داخل قسم رقيقة جداً تحت ال، ويستخدم عدة حلول البرمجيات الخاصة بسير العمل بما في ذلك برنامجنا RPS تلقائياً بحساب إحداثيات مناطق أخذ العينات 20 داخل منطقة الفائدة. ثم، يتم نقل المرحلة تيم لكل مجال أخذ العينات للتصوير الفوتوغرافي. وهذا ممكن لتحليل المقاطع واحد ولتحليل أزواج من المقاطع، مسافة معروفة عن بعضها البعض، مما يسمح لتحديد مجالات للتصوير بدون التحيز للمحقق.
يقوم سير العمل هذا أثبتت قيمتها عند توثيق ملامح ultrastructural في الماوس الدماغ المقاطع4،5. في هذه الدراسات، تم بحث طبقة الخلية polymorph المغزلي المسنن (دجبل) كمجال يحظى باهتمام. لدينا طريقة أثبتت أنها مناسبة لدراسة الإدارة العامة، لأنه يناسب قسم الاكليلية من المديرية العامة الظهرية (بريجما −1.3) في قسم رقيقة جداً وسهولة يعترف الخطوط العريضة في تضخم منخفض. إذا كانت مناطق الدماغ الأخرى التي سينظر فيها، سيكون من المهم للتأكد من حجمها ومميزات قبل التخطيط للتجارب.
تطبيق سير العمل الموضحة هنا أظهرت أن الإسكان هة يزيد عرض المشقوق متشابك إلى حد كبير في دجبل4، فيما يتعلق بظروف السكن القياسية. وعلاوة على ذلك، انخفض عدد الحويصلات الأساسية كثيفة كان إلى حد كبير في إيواء هة الحيوانات4، مما يشير إلى أن التغيرات في الأسرة معيشية neuropeptides. عند الفئران خروج المغلوب WT ونبي أبقى تحت ظروف هة، زاد عدد الخلايا العصبية/µm³ في دجبل بينما انخفضت كثافة DCV فيما يتعلق بالإسكان SE5. على النقيض من ذلك، أدت إلى خروج المغلوب نبي زيادة كبيرة من حويصلات متشابك في تجمع الاحتياطي (حويصلات متشابك undocked) مستقلة للإسكان شروط5. وانعكس أثر هة على عرض المشقوق متشابك في المجموعة "نبي كو" أدى إلى اختلاف كبير بين إيواء هة WT ونبي كو الفئران5. وهذا يدل دور حاسم لنبي لآثار العصبية الحيوية هة5الحيوانات خروج المغلوب عقدت تحت كلا النوعين من ظروف السكن، جنبا إلى جنب مع الدراسات السلوكية WT ونبي.
لتصور الحديد المخزنة في الدماغ البشري، تم تصنيف البرنامج نصي لبرنامج سيرياليم لاختيار عشوائي النقاط لاقتناء من داخل مقطع كله سامسونج، بهدف الحصول على طاقة التي تمت تصفيتها صورة مجهرية الإلكترون في كل نقطة من هذه النقاط . بعد تحميل المقطع في المجهر الإلكتروني، يقوم البرنامج النصي تثبيت المقطع (أي.، روتين 'العينة الطبخ') بين عشية وضحاها. البرنامج النصي ثم عشوائياً على عدد من النقاط المحددة مسبقاً من قبل المستخدم من تلك التي تحمل [غرتينغ] في الشكل 3. المنتجة صورة مجهرية اختبار والتحقق من مستويات الرمادي، فحص البرنامج النصي إذا النقاط المختارة التي كانت تقع على هي جزء واضح من المقطع، رفض النقاط التي سقطت على قضبان الشبكة. كان معالجة معظم سير العمل بواسطة البرنامج النصي مع الحد الأدنى من التفاعل للمستخدم. بيد أنه لم يتسن تلقائياً تسجيل ميكروجرافس الطاقة التي تمت تصفيتها (مع هذا الإعداد)، كما كان هناك أيضا القليل من الضوء لروتين اوتوفوكس من سيرياليم. ولذلك، نحن تحولت إلى البرمجيات مارك ألماني أقرب البرنامج النصي انتقلت المرحلة لكل نقطة، وضبط التركيز من جهة، وقدمت صورة افتيم من الحديد. ويرد مثال لصورة حديد افتيم من تشريح الدماغ البشري في الشكل 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> الشكل 1. التوضيح لسير العمل. (أ) تظهر الخطوات الرئيسية لإعداد نموذج (في اتجاه السهم): أقسام فيبرتوم (ط)، embedding(ii)، قطع المقاطع شبه رقيقة ورقيقة جداً (ثالثا)، واصطياد أزواج من المقاطع رقيقة جداً على شبكات النحاس (رابعا). (ب) استخدام مجهر المورد البرمجيات والبرمجيات RPS مصنوعة خصيصا لإنشاء إحداثيات المنطقة أخذ العينات التي تحدد مواقع التسجيل. يتم تخزين نقاط الزاوية من المقاطع في برنامج الفحص المجهري والعائد على الاستثمار هو مبين (المحددة بمساعدة الأقسام شبه رقيقة) (ط)؛ يتم إنشاء شبكة لأخذ عينات من المناطق عبر العائد على الاستثمار، وهو عرض تحولاً عشوائية (السهم الأحمر) في العاشر و y. وهذا التحول أصغر من المسافة بين مناطق أخذ العينات، (الأسهم السوداء)، حيث أنه بدلاً من المربعات السوداء، التي لا تحول، تستخدم مربعات زرقاء، الذي ينقل عشوائياً، لتحديد مواقع التسجيل (الثاني)؛ وتستخدم فقط أخذ العينات في المناطق داخل حدود العائد على الاستثمار (رسمها كمربعات الأسود والأزرق) للتسجيل. ميكروجرافس مصنوعة في المقطع مرجع (المربعات السوداء)، وفي المواقع المقابلة في المقطع البحث (المربعات الزرقاء) (ثالثا). (ج) تتم صورة مجهرية في كل مجال أخذ العينات في تكبير كافية؛ يتم إجراء مونتاج تتكون من العديد من الصور المدمجة إذا لزم الأمر (في هذه الحالة، تم دمج الصور معا 2 × 2) (ط)؛ إنشاء إطار العد وسيظهر كتراكب في الصورة، يتم حساب هياكل داخل الإطار، وعلى 'قبول خطوط' (خطوط الإطار متقطع)، لكن هؤلاء لا على 'خطوط المحرمة' (خطوط الإطار الصلبة) (ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> الشكل 2 . قياس البارامترات ultrastructural على زوج من مقاطع رقيقة جداً مع إطار العد غير متحيزة. (أ) نظرة عامة على ويندوز إيماجيج المستخدمة لفرز وتحليل الهياكل الخلوية. يظهر الجانب الأيسر صورة مجهرية إلكترون مع الإطار عد كتراكب. في الجانب الأيسر: واجهة المستخدم إيماجيج (المستطيل الأزرق) من القائمة المنسدلة (أعلى) وشريط (أدناه)؛ محرر كائن أوبجيكتج (المستطيل الأخضر)؛ نافذة الأدوات أوبجيكتج (المستطيل البرتقالي) حيث يمكن تحديد الأدوات اللازمة لقياس وإطار النتائج أوبجيكتج (مستطيل أسود) حيث يتم توثيق جميع القياسات. (ب) التفاصيل من تظهر نهايات ملحوظة صورة مجهرية الإلكترون (نقاط الاشتباك العصبي في كلا القسمين-الأسهم؛ المشبك فقط في القسم البحث-رؤوس الأسهم). تلك التي تم وضع علامة عليها باستخدام الأداة متعددة (دائرة حمراء) من شريط الأدوات في إيماجيج. (ج) أسماء والمعلمات قياس السمات متشابك تم تعريفها باستخدام أدوات أوبجيكتج. اختيار أداة علامة والميزة من الفائدة ورسمها في الصورة اليسرى نقرات الماوس على طول البنية المخطط التفصيلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> الشكل 3. اختيار العينات المناطق للتعيين عنصري داخل عائد للطاقة التي تمت تصفيتها مجهر إلكتروني. يتم استخدام سيرياليم لتحديد طقة فائدة وتشير إلى عدد كبير من المناطق أخذ العينات في مسافة عادية (الصلبان الوردي في الصور A و B). البرنامج نصي ثم عشوائياً تحديد مناطق أخذ العينات (من هذه الإحداثيات المحددة مسبقاً) لاقتناء. يتم رفض مناطق أخذ العينات مع سوء الإضاءة لتجنب البارات الشبكة وتوقف البرنامج النصي حالما تم اختيار 20 أخذ العينات مضاءة جيدا المناطق داخل العائد على الاستثمار. (أ) نظرة عامة على منطقة بأكملها من الفائدة، حددها مضلع، مع عدد كبير من مناطق أخذ العينات الممكنة وضع علامة X. التفصيل A (ب) تبين مناطق أخذ العينات قبل اختيار عشوائي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> الشكل 4. مثال للحصول على خريطة عنصري (افتيم). (أ) مجال مشرق تيم صورة مجهرية من المنطقة المحيطة بالحصول على نقطة. منطقة تم اختيارها عشوائياً واستخدمت للحصول على مخطط عنصري ويتسم بمستطيل أسود. (ب) افتيم قبل حافة نافذة الصورة في منطقة تم اختيارها عشوائياً. (ج) افتيم ما بعد حافة نافذة الصورة في نفس المنطقة. (د) مخطط عنصري الحديد من نفس المنطقة (م-حافة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience at JoVE.com

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

نقدم سير عمل جديدة للتحقيقات الميكروسكوب الإلكتروني لانسجة المخ. الأسلوب الذي يسمح للمستخدم بدراسة ملامح العصبية بطريقة غير متحيزة. لتحليل عنصري، نقدم أيضا البرنامج نصي الذي أوتوماتيزيس معظم سير العمل لأخذ العينات العشوائية.

نهج غير منحازة لأخذ العينات الأقسام تيم في علم الأعصاب

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

بروتوكول أخذ العينات غير متحيزة أمر حيوي للمجهر الإلكترون. إذا كنت ترغب في قياسها على الكثافة العددية للتشابك أو الهياكل الأخرى في منطقة معينة من الدماغ، فإن الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنها غير متحيزة، وتمكن من إنتاج ميكروغرافيات إلكترونية تلقائيًا مع الحد الأدنى من تدخل المستخدم. هذه التقنية هي أيضا قيمة في مجالات بحثية أخرى، مثل علم الأعصاب، حيث يمكن استخدامها في تقييم قوة الشبكة العصبية.من أجل تطبيق بروتوكولنا، من الضروري أن يكون لديك خبرة في التقنيات المجهرية الإلكترونية، مثل إعداد العينة وتشغيل المجهر الإلكتروني الانتقالي. إثبات إجراءنا سيكون الدكتور ستيفان Wernitznig، بعد وثيقة من مختبري. يتكون هذا البروتوكول من إعداد عينات الدماغ للمجهر الإلكتروني، وقطع أزواج من أجزاء رقيقة.بعد ذلك، سوف يصف كيفية إنتاج عدد محدد من الإلكترونيات الدقيقة تلقائياً في منطقة ذات أهمية. ثم، فإنه سيتم استخدام إطار العد لتقييم الكثافة العددية للملامح الهيكلية. للبدء، تشريح، إصلاح، بعد الإصلاح، وتضمين عينات من الفائدة في الراتنج تضمين باتباع جنبا إلى جنب مع بروتوكول النص المصاحب.ثم، ضع العينة على استئصال فائق الشعر وإنتاج 55 نانومتر مقاطع تسلسلية رقيقة للغاية. وضع المقاطع على شبكة فتحة مع أبعاد ملليمتر واحد من اثنين ملليمتر، المغلفة مع شكل piola. ثم، قم باحتواء المقاطع الرقيقة جدًا على شبكات الفتحة باستخدام 2٪ من أسيتات أورانيل لمدة 30 دقيقة، متبوعة بسيترات الرصاص لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.ضع الشبكة في TEM وتفحص الأقسام على الشبكة باستخدام TEM باستخدام التكبير المنخفض لتوجيه وتقييم جودة المقاطع. ثم، بدء تشغيل البرنامج المقطع التسلسلي TEM، حدد المقطع واختر إدراج لإضافة نقاط الزاوية للمرجع والبحث القسم. اتبع التعليمات الخاصة بالإطار المنبثق.ابدأ بالمقطع المرجعي ثم تابع المقطع البحث. تأكد من أن حواف المقطع متوازية مع المقطع التالي، حيث يتم إدخال النقاط الأولى والنقاط اثنين. تصور بعد ذلك المقطع المرجعي تحت التكبير المنخفض لتحديد المنطقة ذات الاهتمام.نقل مرحلة المجهر باستخدام تحليل صورة TEM على قسم المرجع إلى نقاط الزاوية متعددة من العائد على الاستثمار لإنشاء مخطط لعائد الاستثمار. تسجيل إحداثيات المضلع الناتج باستخدام برنامج أخذ عينات نقطة عشوائية. لهذا، اضغط إضافة إحداثيات في مربع الحوار من برنامج أخذ عينات نقطة عشوائية عند كل نقطة من المضلع المطلوبة لتوضيح عائد الاستثمار في المقطع.بعد ذلك تحديد وإدخال حجم مناسب لمناطق أخذ العينات والمسافات بين المناطق في برنامج أخذ العينات نقطة عشوائية. ثم اضغط على حساب النقطية لتوليد إحداثيات بطريقة منهجية وموحدة وعشوائية لمواقف ميكروجراف داخل المضلع. تخزين نقاط أخذ العينات على قسمي المرجع والبحث، باستخدام برنامج "أخذ عينات نقطة عشوائية" وبرنامج المقطع التسلسلي TEM.هذه هي إحداثيات المونتاجات التي يتم تسجيلها بعد ذلك. في برنامج أخذ العينات نقطة عشوائية، اضغط على الانتقال إلى الموضع التالي لنقل مرحلة المجهر إلى س، إحداثيات ص من كل منطقة أخذ العينات في المقطع المرجعي. ثم حدد الموقع ثم اختر إدراج لاستيراد هذه الإحداثيات في برنامج المقطع التسلسلي TEM في المقطع المرجعي.كرر هذا لكافة الإحداثيات. لعكس الإحداثيات من مقطع المرجع إلى قسم البحث، حدد المقطع واختر الانتقال إلى المقطع. أدخل رقم مقطع البحث في نافذة الحوار.لتسجيل المونتاج، قم بالتبديل بين قسم المرجع والبحث، كما هو موضح من قبل، ثم قم بتغيير الموضع على المقطع المرجعي مع الموقع والانتقال إلى الرقم. اختر الإحداثي التالي في نافذة الحوار. للمونتاج SerialEM، في كل إحداثيات أخذ العينات، انتقل إلى ملف واختر المونتاج الجديد من القائمة المنسدلة.حدد العدد الصحيح من اللوحات والنسبة المئوية للتداخل في نافذة الحوار. بالنسبة لهذه الدراسة، فإن تكبير 5000 يكفي للتعرف على السمات المتشابكة على الدراسة. ولكن مجال محدود من عرض الكاميرا CCD المطلوبة جعل المونتاج من اثنين من الصور.يتم إجراء المونتاجات إلى SerialEM. قبل تسجيل كل مونتاج، قم بإعادة ضبط التركيز أو تنشيط خيار التركيز التلقائي في برنامج التسجيل. اختيار المجلد لحفظ ملف المونتاج وبدء تسجيل المونتاج عن طريق الضغط على ابدأ في القائمة الفرعية المونتاج ، على اليسار في SerialEM.بدء تشغيل microdissector وتحديد حجم إطار العد وعدد من القطع حسب الحاجة. حساب كثافة المشبك باستخدام ماكرو التشريح. باستخدام أداة متعددة النقاط الموجودة في شريط الأدوات، والحد من تلك نقاط الاشتباك العصبي التي تتقاطع مع خطين ممنوعين من تشريح، ولكن لا عد نقاط الاشتباك العصبي على خطوط القبول المعاكس.وضع علامة على كل المشبك داخل إطار العد الذي يكون مرئياً في قسم المرجع، ولكنه غير مرئي في قسم البحث، مع تحديد بيضاوي. لقياس المعلمات المشبك، حدد فقط نقاط الاشتباك العصبي مع شق متشابك المنحى في المقطع المقطع الذي هو على المقطع المرجعي. وينبغي أن يكون هذا ضمن إطارات الصور نفسها المستخدمة لتشريح.المقبل، انتقل إلى الإضافات ومن ثم لتحليل وبدء البرنامج المساعد ObjectJ من القائمة المنسدلة. فتح مشروع جديد من مربع الحوار المنسدل ObjectJ الذي سيفتح نافذة تسمح للمستخدم لتحديد الهياكل ووضع علامة باستخدام أداة العلامة. أولاً، استخدم أداة العلامة لقياس طول الغشاء قبل التشابك وطول الكثافة ما بعد متشابك عن طريق رسم خط على طول الهيكل.ثم، الحصول على متوسط عرض الشق متشابك عن طريق رسم مضلع، تغطي كل من الغشاء قبل وبعد متشابك. لتحديد عدد من الإرساء فياحل، عد جميع الحواشي التي لديها أقصى مسافة من الغشاء قبل متشابك من قطر واحد أو أقل من vesicle. ثم، تحديد عدد من vesicles غير مفكك عن طريق عد الفُيْضَيَّة مع مسافة قصوى من قطر واحد من رست أو غيرها من الفُيْيْسَة في نفس المشبك.تسمح نسخة مكيفة من البروتوكول بتحليلات عنصرية في مواقع تم الحصول عليها بشكل غير متحيز داخل القسم الرقيق للغاية. لهذا، في وضع التصوير TEM بدء SerialEM ثم فتح مشروع جديد. ثم، افتح المستكشف وتحقق من إعدادات الكاميرا في الكاميرا وضوابط البرنامج النصي للعرض وتسجيل وعرض ابدأ.لإنشاء خريطة زاوية للقسم فائقة الوضوح، اختر إضافة نقاط في نافذة المتصفح. ثم، تعيين نقاط الزاوية على حواف مقطع رقيقة جدا. نقل المرحلة إلى نقطة زاوية من خلال الضغط باستمرار على مفتاح الماوس الأيمن.عند الوصول إلى زاوية من القسم، أضف نقطة زاوية بنقرة ماوس يسرى. كرر الإجراء لإضافة ثلاث نقاط أخرى في الزاوية. تأكد من أن المربع C لنقاط الزاوية في نافذة Navigator، يتم تحديد النقاط المخزنة.لبدء المونتاج الزاوية، انتقل إلى Navigator في شريط قائمة SerialEM واختر مونتاج من قائمة مونتاج في ركن الإعداد من القائمة المنسدلة. اختر إضافة مضلع في نافذة Navigator وحدد المنطقة التي تهمك بنقرات الماوس اليمنى المتعددة. بعد ذلك، اختر إضافة شبكة من النقاط في القائمة المنسدلة المستكشف وحدد المسافة بين النقاط.بدء البرنامج النصي EFTEMSerialEM اتبع أوامر البرنامج النصي أدخل عدد نقاط الشبكة كما هو موضح في المستكشف وأدخل عدد نقاط الاكتساب. ثم قم بتعيين عتبة الإضاءة بحيث يمكن للبرنامج النصي تجنب أشرطة الشبكة. اتبع أوامر البرنامج النصي ونقل المرحلة يدويا لتغطية مجال العرض من قبل ربع شريط الشبكة.وفقًا للقيمة المعروضة، أدخل قيمة إضاءة العتبة التي تكون أعلى من القيمة المعروضة. انتظر حتى يتم تحديد نقاط للحصول على الطعام ويتم الانتهاء من روتين الطهي. هذا يستغرق وقتا طويلا ويمكن القيام به بين عشية وضحاها.بعد إعداد لتحليل عنصر TEM المصفى للطاقة، احصل على خريطة عنصرية مع إعدادات خاصة بعنصر معين. نهج أخذ العينات غير المتحيزة مفيد في عد وتحليل السمات المتشابكة في مناطق معينة من الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، يسمح البرنامج النصي EFTEMSerialEM لبرنامج SerialEM واحد عشوائياً اختيار نقاط الاستحواذ من داخل قسم كامل رقيقة جداً، بهدف الحصول على ميكروجراف الإلكترون تصفية الطاقة في كل من هذه النقاط.حدد البرنامج النصي بشكل عشوائي عددًا من النقاط، تم تحديدها مسبقًا من قبل المستخدم من تلك التي تم وضع علامة عليها مع التقدير. من خلال إنتاج ميكروجراف اختبار والتحقق من مستويات الصف، والتحقق من السيناريو إذا كانت النقاط المختارة كانت موجودة على جزء مرئي من القسم، ورفض النقاط التي هبطت على أشرطة الشبكة. تمت معالجة معظم سير العمل من خلال البرنامج النصي، مع الحد الأدنى من التفاعل للمستخدم.ومع ذلك، مع النموذج المعروض هنا، كان هناك ضوء قليلاً جداً روتين التركيز التلقائي من SerialEM. لذلك، بمجرد أن نقل السيناريو المرحلة إلى كل نقطة، تم تعديل التركيز وخريطة عنصرية مصنوعة من الحديد. ومن المهم أن يتم بعناية اختيار المنطقة موضع الاهتمام وضمان أن يقع نفس عدد نقاط أخذ العينات في كل مجال من مجالات الاهتمام.لا ننسى أن العديد من المواد الكيميائية المستخدمة لإعداد العينات هي سامة. لذا ارتدي معطف المختبر والقفازات الواقية و اعملي تحت غطاء الدخان

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

الحدث عالية الكثافة ذات الصلة الحصول على البيانات المحتملة في علم الأعصاب الإدراكي

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

نقرا الإسفار في الموقع التهجين في أقسام المخ طازجة

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

المورفومترية التحليلات من أقسام الشبكية

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker، نهجا مبتكرا لتحليل الآلي المحرك للعين

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

مدخل لتعزيز التوافق وتكون الميالين في ظهري الجذر العقدة العصبية

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em