Name: an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience at JoVE.com

Finansiert av prosjektnummeret østerrikske Science fondet, FWF, P 29370 B27

<ol>
	<li>Howard, V., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , (1998).</li><li>Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-changes+of+brain+synapses+and+synaptic+plasticity+in+response+to+an+enriched+environment.">Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment.</a> Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).</li><li>Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+in+adult+barrel+cortex+following+naturalistic+environmental+enrichment.">Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment.</a> Neuroscience. 199, 143-152 (2011).</li><li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+unbiased+counting+method+for+the+quantification+of+synapses+in+the+mouse+brain.">A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).</li><li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+induces+behavioural+disturbances+in+neuropeptide+Y+knockout+mice.">Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice.</a> Scientific Report. 6, 28182 (2016).</li><li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Tissue+Samples+from+the+Placenta:+An+Illustration+of+Principles+and+Strategies.">Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies.</a> Placenta. 29, 1-14 (2008).</li><li>Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Golgi+structure+using+EM:+combing+volume-SEM+and+stereology+for+higher+throughput.">Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput.</a> Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).</li><li>Lewis, P. R., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Staining Methods for Sectioned Material. , (1988).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice.">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li><li>Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+induces+synaptic+structural+modification+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats.">Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).</li><li>Lonetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+environmental+enrichment+moderates+the+behavioral+and+synaptic+phenotype+of+MeCP2+null+mice.">Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice.</a> Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Arbeidsflyten presenteres her gjør forskeren å få data om ultrastructural funksjoner på en objektiv måte. Dette er mye mindre tidkrevende enn volum undersøkelser fra føljetong deler. Flere forskjellige programmer brukes til å oppnå dette målet. Først brukes vår skreddersydde RPS -programvare (for detaljer om tilgjengelighet, vennligst kontakt tilsvarende forfatteren) til å introdusere en tilfeldig scenen-shift for å velge prøvetaking området koordinatene. Dette gir en systematisk uniform stikkprøvekontroll av Avkastningen. Deretter for telling av spesifikke strukturer, vi tilpasset metoden disector hvor 2 etterfølgende avsnittene med kjent distanse sammenlignes, i en ny måte i forhold til tidligere studier13,14,15 som vi brukte vår skreddersydd RPS programvare for systematisk uniform stikkprøvekontroll. Dette sparer tid i forhold til 3D-rekonstruere hele volumer fra føljetong deler. Skreddersydd RPS programvaren er spesielt utviklet for én type mikroskop som er en begrensende faktor for gjengivelse arbeidsflyten. Et alternativ fra denne bestemte programvare ville være et program som kan og er kompatibel med andre mikroskop modeller.
Vi benyttet ble denne tilnærmingen for våre komparative studier4,5. Ultra tynne snitt av neuronal vev, området av interesse ble skissert og bilder ble tatt av systematisk uniform stikkprøvekontroll innenfor dette området. Det må bemerkes at området av interesse, det polymorph laget av dentate gyrus, er et ganske lite område å undersøke som kan være gunstig for vår tilnærming. En tilfeldig plassert disector, vi vurdert antall DCV og flere ultrastructural funksjoner i synapser i DGpl av voksen mus ligger i SE og EE samt voksen WT mus versus voksen NPY knockout mus. De innsamlede dataene bruker vår tilnærming, og viste endringer i noen av parameterne undersøkt. Disse funnene bekreftet de fra andre lignende studier i juvenile dyr2.
En ulempe av eksperimentell bruk av arbeidsflyten kan være at denne multi-application-tilnærmingen ikke er ideell når det gjelder brukervennlighet, brukerne trenger å bli komfortabel med forskjellige brukergrensesnitt (i vårt tilfelle, brukergrensesnittet, TEM føljetong delen RPS programvaren og SerialEM programvare). Lære å håndtere alle programmer på en effektiv måte er tidkrevende og bør tas i betraktning. Investere tid i å lære å bruke denne arbeidsflyten er imidlertid fortsatt tydelig gunstige over tid som er nødvendig for å analysere hele volumer med føljetong delen TEM. Metoden med å bruke en disector plassert ved systematisk uniform stikkprøvekontroll i området rundt er tilstrekkelig å presentere pålitelige data1 uten behov for å undersøke en høy mengde deler/volum.
For å maksimere utfallet i våre studier, var det viktig å ta godt vare under eksempel forberedelse, som bevaring av vev og strukturer ikke er bare avgjørende for å vurdere strukturelle funksjoner, men også for å identifisere området av interesse entydig. En avgjørende faktor, og kanskje en annen ulempe med denne metoden er at det kreves høy kvalitet ultra tynne snitt parene: det må være noen hull eller rynker som dekker området under etterforskning i delene, og snittykkelsen må vedlikeholdt homogen. Forskeren må være godt trent på ultramicrotomy. Forsiktighet må også tas når imaging avsnittene i TEM, delene er følsomme for elektron strålen skade og kan lett rive fra hverandre. Videre er det viktig å velge riktig antall prøvetaking områder i Avkastningen. Avhengig av eksperimentelle målet har forstørrelsen av elektron micrographs angis nøye. For våre eksperimenter spesielt er teller synapser i sentralnervesystemet, 20 regioner av interesse på ett avsnitt med området 30.25 µm2 optimal. Det anbefales av personellet i erkjennelsen funksjonene i spørsmålet (i vårt tilfelle synapser, synaptic funksjoner og DCV) å få pålitelige resultater. Synaptiske blemmer må identifiseres for å identifisere synapser, og dette krever en oppløsning på minst 10 nm. For dette, en forstørrelse på 5000 X var optimal, men det må bemerkes at forstørrelsen avhengig av maskinvareparametere som typen og plasseringen av kameraer og måtte tilpasses for andre mikroskop og/eller kameraet. Det har også bemerkes at protokollen bruker programmer bestemt en TEM og at brukere med andre modeller må vurdere forskjellene i oppsettet.
Vi tror våre arbeidsflyt kan tilpasses for mange andre programmer ikke bare i nevrovitenskap, men i et bredt felt av biologiske vitenskap og materielle vitenskap (når den høye oppløsningen av en TEM er nødvendig) når problemstillingen krever en systematisk uniform tilfeldig prøvetaking og hvor å bli undersøkt ber om en tid effektiv måte analyse. For eksempel er vi for tiden interessert i å lokalisere jern-butikker i den menneskelige hjernen. For dette, har vi nylig tilpasset våre arbeidsflyten, slik at grunnleggende analyse på ultra tynne snitt i tilfeldig valgt områder. For å redusere antallet programmer som er nødvendig for arbeidsflyten, har vi som mål å bruke ved hjelp av SerialEM programvare, fordi det kan programmeres til å flytte scenen til forhåndsinnstilt som kan velges på en tilfeldig måte. Vi opprettet tilpassede skript for å kontrollere TEM, med sikte på automatizing arbeidsflyten helt. Dette viste seg mulig bortsett fra autofokusering i filtrert tenkelig modus, som ikke gir tilfredsstillende resultater. Vi brukte dermed DM programvare for fokusering og for å få energi-filtrert bilder.
I sammendraget presenterer vi programvareløsninger som hjelper i å skaffe elektron micrographs på en objektiv måte.

I elektronmikroskop er det ofte utfordrende å prøve representative områdene i delene. Vi, partisk som observatør, ofte for å se på bestemte områder trukket oppmerksomme av iøynefallende funksjoner av prøven, hindre et godt fordelt, upartiske utvalg. Prøvetaking skjevhet kan bare unngås hvis alle deler av regionen rundt får samme mulighet for å havne i en elektron mikroskop-bilde1. Det er mulig å unngå prøvetaking bias uten en programvareløsning, for eksempel ved å trykke styrekulen av mikroskopet manuelt uten å se på bildet, slik som å velge prøvetaking regioner hvor scenen stopper. Men dette er strengt tatt ikke en tilfeldig prosedyre, fordi, bevisst eller ubevisst, brukeren kan ha innflytelse på bevegelsen av scenen, og videre, dette er ikke en sofistikert måte for å velge prøvetaking regioner. Stikkprøvekontroll blir spesielt viktig hvis parene deler brukes til å vurdere hvor mange strukturer i et bestemt volum, for eksempel for stereology1, som krever par seksjoner, en kjent avstand. Det vil også være mulig å se bare på ett enkelt avsnitt og beregne antall spesifikke strukturer2, men med denne tilnærmingen etterforskere pleier å overvurdere numeriske tettheten av større strukturer, med mindre strukturer er svært små i sammenligning til snittykkelsen. Alternative tilnærminger er å rekonstruere volumer av føljetong deler og dermed få ønskede data3. Men dette er svært tidkrevende og ikke en mulig tilnærming for (større) komparative studier.
For å overvinne disse problemene, har vi utviklet en arbeidsflyt som gjør forskeren automatisk velge eksempler for å få elektron micrographs til regelmessig mellomrom i ultra tynne snitt. De elektron micrographs er tilfeldig, slik at upartiske prøvetaking. Tilnærmingen er egnet både for å fastslå numeriske tettheter av strukturer (for eksempel synapser innenfor et bestemt neuropil volum4,5), og dimensjonene på strukturelle funksjoner (for eksempel bredden på den synaptiske kløften, eller diameteren til postsynaptic tetthet4,5).
Arbeidsflyten bruker en skreddersydd tilfeldig punkt prøvetaking (RPS) programvare (skrevet i Java script bruker skripting-programvaren som følger med vår mikroskop) som automatisk beregner rutenettet stillinger innenfor et forhåndsdefinert område av interesse i en ultratynn del. RPS programvaren flytter scenen av elektronmikroskop til disse forhåndsdefinerte poeng, slik at et elektron mikroskop-bilde gjøres på hvert punkt. Først definerer du et område av interesse i delen tynn. Deretter beregner programmet RPS rutenettet stillinger i denne regionen. X / y koordinatene til første posisjon opprettes tilfeldig, og de gjenværende stillingene er plassert på regulært rutenett intervaller i forhold til første posisjon. Fordi alle deler av regionen rundt har samme sjanse til undersøkt, gir dette minimalt datainnsamling. Denne tilnærmingen av prøvetaking kalles også systematisk uniform stikkprøvekontroll (se referanser6,7 for mer informasjon).
For å bestemme de numeriske tettheter av strukturer, arbeider vi med parene deler som er en kjent avstand. Etter innhente et elektron mikroskop-bilde fra den første delen i en av de forutbestemte stillingene, flyttes TEM føljetong delen programvare (del av programvarepakken leveres med våre elektronmikroskop) til et tilsvarende punkt i den andre delen, for å få et elektron mikroskop-bilde av den tilsvarende plasseringen. Dette gjentas for hver plassering i forhåndsbestemte rutenettet. I vår tilnærming, en disector til å telle antall partikler i hvert par av elektron micrographs8,9. En disector består av et par counting rammer, én for hvert avsnitt8,9. Numerisk tettheten av objekter bestemmes bare telle objekter vises på den første delen (eller referansedelen) men ikke på den andre delen (eller oppslag delen). Kan beregne de numeriske tettheter av objekter i en rask og effektiv måte8,9. I tillegg på enkelt deler, kan todimensjonal strukturfunksjonene måles.
Vi har brukt denne arbeidsflyten klarer å vurdere forskjeller i synapse tall prefiks mus utsatt for berike omgivelsene (EE) boliger forhold sammenlignet med standard miljø (SE) boliger forhold4,5, og også for å evaluere ultrastructural forskjellene mellom wild type (WT) mus og neuropeptide Y (NPY) KO mus holdt under SE og EE5. Målet vårt var å se spesielt på strukturelle funksjoner av neurons, som numeriske synaptic tetthet, lengdene av aktive sonen i tverrsnitt og postsynaptic tetthet, bredden på den synaptiske kløften og antall synaptic blemmer, for å vurdere endringer i neuronal tilkobling og aktivisering mellom forskjellige eksperimentelle forhold. I tillegg var vi interessert i numerisk tettheten av tett kjerner blemmer (DCV) i neurons å bestemme mengden av lagrede neuropeptides i et bestemt område i hjernen.
Basert på suksessen til vår tilnærming for studiene beskrevet ovenfor, i vår neste trinnet har vi tilpasset vår arbeidsflyt for å merke områder for upartiske elementær analyser i menneskelige hjerne prøver. Dette ble gjort til bildet jern, som er lagret i ferritin molekyler i både neurons og gliacellene. For dette samlet vi et skript som tillot oss å automatisere det meste av driften for en tilfeldig screening-prosess av hjernen inndelinger i et definert område.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:611px;" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Pentobarbital</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:135px;">P3761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutardialdehyde</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 16210</td>
			<td>25%; 100ml; EM grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cacodylate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C4945</td>
			<td style="width:167px;">250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thionine acetate/Ceristain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>861340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1000631000</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1064951000</td>
			<td>1 kg, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">osmium tetraoxide</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 19110</td>
			<td>10x1g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TAAB embedding resin</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAT001</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DMP-30</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD024</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DDSA</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD025</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>19481</td>
			<td>depleted, 25g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Ultrastain 2</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td>Lead citrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Toluidine blue solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td>10g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pioloform</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1275</td>
			<td>10g Powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proylenoxide</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>82320-1L</td>
			<td>1L</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;">DPX embedding medium</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1320</td>
			<td style="width:167px;">embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vibratome, Leica VT 1000</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Leica Ultracut UCT, ultramicrotom</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tecnai G2 20</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Megaview wide angle camera</td>
			<td>Olympus Soft Imaging Solution, M&#252;nster, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">US 1000 digital camera</td>
			<td>Gatan, Pleasanton, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEM Imaging Analysis Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FEI Serial Section Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiji, ImageJ 1.52e</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPSS 20.0</td>
			<td>SPSS Inc., Chicago, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SerialEM</td>
			<td>Regents of the University of Colorado</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPS (random point sampling) software 0.9a</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disector v1.0.2 (ImageJ macro)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EFTEMSerialEM (SerialEM script)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience

Undersøkelser av ultrastructural funksjoner av nevroner og deres synapser er bare mulig med elektronmikroskop. Spesielt for komparative studier av endringene i tettheter og distribusjoner av slike funksjoner er en upartisk prøvetaking protokoll avgjørende for pålitelige resultater. Her presenterer vi en arbeidsflyt for bildeopptak av hjernen prøver. Arbeidsflyten kan systematisk uniform stikkprøvekontroll innenfor et definert hjernen område, og bildene kan analyseres ved hjelp av en disector. Denne teknikken er mye raskere enn omfattende undersøkelse av seriell deler, men fortsatt presenterer en mulig tilnærming for å beregne tettheter og distribusjoner ultrastructure funksjoner. Før embedding, ble farget vibratome deler brukt som referanse for å identifisere hjernen regionen under etterforskning, som hjalp fremskynde samlede prøven utarbeidelsen prosessen. Denne tilnærmingen ble brukt komparative studier undersøke effekten av en beriket-bolig miljøet på flere ultrastructural parametere i musen hjernen. Basert på vellykket bruk av arbeidsflyten, tilpasset vi det for grunnleggende analyse av hjernen prøver. Vi optimalisert protokollen i form av bruker-interaksjon. Automatisere alle tidkrevende skritt ved å samle et skript for åpen kildekode-programvare SerialEM hjelper brukeren å fokusere på det viktigste arbeidet for grunnleggende kart. Som opprinnelige arbeidsflyten betalt vi oppmerksomhet til upartisk prøvetaking tilnærming garantere pålitelige resultater.

Her beskriver vi en arbeidsflyt for å velge områdene for TEM i en automatisk og objektiv måte. Brukeren velger området av interesse i en ultratynn under TEM og bruker flere programvareløsninger for arbeidsflyten inkludert våre RPS programvare som automatisk beregner koordinatene til 20 prøvetaking områder innenfor området interesse. Deretter er TEM scenen flyttet til områdene prøvetaking for fotografering. Dette er mulig både for analysere enkelt deler og analysere par seksjoner, kjent avstand fra hverandre, som tillater å velge områder for imaging uten bias etterforsker.
Denne arbeidsflyten vist seg verdifulle når dokumentere ultrastructural funksjoner i musen hjernen deler4,5. I disse studiene, ble polymorph celle laget av dentate gyrus (DGpl) undersøkt som et område av interesse. Vår metode viste egnet for å undersøke DG, fordi en koronale del av det dorsal DG (Bregma −1.3) passer til en ultratynne delen og hans disposisjon blir lett gjenkjent på lav forstørrelse. Hvis andre områder av hjernen var undersøkes, ville det være viktig å sjekke deres størrelse og kjennetegn før du planlegger eksperimenter.
Bruke arbeidsflyten beskrevet her viste at EE bolig øker bredden på den synaptiske kløften betydelig i DGpl4, i forhold til standard boforhold. Videre ble antall tett kjernen blemmer betydelig redusert i holder til EE dyr4, som angir endringer i husholdningen til neuropeptides. Når WT og NPY knockout mus ble holdt under EE forhold, økt antall nevroner/µm³ i DGpl mens tettheten av DCV redusert i forhold til SE-bolig5. Derimot resulterte NPY knockout i en betydelig økning av synaptic blemmer i reservatet bassenget (frakoblet synaptic blemmer) uavhengig av boliger forhold5. Effekten av EE bredden på den synaptiske kløften ble reversert i gruppen NPY KO resulterer i en betydelig forskjell mellom EE plassert WT og NPY KO mus5. Tatt sammen med atferdsmessige studier av WT og NPY holdt knockout dyr under begge typer boforhold, angir en avgjørende rolle i NPY for nevrobiologiske virkningene av EE5.
For å visualisere jern lagret i hjernen, ble et skript kompilert for SerialEM programvare til tilfeldig poeng av oppkjøpet fra i en helt ultrathin del, med sikte på å skaffe en energi filtrert elektron mikroskop-bilde på hvert av disse punktene . Etter lasting delen i elektronmikroskop, skriptet utføres stabilisering av delen (dvs., 'prøven kjøkken' rutine) over natten. Skriptet deretter valgt tilfeldig et antall poeng forhåndsdefinerte av brukeren fra de merket med en rist i Figur 3. Ved å produsere en test mikroskop-bilde og sjekke sin gråtoner, sjekket skriptet hvis valgte punktene ble plassert på en synlig del av delen avvise punktene som landet på rutenettet barer. De fleste av arbeidsflyten ble utført av skriptet med minimal medvirkning av brukeren. Men var det ikke mulig å registrere automatisk energi filtrert micrographs (med dette oppsettet), som det var for lite lys for autofocus rutinemessige SerialEM. Derfor byttet vi til DM programvare så snart skriptet hadde flyttet scenen til hvert punkt justert fokus for hånd, og gjorde et EFTEM bilde av jern. Et eksempel for en EFTEM jern bilde fra post mortem menneskelige hjerne er vist i Figur 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> Figur 1. Illustrasjon av arbeidsflyten. (A) de viktigste trinnene for eksempel utarbeidelsen vises (i pilens retning): vibratome inndelinger (i), embedding(ii), kutte semi tynn og ultra-tynne deler (iii), og fange par ultra tynne snitt på kobber rutenett (iv). (B) bruk av både mikroskop leverandørens programvare og skreddersydde RPS programvare å lage prøvetaking området koordinater som bestemmer webområdene opptak. Hjørnepunkt delene lagres i mikroskopi programvaren og Avkastningen er skissert (identifisert ved hjelp av delene semi tynn) (i); et rutenett av prøvetakingen områder er generert over Avkastningen, en tilfeldig forskyvning (rød pil) er innført i x og y. Skiftet er mindre enn avstanden mellom prøvetaking områdene, (svart piler), slik at i stedet for de svarte firkantene, som har ingen SKIFT, blå rutene som flyttes tilfeldig, brukes til å fastsette webområdene opptak (ii); bare prøvetaking områder innenfor grensene til Avkastningen (trukket som svart og blå firkanter) brukes for opptak. Micrographs gjøres både i referansedelen (svarte firkanter) og tilsvarende steder i delen oppslag (blå ruter) (iii). (C) et mikroskop-bilde gjøres i hvert utvalg område på en tilstrekkelig forstørrelse; en montasje som består av flere flettede bilder gjøres om nødvendig (i dette tilfellet, 2 x 2 bilder ble flettet sammen) (i); en opptelling ramme genereres og vises som et overlegg i bildet, strukturer i rammen og på "aksept linjer' (stiplede rammen linjer) vil telles, men ikke de på"forbudt linjer' (solid ramme linjer) (ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> Figur 2 . Måle ultrastructural parametere på et par ultra tynne snitt med en upartisk counting ramme. (A) oversikt over ImageJ windows brukes for maskintelling og analysere cellulære strukturer. Venstre siden viser den elektron mikroskop-bilde med opptelling ramme som et overlegg. Høyre side: ImageJ brukergrensesnittet (blå rektangel) med det miste-ned menyen (øverst) og verktøylinjen (nedenfor); redigeringsprogrammet for ObjectJ (grønn rektangel); ObjectJ verktøy -vinduet (oransje rektangel) der du kan velge verktøy for måling og ObjectJ resultatvinduet (svart rektangel) hvor alle målingene er dokumentert. (B) detaljer en vises de merkede synapser på elektron mikroskop-bilde (synapser på begge deler - piler, synapse på oppslag delen-pilspisser). De er merket med multipunkt-verktøyet (rød sirkel) på verktøylinjen i ImageJ. (C) navn og måle parametere synaptic funksjonene er definert ved hjelp av ObjectJ verktøy. Markør-verktøyet og funksjonen av interesse er valgt og disposisjonen trukket i bildet av venstre-museklikk langs strukturen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> Figur 3. Velge prøvetaking områder for grunnleggende kartlegging i en avkastning for energi filtrert overføring elektronmikroskop. SerialEM brukes til å velge et område av interesse og foreslå et høyt antall prøvetaking områder på en regelmessig mellomrom (rosa krysser i bilder A og B). Et skript velger deretter tilfeldig prøvetaking områder (fra disse forhåndsdefinerte koordinater) for oppkjøpet. Prøvetaking områder med dårlig belysning forkastes for å unngå rutenettet barer og skriptet stopper 20 godt opplyst prøvetaking områder har blitt valgt i Avkastningen. (A) oversikt over hele området rundt, omgitt av en polygon, med et høyt antall mulige prøvetaking områder merket med X. (B) detaljer en viser prøvetaking områdene før tilfeldig utvalg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> Figur 4. Eksempel på grunnleggende kart (EFTEM) Kjøp. (A) lyse feltet TEM mikroskop-bilde av området rundt oppkjøpet punkt. En tilfeldig valgt området ble brukt til å få en grunnleggende kart og er merket med et svart rektangel. (B) EFTEM pre kanten vinduet bilde laget i tilfeldig valgte området. (C) EFTEM etter kanten vindu bildet på samme område. (D) grunnleggende kart over jern i samme området (M-edge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience at JoVE.com

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Introduserer vi en ny arbeidsflyt for elektronmikroskop undersøkelser av hjernevev. Metoden tillater brukeren å undersøke neuronal funksjoner på en objektiv måte. For grunnleggende analyse presenterer vi også et skript som automatisk de fleste av arbeidsflyten for randomisert prøvetaking.

Upartiske tilnærming av prøvetakingen TEM inndelinger i nevrovitenskap

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

En objektiv prøvetakingsprotokoll er avgjørende for elektronmikroskopi. Hvis du ønsker å kvantifisere det på numerisk tetthet av synapser eller andre strukturer i et bestemt hjerneområde, er den største fordelen med vår teknikk at den er objektiv, og gjør det mulig å automatisk produsere elektronmikrografer med minimal brukerintervensjon. Denne teknikken er også verdifull på andre forskningsområder, for eksempel nevrovitenskap, hvor den kan brukes til å vurdere styrken til et nevrale nettverk.For å kunne bruke protokollen vår, er det nødvendig å ha erfaring med elektronmikroskopiske teknikker, for eksempel prøveforberedelse og drift av et overgangselektronmikroskop. Å demonstrere vår prosedyre vil være Dr.Stefan Wernitznig, en post-doc fra laboratoriet mitt. Denne protokollen består av å forberede hjerneprøver for elektronmikroskopi, kutte par tynne seksjoner.Deretter vil den beskrive hvordan man automatisk produserer et definert antall elektronmikrografer i et interesseområde. Deretter vil den bruke en telleramme for å vurdere den numeriske tettheten av strukturelle funksjoner. For å begynne, dissekere, fikse, post-fix og bygge inn eksempler av interesse i å bygge inn harpiks ved å følge sammen med den medfølgende tekstprotokollen.Deretter plasserer du prøven på en ultramikrotom og produserer 55 nanometer ultra tynne serielle seksjoner. Plasser seksjonene på et sporgitter med dimensjonene på en millimeter med to millimeter, belagt med piolaform. Deretter motvirker du de ultratynne delene på sporgitteret ved hjelp av 2% uranylacetat i 30 minutter, etterfulgt av blysitrat i 30 sekunder ved romtemperatur.Plasser rutenettet i TEM og undersøke seksjonene på rutenettet med TEM ved hjelp av en lav forstørrelse for å orientere og evaluere kvaliteten på seksjonene. Deretter starter du TEM Serial Section-programvaren, velger Inndeling og velger Sett inn for å legge til hjørnepunktene for referanse- og oppslagsdelen. Følg instruksjonene i popup-vinduet.Start med referansedelen, og fortsett deretter med oppslagsdelen. Kontroller at kantene på inndelingen er parallelle med neste del, etter hvert som punkt én og to angis. Deretter visualiserer du referansedelen under lav forstørrelse for å identifisere interesseområdet.Flytt mikroskopstadiet ved hjelp av TEM-bildeanalyse i referansedelen til flere hjørnepunkter i avkastningen for å opprette en omriss av avkastningen. Registrer koordinatene til den resulterende polygonen ved hjelp av Random Point Sampling-programvaren. For dette trykker du Legg til koordinater i dialogboksen for Random Point Sampling-programvaren på hvert punkt i polygonet som er nødvendig for å skissere avkastningen i delen.Definer deretter og angi en passende størrelse for prøvetakingsområdene og avstandene mellom områdene i Random Point Sampling-programvaren. Trykk deretter på Beregn Raster for å generere koordinater på en systematisk, ensartet, tilfeldig måte for mikrografens posisjoner i polygonet. Lagre utvalgspunktene på referanse- og oppslagsdelene ved hjelp av Random Point Sampling-programvaren og TEM Serial Section-programvaren.Dette er koordinatene til montasjer som er registrert etterpå. I Random Point Sampling-programvaren trykker du på gå til neste posisjon for å flytte mikroskopstadiet til x, y-koordinatene for hvert prøvetakingsområde i referansedelen. Velg deretter Plassering og velg Sett inn for å importere disse koordinatene i TEM Serial Section-programvaren i referansedelen.Gjenta dette for alle koordinater. Hvis du vil speile koordinatene fra referansedelen til oppslagsdelen, velger du Inndeling og velger Gå til inndeling. Angi nummeret på oppslagsdelen i dialogvinduet.For opptak av montasjer, bytte mellom referanse og oppslag delen, som beskrevet før, og endre posisjonen på referansedelen med plassering og gå til nummer. Velg neste koordinat i dialogvinduet. For SerialEM-montasjer, ved hver prøvetakingskoordinat, går du til Fil og velger Ny Montasje fra rullegardinmenyen.Velg riktig antall fliser og overlappingsprosent i dialogvinduet. For den nåværende studien er en forstørrelse på 5000 tilstrekkelig til å gjenkjenne de synaptiske egenskapene på studien. Men det begrensede synsfeltet til CCD-kameraet krevde å lage montasjer av to av to bilder.Montasjeene er laget til SerialEM. Før du tar opp hver montasje, må du justere fokuset på nytt eller aktivere alternativet for automatisk fokus i opptaksprogramvaren. Velg mappen for å lagre montasjefilen og starte opptaket av montasjen ved å trykke Start i montasjeundermenyen til venstre i SerialEM.Start mikrodissector og definer størrelsen på tellerammen og antall segmenter etter behov. Telle synapse tettheten ved hjelp av dissector makroen. Ved hjelp av flerpunktsverktøyet som ligger på verktøylinjen, kan du begrense de synapsene som krysser hverandre med de to forbudte linjene i disseksjonen, men teller synapser på motsatte akseptlinjer.Merk hver synapse i tellerammen som er synlig i referansedelen, men ikke synlig i oppslagsdelen, med et ovalt utvalg. For måling av synapseparametere velger du bare synapsene med en synaptisk kløft orientert i tverrsnitt som er på referansedelen. Dette bør være innenfor de samme bilderammene som brukes for dissectoren.Deretter går du til Plugins og deretter til Analyser og start plugin ObjectJ fra rullegardinmenyen. Åpne et nytt prosjekt fra rullegardinlisten ObjectJ som åpner et vindu som gjør det mulig for brukeren å skissere og merke strukturer med markørverktøyet. Bruk først markørverktøyet til å måle lengden på den presynaptiske membranen og lengden på postsynaptisk tetthet ved å tegne en linje langs strukturen.Deretter får du den gjennomsnittlige bredden på den synaptiske kløften ved å tegne et polygon, som dekker både pre-og post-synaptisk membran. For å bestemme antall forankret vesikler, telle alle vesikler som har en maksimal avstand fra pre-synaptisk membran av en vesikkel diameter eller mindre. Deretter bestemmer du antall uforspånede vesikler ved å telle vesikler med en maksimal avstand på en vesikkeldiameter fra forankret eller andre forankret vesikler på samme synapse.En tilpasset versjon av protokollen tillater elementære analyser på objektivt oppnådde steder innenfor den ultratynne delen. For dette, i TEM bildebehandlingsmodus, start SerialEM og åpne et nytt prosjekt. Deretter åpner du Navigator og kontrollerer innstillingene for kameraet i kamera- og skriptkontroller for visning og opptak og startvisning.Hvis du vil lage et hjørnekart over den ultratynne delen, velger du Legg til punkter i Navigator-vinduet. Deretter angir du hjørnepunktene på kantene på en ultratynn seksjon. Flytt scenen til et hjørnepunkt ved å holde nede høyre musetast.Når et hjørne av inndelingen er nådd, legger du til et hjørnepunkt med et venstre museklikk. Gjenta fremgangsmåten for å legge til tre hjørnepunkter til. Kontroller at det er merket av for boksen C for hjørnepunkter i Navigator-vinduet for hjørnepunkter.Hvis du vil starte hjørnemontasjen, går du til Navigator i SerialEM-menylinjen og velger Montaging Grids og Setup Corner Montage fra rullegardinmenyen. Velg Legg til polygon i Navigator-vinduet, og disponer interesseområdet med flere høyreklikk. Deretter velger du Legg til rutenett av punkter i Navigator-rullegardinmenyen og definerer en avstand mellom punktene.Start EFTEMSerialEM-skriptet, følg skriptkommandoene, skriv inn antall rutenettpunkter som vist i navigatoren, og angi antall anskaffelsespunkter. Deretter angir du belysningsterskelen slik at skriptet kan unngå rutenett. Følg skriptkommandoene, og flytt fasen manuelt for å dekke visningsfeltet med en fjerdedel av rutenettet.I henhold til den viste verdien angir du en terskelbelysningsverdi som er høyere enn verdien som vises. Vent til poengene for anskaffelse er valgt og matlagingsrutinen er ferdig. Dette tar lang tid og kan gjøres over natten.Når du har konfigurert for energifiltrert TEM-elementanalyse, får du et elementkart med elementspesifikke innstillinger. Den objektive prøvetakingtilnærmingen er nyttig for å telle og analysere synaptiske egenskaper i bestemte hjerneregioner. I tillegg gjør EFTEMSerialEM-skriptet for SerialEM-programvaren det mulig å tilfeldig velge oppkjøpspunktene fra en hel ultratynn seksjon, med sikte på å få en energifiltrert elektronmikrograf på hvert av disse punktene.Skriptet valgte tilfeldig et antall punkter, forhåndsdefinert av brukeren fra de som er merket med en vurdering. Ved å produsere en testmikrograf og sjekke karakternivåene, sjekket skriptet om de valgte punktene var plassert på en synlig del av delen, og avviste punktene som landet på rutenettet. Mesteparten av arbeidsflyten ble håndtert av skriptet, med minimal samhandling av brukeren.Men med prøven vist her, var det for lite lys for autofokusrutinen til SerialEM. Derfor, så snart skriptet flyttet scenen til hvert punkt, ble fokuset justert og et elementært kart ble laget av jern. Det er viktig å nøye velge interesseområdet og for å sikre at samme antall utvalgspunkter faller inn i hvert interesseområde.Ikke glem at mange av kjemikaliene som brukes til prøveforberedelse er giftige. Så bruk en lab frakk og vernehansker og arbeid under et røykdeksel.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriske Analyser av netthinnens Seksjoner

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinvlerina: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approach to Measure Region spesifikke Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Påvisning av Axonally Lokalisert mRNAs i hjernedelene med høy oppløsning<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

I Vivo Functional Brain Imaging tilnærming basert på Bioluminescent Kalsium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

En tilnærming for å forbedre Justering og myelination av Dorsal Root ganglion nevroner

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektro Metode for opptak Intracellulær spenningsreaksjoner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptorer og interneurons til lys stimuli<em&gt; I Vivo</em