Name: an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience at JoVE.com

Финансируется номер проекта Австрийский фонд науки, FWF, P 29370 B27

<ol>
	<li>Howard, V., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , (1998).</li><li>Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-changes+of+brain+synapses+and+synaptic+plasticity+in+response+to+an+enriched+environment.">Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment.</a> Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).</li><li>Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+in+adult+barrel+cortex+following+naturalistic+environmental+enrichment.">Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment.</a> Neuroscience. 199, 143-152 (2011).</li><li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+unbiased+counting+method+for+the+quantification+of+synapses+in+the+mouse+brain.">A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).</li><li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+induces+behavioural+disturbances+in+neuropeptide+Y+knockout+mice.">Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice.</a> Scientific Report. 6, 28182 (2016).</li><li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Tissue+Samples+from+the+Placenta:+An+Illustration+of+Principles+and+Strategies.">Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies.</a> Placenta. 29, 1-14 (2008).</li><li>Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Golgi+structure+using+EM:+combing+volume-SEM+and+stereology+for+higher+throughput.">Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput.</a> Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).</li><li>Lewis, P. R., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Staining Methods for Sectioned Material. , (1988).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice.">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li><li>Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+induces+synaptic+structural+modification+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats.">Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).</li><li>Lonetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+environmental+enrichment+moderates+the+behavioral+and+synaptic+phenotype+of+MeCP2+null+mice.">Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice.</a> Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Исследователя для получения данных на ультраструктурные функции в непредвзятой манере позволяет рабочий процесс, представленные здесь. Это гораздо меньше времени, чем объем расследований из последовательных секций. Для достижения этой цели используются несколько различных приложений. Во-первых наше программное обеспечение на заказ RPS (для подробной информации о доступности, обращайтесь соответствующий автор) используется для ввести случайные этап shift, чтобы выбрать координаты области выборки. Это позволяет систематический единообразные случайной выборки ROI. Далее, для подсчета конкретных структур, мы адаптировали метод disector, где сравниваются 2 последовательных секций с известным расстоянием, Роман способом, по сравнению с предыдущих исследований13,14,15 , как мы использовали наш RPS специализированного программного обеспечения для систематический единообразные случайной выборки. Это экономит время по сравнению с 3D-реконструкции всего тома из последовательных секций. RPS программного обеспечения по индивидуальному заказу специально разработана для одного типа микроскопа, который является ограничивающим фактором для воспроизведения рабочего процесса. Альтернативой от этого конкретного программного обеспечения будет приложение, которое позволяет сценариев и совместимо с другими моделями микроскопа.
Мы успешно использовать этот подход для наших сравнительных исследований4,5. На ультра-тонких секций нейронной ткани изложенные области интересов и изображения были взяты систематический единообразные случайной выборки в этой области. Стоит отметить, что сфера интересов, превращение слое зубчатой извилины, является довольно небольшой площади для расследования, которые могут быть полезны для нашего подхода. В рамках случайно помещены disector мы оценивали количество DCV и несколько ультраструктурные особенности синапсов в DGpl взрослых мышей размещается в SE и EE, а также взрослых WT мышей против взрослых мышей NPY нокаут. Используя наш подход, собранные данные показали изменения в некоторых из исследуемых параметров. Эти выводы подтверждают те из других аналогичных исследований в отношении несовершеннолетних животных2.
Недостаток использования экспериментальной этого рабочего процесса может быть что это multi распыления подход не является идеальным с точки зрения удобства для пользователей, как пользователям нужно получить комфортно с различных интерфейсов (в нашем случае, Пользовательский интерфейс, ТЕА серийный секции RPS программного обеспечения и программного обеспечения SerialEM). Обучение для обработки всех приложений в эффективный способ много времени и должны быть приняты во внимание. Однако инвестировать время в научиться использовать этот рабочий процесс по-прежнему явно благоприятные во времени, которая необходима для анализа всего тома с последовательным секции ТЕА. Метод с использованием disector, размещенных систематический единообразные случайной выборки в области интересов достаточно представить достоверных данных1 без необходимости расследовать большое количество секций/тома.
Чтобы максимизировать результаты в наших исследованиях, жизненно важно принять хороший уход во время подготовки проб, как сохранение тканей и структур важно не только для оценки структурных особенностей, но и для определения области интересов однозначно. Решающим фактором и возможно еще один недостаток этого метода, является то, что высокое качество ультра-тонких секций пар требуется: там должно быть без отверстий или морщины, которые покрывают площадь под расследование в любой из разделов, и толщина среза должна быть поддерживал однородной. Исследователь должен быть хорошо подготовленных в ultramicrotomy. Уход за должно также приниматься при визуализации в подразделах ТЕА, как разделы чувствительны к электронно пучка повреждений и может легко разорвать. Кроме того важно выбрать правильный количество проб областей в ROI. В зависимости от экспериментальной целью увеличение микроскопии электрон должен быть установлен тщательно. Для наших экспериментов конкретно, считая синапсов в центральной нервной системе, 20 регионов интерес на одном участке площадью 30.25 мкм2 являются оптимальными. Рекомендуется для подготовки персонала в признавая особенности в вопросе (в нашем случае синапсы, синаптических особенности и DCV), чтобы получить надежные результаты. С целью выявления синапсы, синаптических пузырьков должны быть идентифицированы, и это требует резолюция по крайней мере 10 Нм. Для этого увеличение 5000 X была оптимальной, но он должен отметить, что масштаб зависит от аппаратных параметров, таких как тип и положение камеры и должны быть адаптированы для других типов микроскопа и/или камеры. Она также имеет следует отметить, что протокол использует приложений, специфичных для одного ТЕА и у пользователей с другими моделями рассмотреть различия в настройке.
Мы считаем, что наш рабочий процесс можно адаптировать для многих других приложений, не только в неврологии, но и в широком поле биологической науки, а также материальная наука (когда требуется высокое разрешение ТЕА) всякий раз, когда вопрос исследования требует систематической форме случайная выборка и количество образцов быть расмотренным просит время эффективный способ анализа. Например мы в настоящее время заинтересованы в локализации запасы железа в человеческом мозге. Для этого недавно мы адаптировали наши рабочего процесса, для элементного анализа на ультра-тонких секций в произвольно выбранных районах. Для того, чтобы свести к минимуму количество приложений, которые необходимы для рабочего процесса, мы стремились применить с помощью программного обеспечения SerialEM только, потому что он может быть запрограммирован для перемещения на сцену, чтобы предустановленных точек, которые могут быть выбраны случайным образом. Мы создали пользовательские сценарии для управления ТЕА, с целью автоматизирующие процесс полностью. Это оказалось возможным за исключением автофокусировки в отфильтрованного изображения режиме, который не дают удовлетворительные результаты. Мы таким образом использовал DM программное обеспечение для фокусировки и для получения энергии фильтрация изображений.
Таким образом мы представляем программные решения, которые помогают в получении электронной микроскопии в объективной форме.

В электронной микроскопии часто бывает сложно образец представитель регионов в рамках разделов. Мы, в качестве наблюдателя, часто смещены взглянуть на конкретные регионы, обращено наше внимание заметных особенностей образца, предотвращая хорошо распределенных, беспристрастной выборки. Смещения выборки можно избежать только если каждый частью региона интерес получает такой же шанс оказаться в электронная микрофотография1. Это позволяет избежать смещения выборки без программное решение, например, нажав trackball микроскопа вручную не глядя на изображение, чтобы выбрать выборки регионах где перестанет сцене. Но, строго говоря, это не случайная процедура, потому что, сознательно или подсознательно, пользователь может иметь влияние на движение сцены, и, Кроме того, это не сложный способ отбора проб регионов. Случайная выборка становится особенно важным, если пары разделов используются для оценки числа структур в определенном объеме, например, для stereology1, который требует пары разделов, известный расстоянии друг от друга. Также можно смотреть только в одну секцию и оценить количество конкретных структур2, но с этим подходом следователи склонны переоценивать численный плотность более крупные структуры, если структуры очень малы по Сравнение толщины среза. Альтернативные подходы, для восстановления томов ткани от последовательных секций и таким образом получить желаемых данных3. Но это очень много времени и не целесообразный подход (больше) сравнительных исследований.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали рабочий процесс, который позволяет исследователю автоматически выбрать образцы для получения электронной микроскопии на регулярные интервалы в ультра-тонких секций. Положение электрона микроскопии случайных, позволяя беспристрастной выборки. Этот подход подходит как для определения числовых плотности структур (например, синапсы в течение определенного Нейропиль тома4,5) и размеры структурных особенностей (например, ширина синаптическую щель, или диаметр постсинаптических плотность4,5).
Рабочий процесс использует заказные случайную точку выборки (RPS) программное обеспечение (написана на языке Java script, используя сценарии программное обеспечение, поставляемое с нашими микроскопа), которая автоматически вычисляет сетки позиции в рамках предопределенных региона интерес в ультра-тонкий секции. Программное обеспечение RPS перемещает Этап микроскопа эти предопределенные точки, так что электронная микрофотография могут быть сделаны в каждой точке. Во-первых пользователь определяет область интереса в тонкие секции. Далее RPS программное обеспечение вычисляет сетки позиции в этом регионе. X / y координаты первой позиции создаются случайным образом, и оставшиеся должности размещены промежутки регулярной сетки в отношении в первую позицию. Потому что каждый частью региона интерес имеет такой же шанс рассматривается, это позволяет коллекции минимальный объем данных. Этот подход выборки также называется систематический единообразные случайной выборки (см. ссылки7 6,для получения более подробной информации).
Для определения числовых плотности структуры, мы работаем с пары разделов, которые являются известными расстоянии друг от друга. После получения электронная микрофотография из первого раздела в одной из заранее определенных позиций, ТЕА серийный раздел программного обеспечения (часть пакета программного обеспечения поставляется с нашими микроскопа) движется к соответствующей точке во втором разделе, для того чтобы получите электронная микрофотография соответствующего местоположения. Это повторяется для каждого местоположения в сетке заранее. В нашем подходе disector используется для подсчета числа частиц в каждой паре электронной микроскопии8,9. Disector состоит из пары учет кадров, один для каждого раздела8,9. Численное плотность объектов определяется только подсчет объекты видны на первый раздел (или справочный раздел), но не на второй раздел (или раздел поиска). Это позволяет оценить численные плотности объектов в быстрый и эффективный способ8,9. Кроме того на одной секции, двумерных структурные особенности могут быть измерены.
Мы применили этот процесс успешно для оценки различий в числа синапсов в гиппокампе мышей в жилищных условий по сравнению с обычной среде (SE) жилищных условий4,5, обогащенный окружающей среды (EE) а также для оценки ультраструктурных различия между дикого типа (WT) мышах и нейропептида Y (NPY) KO мышей держали под SE и EE5. Нашей целью было смотреть специально на структурных особенностей нейронов, как численные синаптических плотность, длины активной зоны в сечениях и постсинаптических плотности, ширина синаптическую щель и количество синаптических пузырьков, для того, чтобы оценить изменения в нейрональных подключения и активации между различных экспериментальных условиях. Кроме того мы были заинтересованы в численные плотность плотные ядра везикулы (DCV) в нейронах определить количество хранимых нейропептидов в определенной области мозга.
Основываясь на успехе нашего подхода для проведения исследований, описанных выше, в наш следующий шаг, мы адаптировали наш рабочий процесс для выбора областей для беспристрастной элементного анализа в рамках образцы человеческого мозга. Это было сделано для изображения железа, который хранится в молекулах ферритина в нейронов и глиальных клеток. Для этого мы составили скрипт, который позволил нам автоматизировать большинство операций для случайного отбора участков мозга в определенной области.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:611px;" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Pentobarbital</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:135px;">P3761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutardialdehyde</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 16210</td>
			<td>25%; 100ml; EM grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cacodylate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C4945</td>
			<td style="width:167px;">250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thionine acetate/Ceristain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>861340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1000631000</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1064951000</td>
			<td>1 kg, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">osmium tetraoxide</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 19110</td>
			<td>10x1g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TAAB embedding resin</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAT001</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DMP-30</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD024</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DDSA</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD025</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>19481</td>
			<td>depleted, 25g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Ultrastain 2</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td>Lead citrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Toluidine blue solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td>10g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pioloform</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1275</td>
			<td>10g Powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proylenoxide</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>82320-1L</td>
			<td>1L</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;">DPX embedding medium</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1320</td>
			<td style="width:167px;">embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vibratome, Leica VT 1000</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Leica Ultracut UCT, ultramicrotom</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tecnai G2 20</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Megaview wide angle camera</td>
			<td>Olympus Soft Imaging Solution, M&#252;nster, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">US 1000 digital camera</td>
			<td>Gatan, Pleasanton, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEM Imaging Analysis Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FEI Serial Section Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiji, ImageJ 1.52e</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPSS 20.0</td>
			<td>SPSS Inc., Chicago, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SerialEM</td>
			<td>Regents of the University of Colorado</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPS (random point sampling) software 0.9a</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disector v1.0.2 (ImageJ macro)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EFTEMSerialEM (SerialEM script)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience

Исследования ультраструктурные особенности нейронов и их синапсы возможны только с электронной микроскопии. Особенно для сравнительных исследований изменения в плотности и распределения таких функций протокол беспристрастной выборки жизненно важное значение для достижения надежных результатов. Здесь мы представляем рабочий процесс для захвата изображений образцов мозга. Рабочий процесс позволяет систематический единообразные случайной выборки в области определенных мозга, и изображения могут быть проанализированы с помощью disector. Этот метод гораздо быстрее, чем обширные изучения последовательных секций, но по-прежнему представляет целесообразный подход для оценки плотности и распределения Ультраструктура функций. До внедрения, окрашенных vibratome разделы были использованы как ссылку для определения области мозга под следствием, который помог ускорить подготовку общего образца процесса. Этот подход был использован для сравнительных исследований, влияние обогащенный жилищных условий на нескольких ультраструктурных параметров в мозг мыши. Опираясь на успешное использование рабочего процесса, мы адаптировали его для элементного анализа образцов мозга. Мы оптимизировали протокола с точки зрения времени взаимодействия с пользователем. Автоматизация всех времени шаги путем компиляции сценария для с открытым исходным кодом SerialEM помогает пользователю сосредоточиться на основной работе получения элементарного карты. Как и исходный рабочий процесс мы обратили внимание на беспристрастной выборки подход к гарантировать надежные результаты.

Здесь мы описываем рабочий процесс для выбора областей для ТЕА автоматическое и беспристрастной способом. Пользователь выбирает область интереса в ультра-тонкий разделе ТЕА и использует несколько программных решений для рабочего процесса, включая наши RPS программное обеспечение, которое автоматически вычисляет координаты 20 выборки районов в пределах области интерес. Затем на этапе ТЕА перемещается в каждой области выборки для фотографии. Это возможно как для анализа отдельных участков, так и для анализа пары разделов, известным расстоянием друг от друга, который позволяет выбрать области для изображений без предвзятости следователя.
Этот процесс оказался ценным при документировании ультраструктурные особенности в мыши мозга разделы4,5. В этих исследованиях превращение слоя клеток зубчатой извилины (DGpl) рассматривался как области, представляющей интерес. Наш метод оказался подходит для изучения ГД, потому что коронковой части спинной ГД (Bregma −1.3) вписывается в ультра-тонкий секции и ее контуры легко распознаются при низком увеличении. Если другие регионы мозга были рассмотрены, было бы важно, чтобы проверить их размер и отличительные черты до планирования экспериментов.
Применение рабочего процесса, описанного здесь показали, что EE жилья увеличивает ширину синаптическую щель значительно в DGpl4, в отношении стандартных жилищных условий. Кроме того количество густой ядро везикулы значительно уменьшилось в здании EE животных4, указанием изменений в семье нейропептидов. Когда WT и NPY нокаут мышей держали в условиях EE, количество нейронов/µm³ в DGpl увеличивается, в то время как плотность DCV снизился по отношению к SE-корпус5. В противоположность этому NPY нокаут привело значительное увеличение числа синаптических пузырьков в резерв (незакрепленных синаптических пузырьков) независимо от жилищных условий5. Влияние EE на ширину синаптическую щель была обращена вспять в группе NPY KO, что приводит к существенной разницы между EE-здание WT и NPY KO мышей5. Наряду с поведенческих исследований WT и NPY животные нокаут провел под обоих типов жилищных условий, это указывает на важную роль NPY нейробиологических эффекты EE5.
Для визуализации железа, хранящиеся в человеческом мозге, сценарий был составлен для программного обеспечения SerialEM случайным образом выбирать точки приобретения от в целом ультратонких секции, с целью получения энергии фильтруемый электронная микрофотография в каждой из этих точек . После загрузки раздел в электронный микроскоп, сценарий выполняется стабилизации секции (т.е., образец приготовление обычной) на ночь. Затем сценарий случайно выбранных количество точек, предопределенные пользователем от тех, которые отмечены с решетки на рисунке 3. Производя Микрофотография испытания и проверки ее уровней серого, сценарий проверки, если выбранные точки были расположены на видимой части раздела, отвергая точек, которые высадились на сетке баров. Большую часть рабочего процесса было обработано сценарий с минимальным вмешательством пользователя. Однако не удалось автоматически записывать энергии фильтруют микроскопии (с этой установки), как там было слишком мало света для автофокусировки обычной SerialEM. Таким образом мы перешли на DM программного обеспечения, как только сценарий переехал сцену в каждой точке, отрегулировать фокус вручную и сделал изображение EFTEM железа. На рисунке 4приведен пример для EFTEM железа изображения от post-mortem человеческий мозг.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> Рисунок 1. Иллюстрации процесса. (A) основные этапы подготовки образца приведены (в направлении стрелки): vibratome разделы (i), embedding(ii), резка тонкий и ультра-тонких секций (iii) и ловить пар ультра-тонких секций на медь сетки (iv). (B) использование микроскопа поставщика программного обеспечения и RPS специализированного программного обеспечения для создания координаты области выборки, которые определяют сайты записи. Угловые точки секции хранятся в микроскопии программного обеспечения и ROI выделен (определенных с помощью полутонкая секции) (i); сетке выборки районов генерируется над ROI, случайный сдвиг (красная стрелка) вводится в x и y. Переход меньше, чем расстояние между районами выборки, (черные стрелки), так что вместо того, чтобы черные квадраты, которые имеют без сдвига, синие квадраты, которые случайно сдвинуты, используются для определения записи сайтов (ii); только отбор проб в границах ROI (рисуется как черные и голубые квадраты) используются для записи. Микроскопии производятся как в разделе ссылок (черные квадраты), так и в соответствующих местах в разделе поиска (синий квадрат) (iii). (C) Микрофотография производится на каждой области выборки с достаточным увеличением; Монтаж, состоящий из нескольких слияния изображений производится при необходимости (в данном случае, изображения были объединены вместе 2 x 2) (i); подсчитывать кадр генерируется и показано как наложение на изображении, будет учитываться структур в рамках и на «признание линии» (пунктирная рамка линии), но не те, на «запрещенные линии» (рамка твердой линии) (ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> Рисунок 2 . Измерения параметров ультраструктурных на пару ультра-тонких секций с беспристрастной подсчет кадра. (A) обзор ImageJ windows, используемый для подсчета и анализа клеточных структур. Левой стороне показывает электронная микрофотография с подсчитывать кадр как оверлей. На правой стороне: ImageJ пользовательский интерфейс (синий прямоугольник) с раскрывающегося меню (вверху) и панели инструментов (см. ниже); ObjectJ редактор объектов (зеленый прямоугольник); окна ObjectJ инструменты (оранжевый прямоугольник), где можно выбрать инструменты для измерения и окна результаты ObjectJ (черный прямоугольник), где описаны все измерения. (B) деталь от показаны заметно синапсов на электронная микрофотография (синапсы на обоих участках - стрелки; синапса только на подстановки раздела стрелок). Те помечены с помощью Multipoint-средство (красный кружок) на панели инструментов в ImageJ. (C) имена и измерения параметров синаптических функции определяются с помощью ObjectJ средств. Маркер-инструмент и функцию интерес выбираются и наброски, нарисованный на изображении слева мыш clicks вдоль структуры. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> На рисунке 3. Выбор, отбор областей для элементного сопоставления в рамках ROI для энергии фильтруют просвечивающей электронной микроскопии. SerialEM используется для выбора региона интерес и предложить большое количество выборки районов на регулярные интервалы (розовый кресты на рисунках A и B). Затем сценарий случайным образом выбирает выборки районов (из этих предопределенных координат) для приобретения. Выборки районов с плохой освещенности отклоняются избежать сетки баров и сценарий останавливается, как только 20 районах хорошо освещенной выборки были отобраны в рамках ROI. (A) обзор всей области интереса, изложенные многоугольник, с большим числом возможных выборки районов, отмеченные X. (B) подробно показаны области выборки до случайного отбора. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> Рисунок 4. Пример получения элементарного карта (EFTEM). (A) светлые области ТЕА Микрофотография вокруг приобретения точки. Случайно выбранной области был использован для получения элементарного карта и характеризуется черный прямоугольник. (B) EFTEM до края окна изображения, сделанные в произвольно выбранной области. (C) EFTEM после края окна изображения в той же области. (D) Элементаль карта железа из той же области (M-edge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience at JoVE.com

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Мы представляем Роман рабочего процесса для электронной микроскопии исследования мозговой ткани. Этот метод позволяет пользователю для изучения нейрональных функции в непредвзятой манере. Для элементного анализа мы также представляем сценарий, который автоматизирует большую часть рабочего процесса для рандомизированные выборки.

Беспристрастный подход выборки ТЕА секций в неврологии

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Непредвзятый протокол отбора проб имеет жизненно важное значение для электронной микроскопии. Если вы хотите количественно оценить его по численной плотности синапсов или других структур в определенной области мозга, главное преимущество нашей техники заключается в том, что она непредвзята и позволяет автоматически производить электронные микрографы с минимальным вмешательством пользователя. Этот метод также ценен в других областях исследований, таких как неврология, где он может быть использован в оценке прочности нейронной сети.Для того, чтобы применить наш протокол, необходимо иметь опыт работы с электронными микроскопическими методами, такими как подготовка образца и эксплуатация переходного электронного микроскопа. Демонстрацией нашей процедуры будет доктор Стефан Верницниг, пост-док из моей лаборатории. Этот протокол состоит из подготовки образцов мозга для электронной микроскопии, разрезания пар тонких секций.Далее, он будет описывать, как автоматически производить определенное количество электронных микрографов в области, представляющие интерес. Затем он будет использовать рамку подсчета для оценки численной плотности структурных объектов. Для начала, вскрыть, исправить, пост-исправить, и вставлять образцы, представляющие интерес в встраивании смолы, следуя вместе с сопроводительным текстовым протоколом.Затем поместите образец на ультрамикротом и произвести 55 нанометров сверхтонких серийных секций. Поместите секции на слот-сетку размером один миллиметр на два миллиметра, покрытую пиолой. Затем счетчики ультра тонкие секции на слот сетки с использованием 2%уранил ацетат в течение 30 минут, а затем свинца цитрата в течение 30 секунд при комнатной температуре.Поместите сетку в TEM и изучить разделы на сетке с TEM с помощью низкого увеличения для ориентации и оценки качества разделов. Затем запустите программное обеспечение TEM Serial Section, выберите раздел и выберите Insert, чтобы добавить угловые точки для раздела справки и осмотра. Следуйте инструкциям всплывающего окна.Начните с справочного раздела, а затем продолжить с разделом осмотра. Убедитесь, что края раздела параллельны следующему разделу, так как точки один и два введены. Далее визуализировать справочный раздел под низким увеличением, чтобы определить область интереса.Переместите стадию микроскопа с помощью анализа изображений TEM в справочном разделе в несколько угловых точек рентабельности инвестиций, чтобы создать контур рентабельности инвестиций. Запись координат полученного полигона с помощью программного обеспечения Random Point Sampling. Для этого нажмите Добавить координаты в диалоговом поле программного обеспечения Random Point Sampling в каждой точке полигона, который необходим для набросков рентабельности инвестиций в разделе.Затем определите и введите подходящий размер для областей выборки и расстояний между областями в программное обеспечение выборка случайных тока. Затем нажмите Вычислить Raster для создания координат в систематической, равномерной, случайной моды для микрографа позиции в полигоне. Храните точки выборки в разделах ссылки и осмотра с помощью программного обеспечения Random Point Sampling и программного обеспечения TEM Serial Section.Это координаты монтажей, которые записываются впоследствии. В программном обеспечении Random Point Sampling нажмите на следующее положение, чтобы переместить стадию микроскопа в x, y-координаты каждой области выборки в справочном разделе. Затем выберите Местоположение и выберите Insert для импорта этих координат в программном обеспечении TEM Serial Section в справочном разделе.Повторите это для всех координат. Чтобы отразить координаты из справочного раздела в разделе осмотра, выберите раздел и выберите Перейти к разделу. Введите номер раздела осмотра в окне диалога.Для записи монтажей переключитесь между ссылкой и разделом осмотра, как описано ранее, и измените положение в справочном разделе с местоположением и перейдите на номер. Выберите следующую координату в диалоговом окне. Для serialEM монтажи, при каждой координации выборки, перейдите в файл и выбрать новый монтаж из выпадают меню.Выберите нужное количество плиток и процент перекрытия в окне диалога. Для настоящего исследования, увеличение 5000 достаточно, чтобы признать синаптические особенности на исследование. Но ограниченное поле зрения камеры CCD требуется сделать монтажи из двух на два изображения.Монтажи сделаны для SerialEM. Перед записью каждого монтажа скорректируйте фокус или активируйте опцию автоматического фокусировки в программном обеспечении для записи. Выберите папку, чтобы сохранить файл монтажа и начать запись монтажа, нажав Начало в монтаже подменю, слева в SerialEM.Запустите микродиссер и определите размер кадра подсчета и количество сегментов по мере необходимости. Подсчитайте плотность синапса с помощью макроса пресектора. Используя многоочные инструменты, расположенные в панели инструментов, ограничьте те синапсы, которые пересекаются с двумя запрещенными линиями рассечения, но подсчитывают синапсы на противоположных линиях принятия.Отметте каждый синапс в рамке подсчета, которая видна в справочном разделе, но не видна в разделе осмотра, с овальным выделением. Для измерения параметров синапса выберите только синапсы с синаптической расщелиной, ориентированной на поперечное сечение, которое находится на справочном разделе. Это должно быть в пределах тех же кадров изображения, используемых для вскрытия.Далее перейдите в Plugins, а затем проанализировать и начать плагин ObjectJ из выпадают меню. Откройте новый проект из диалога ObjectJ, который откроет окно, которое позволит пользователю наметить и отметить структуры с помощью инструмента маркера. Во-первых, используйте маркер инструмент для измерения длины до синаптической мембраны и пост-синаптической плотности длины, рисуя линию вдоль структуры.Затем получить средняя ширина синаптической расщелины, нарисовав полигон, охватывающий как до-, так и пост-синаптической мембраны. Чтобы определить количество состыковах пузырьков, подсчитайте все пузырьки, которые имеют максимальное расстояние от до синаптической мембраны диаметром одной везикулы или меньше. Затем определите количество отстыковах пузырьков, подсчитав пузырьки с максимальным расстоянием диаметром одной везикулы от пристыкована или других отстыкована пузырьков при том же синапсе.Адаптированная версия протокола позволяет анализировать элементы в объективно полученных местах в сверхтонкой секции. Для этого в режиме визуализации TEM запустите SerialEM и откройте новый проект. Затем откройте Навигатор и проверьте настройки камеры в элементе управления камерой и скриптом для просмотра и записи и просмотра.Чтобы составить угловую карту ультратонкой секции, выберите Дополнительные точки в окне Navigator. Затем установите угловые точки по краям ультратонкой секции. Переместив сцену в угловую точку, удерживая правый ключ мыши.Когда угол раздела достигнут, добавьте угловую точку с щелчком левой мыши. Повторите процедуру, чтобы добавить еще три угловых точки. Убедитесь, что в окне Navigator поле C для угловых точек галочкой для сохраненных точек.Чтобы начать угловой монтаж, перейдите в Navigator в баре меню SerialEM и выберите Montaging Grids и Setup Corner Montage из выпадают из меню. Выберите Добавить полигон в окне Navigator и наметить область интереса с несколькими щелчками правой мыши. Далее выберите Add Grid of Points в меню высадки Навигатора и определите расстояние между точками.Запустите сценарий EFTEMSerialEM, следуйте командам скрипта, введите количество точек сетки, как показано в Навигаторе, и введите количество точек приобретения. Затем установите порог освещения, чтобы сценарий можно было избежать сетки баров. Следуйте командам скрипта и переместите сцену вручную, чтобы покрыть поле зрения на четверть сетки.В соответствии с отображаемое значение введите пороговое значение освещения, которое выше отображаемого значения. Подождите, пока очки для приобретения будут выбраны и рутина приготовления пищи будет закончена. Это занимает много времени и может быть сделано в одночасье.После настройки для энергофильтрованного элементарного анализа TEM приобрети элементарную карту с настройками, специфичными для элементов. Непредвзятый подход к выборке полезен для подсчета и анализа синаптических особенностей в определенных областях мозга. Кроме того, скрипт EFTEMSerialEM для программного обеспечения SerialEM позволяет случайным образом выбирать точки приобретения изнутри целого сверхтонкого раздела с целью получения электронного микрографа с энергетической фильтрацией в каждой из этих точек.Скрипт случайным образом выбрал ряд точек, предварительно определенных пользователем, из тех, которые отмечены классификацией. Производя тестовый микрограф и проверяя его уровни классов, скрипт проверяет, находятся ли выбранные точки на видимой части раздела, отвергая точки, которые приземляются на решетки. Большая часть рабочего процесса была обработана скриптом, с минимальным взаимодействием пользователя.Тем не менее, с образцом показано здесь, было слишком мало света для автоматической рутины фокус SerialEM. Поэтому, как только сценарий переместил сцену в каждую точку, фокус был скорректирован и элементарная карта была сделана из железа. Важно тщательно выбрать область, представляющий интерес, и обеспечить, чтобы одинаковое число точек отбора проб попадает в каждую область, представляющие интерес.Не забывайте, что многие химические вещества, используемые для подготовки образцов являются токсичными. Так что носите лабораторное пальто и защитные перчатки и работа под дымовой крышкой.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

Высокая связанные с событиями Плотность Потенциальные сбора данных в когнитивной неврологии

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Дважды флуоресценции На месте Гибридизация в пресной разделы мозга

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Морфометрические анализы сетчатки Разделы

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, инновационный автоматизированный подход к анализу Глазодвигательный

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Обнаружение Axonally локализованного мРНК в срезах мозга с помощью высоким разрешением<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Подход, чтобы усилить согласованность и миелинизации спинного ганглий корень Нейроны

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Электрофизиологические Способ записи ответов внутриклеточный амперных<em&gt; Drosophila</em&gt; Фоторецепторов и Интернейроны к световой раздражитель<em&gt; В Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Масштабные реконструкций и независимой, беспристрастной кластеризация на основе морфологических показателей для Классифицировать Нейроны в селекционных популяциях