Name: an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00
Duration: 10 min 56 s
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Financiado por el número de proyectos del fondo de Ciencias austríaca, FWF, P 29370 B27

<ol>
	<li>Howard, V., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , (1998).</li><li>Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-changes+of+brain+synapses+and+synaptic+plasticity+in+response+to+an+enriched+environment.">Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment.</a> Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).</li><li>Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Tissue+Samples+from+the+Placenta:+An+Illustration+of+Principles+and+Strategies.">Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies.</a> Placenta. 29, 1-14 (2008).</li><li>Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Golgi+structure+using+EM:+combing+volume-SEM+and+stereology+for+higher+throughput.">Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput.</a> Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).</li><li>Lewis, P. R., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Staining Methods for Sectioned Material. , (1988).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice.">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li><li>Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+induces+synaptic+structural+modification+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats.">Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).</li><li>Lonetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+environmental+enrichment+moderates+the+behavioral+and+synaptic+phenotype+of+MeCP2+null+mice.">Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice.</a> Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El flujo de trabajo que presentamos permite al investigador obtener datos sobre las características ultraestructurales de una manera imparcial. Esto es mucho menos tiempo que las investigaciones volumen de secciones seriadas. Se utilizan varias aplicaciones diferentes para lograr este objetivo. Al principio, nuestro software RPS por encargo (para información sobre disponibilidad, póngase en contacto con el autor correspondiente) se utiliza para introducir un cambio de escenario aleatorio para seleccionar las coordenadas del área de muestreo. Esto permite un muestreo al azar uniforme sistemático del ROI. A continuación, para el conteo de estructuras específicas, adaptamos el método disector, donde se comparan 2 secciones consecutivas con distancia conocida, de una forma novedosa en comparación con anteriores estudios13,14,15 como nuestro software por encargo de RPS para sistemático muestreo aleatorio uniforme. Esto ahorra tiempo en comparación con los volúmenes todos reconstrucción 3D de secciones seriadas. El software a la medida de la RPS ha sido desarrollado específicamente para un tipo de microscopio que es un factor limitante para el flujo de trabajo de la reproducción. Una alternativa de este software específico sería una aplicación que permite secuencias de comandos y es compatible con otros modelos de microscopio.
Hemos utilizado con éxito este enfoque para nuestros estudios comparativos4,5. El ultra delgadas secciones de tejido neuronal, el área de interés fue esbozado e imágenes fueron tomadas por muestreo aleatorio uniforme sistemático dentro de esta área. Debe ser observado que el área de interés, la capa polimorfa del giro dentado, es un área más bien pequeña para investigar que podría ser beneficioso para nuestro enfoque. Dentro de un disector colocada al azar, se evaluó el número de DCV y varias características ultraestructurales de las sinapsis en la DGpl de ratones adultos en SE y EE como WT adultos ratones versus adultos ratones knockout NPY. Con nuestro enfoque, los datos obtenidos demostraron cambios en algunos de los parámetros investigados. Estos resultados confirman los de otros estudios similares en animales menores2.
Un inconveniente de la utilización experimental de este flujo de trabajo puede ser que este multi-uso-enfoque no es ideal en términos de facilidad de uso, los usuarios necesitan para sentirse cómodo con diferentes interfaces de usuario (en nuestro caso, la interfaz de usuario, sección serie TEM el software RPS y SerialEM). Aprender a manejar todas las aplicaciones de manera eficiente consume tiempo y debe tenerse en cuenta. Sin embargo, invertir tiempo en aprender a usar este flujo de trabajo sigue siendo claramente favorable sobre el tiempo necesario para analizar los volúmenes enteros con sección serie TEM. El método de usar un disector de sistemático muestreo aleatorio uniforme en el área de interés es suficiente para presentar datos fiables1 sin la necesidad de investigar una gran cantidad de secciones/volumen.
Para maximizar los resultados en nuestros estudios, es indispensable tomar buen cuidado durante la preparación de la muestra, como la preservación de los tejidos y las estructuras no sólo es crucial para la evaluación de características estructurales, sino también para identificar claramente el área de interés. Un factor fundamental y quizás otro inconveniente de este método, es que una alta calidad de los pares de secciones muy delgadas se requiere: no debe existir huecos ni arrugas que cubren el área de investigación en cualquiera de las secciones, y el espesor de la sección debe ser mantener homogéneo. El investigador tiene que estar bien entrenado en ultramicrotomía. Cuidado debe también ser cuando proyección de imagen las secciones en la TEM, como las secciones son sensibles a daño de viga del electrón y pueden desgarrar fácilmente. Además, es importante elegir el número adecuado de áreas de muestreo en el ROI. Dependiendo el objetivo experimental, el aumento de los micrográfos de electrón debe ajustarse cuidadosamente. Para nuestros experimentos específicamente, contando las sinapsis en el sistema nervioso central, 20 regiones de interés en una sección con la superficie de 30,25 μm2 son óptimas. Se aconseja capacitar al personal también en el reconocimiento de las características en cuestión (en nuestro caso sinapsis, sinápticas características y DCV) para obtener resultados fiables. Con el fin de identificar las sinapsis, las vesículas sinápticas deben ser identificables y esto requiere una resolución de al menos 10 nm. Para ello, un aumento de 5000 X era óptimo, pero debe tenerse en cuenta que la ampliación depende de parámetros del hardware tales como el tipo y la posición de las cámaras y tendría que ser adaptado para otros tipos de microscopio y cámara. También tiene que tenerse en cuenta que el protocolo utiliza aplicaciones específicas para un TEM y que los usuarios con otros modelos a tener en cuenta las diferencias en la configuración.
Creemos que nuestro flujo de trabajo puede ser adaptado para otras muchas aplicaciones no sólo en Neurociencias sino en un amplio campo de las ciencias biológicas y Ciencias de materiales (cuando es necesaria la alta resolución de un TEM) siempre que la pregunta de investigación exige una sistemática uniforme muestreo aleatorio y la cantidad de muestras a ser examinadas pide de una manera eficiente de tiempo de análisis. Por ejemplo, estamos actualmente interesados en localizar tiendas de hierro en el cerebro humano. Para ello, recientemente hemos adaptado nuestro flujo de trabajo, para permitir análisis elemental en ultra delgadas secciones de áreas seleccionadas al azar. Para reducir al mínimo el número de aplicaciones que son necesarias para el flujo de trabajo, se intentó aplicar usando el software SerialEM, porque puede ser programado para mover el escenario para establecer los puntos que pueden ser seleccionadas de manera aleatoria. Hemos creado scripts personalizados para controlar la temperatura, con el objetivo de automatizar el flujo de trabajo completamente. Esto resultó posible excepto el enfoque automático en modo imagen filtrado, que no dió resultados satisfactorios. Así utilizamos software de DM para enfocar y para la obtención de las imágenes filtradas de energía.
En Resumen, presentamos soluciones de software que ayudan en la obtención de micrografías electrónicas de una manera imparcial.

En microscopia electrónica, es a menudo desafiante a regiones representativas dentro de las secciones de la muestra. Nosotros, como observador, estamos a menudo sesgadas para examinar regiones específicas señala a nuestra atención por las características llamativas de la muestra, impidiendo una muestra imparcial, bien distribuida. Sesgo de muestreo sólo puede ser evitada si cada parte de la región de interés es la misma probabilidad de acabar en una micrografía electrónica1. Es posible evitar el sesgo de muestreo sin una solución de software, por ejemplo, presionando el trackball del microscopio manualmente sin mirar la imagen, con el fin de seleccionar las regiones de muestreo donde se detiene la etapa. Pero estrictamente hablando, esto no es un procedimiento al azar, porque, consciente o inconscientemente, el usuario puede tener una influencia en el movimiento de la etapa, y, además, no es una manera sofisticada de selección de regiones de muestreo. Muestreo al azar se vuelve especialmente importante si pares de secciones se utilizan para determinar el número de estructuras en un volumen determinado, por ejemplo, estereología1, que requiere pares de secciones, una distancia conocida. También sería posible sólo en una sola sección y estimar el número de estructuras específicas2, pero con este enfoque los investigadores tienden a sobreestimar la densidad numérica de estructuras más grandes, a menos que las estructuras son muy pequeñas en comparación con el espesor de la sección. Enfoques alternativos son reconstruir volúmenes de tejido a partir de secciones seriadas y así obtener los datos deseados3. Pero esto es muy tiempo consumiendo y no un enfoque factible para estudios comparativos (más grandes).
Para superar estos problemas, hemos desarrollado un flujo de trabajo que permite al investigador seleccionar automáticamente las muestras para la obtención de micrografías electrónicas en el espaciamiento regular en secciones muy finas. La posición de los micrográfos de electrón es aleatoria, lo que permite el muestreo imparcial. El enfoque es adecuado tanto para la determinación de la densidad numérica de estructuras (por ejemplo, el sinapsis dentro de un cierto neuropil volumen4,5) y las dimensiones de características estructurales (por ejemplo, la anchura de la hendidura sináptica, o el diámetro de la densidad postsináptica4,5).
El flujo de trabajo usa un punto al azar por encargo (RPS) software (escrito en Java script mediante Scripting software suministrado con el microscopio) que calcula automáticamente las posiciones en la parrilla dentro de una región predefinida de interés en un ultra finos de la sección de muestreo. El software RPS mueve la etapa del microscopio electrónico a estos puntos predefinidos, de modo que una micrografía electrónica se puede hacer en cada momento. En primer lugar, el usuario define una región de interés dentro de la sección delgada. A continuación, el software RPS calcula posiciones en la parrilla dentro de esta región. El x / y coordenadas de la primera posición se crean al azar, y los restantes puestos se colocan en intervalos regulares de la red con respecto a la primera posición. Porque cada parte de la región de interés tiene la misma probabilidad de ser examinado, esto permite recolección de datos mínima. Este enfoque de muestreo también se le llama muestreo aleatorio uniforme sistemático (ver referencia6,7 para más detalles).
Para la determinación de la densidad numérica de estructuras, trabajamos con pares de secciones que están a una distancia conocida. Después de obtener un micrográfo de electrón de la primera sección en una de las posiciones predeterminadas, software sección serie TEM (parte del paquete de software suministrado con el microscopio electrónico) se mueve hasta el punto correspondiente a la segunda sección, a fin de obtener una micrografía electrónica de la ubicación correspondiente. Esto se repite para cada localización en la red predeterminada. En nuestro enfoque, un disector se utiliza para contar el número de partículas en cada par de micrográfos de electrón de8,9. Un disector consiste en un par de cuenta marcos, uno para cada sección8,9. La densidad numérica de los objetos está determinada por solamente contar objetos visibles en la primera sección (o sección de referencia) pero no en la segunda sección (o sección de búsqueda). Esto permite para estimar la densidad numérica de los objetos de una manera rápida y eficiente8,9. Además en cada sección, se pueden medir dos dimensiones características estructurales.
Hemos aplicado este flujo de trabajo con éxito para evaluar las diferencias en el número de sinapsis en el hipocampo de ratones expuestos a ambiente enriquecido (EE) en comparación con el entorno estándar (SE) vivienda condiciones4,5, de las condiciones de vivienda y también evaluar las diferencias ultraestructurales entre ratones de tipo salvaje (WT) y neuropéptido Y (NPY) KO ratones SE y EE5. Nuestro objetivo era mirar específicamente características estructurales de las neuronas, como la densidad sináptica numérica, la longitud de la zona activa en cortes transversales y de la densidad postsináptica, la anchura de la hendidura sináptica y el número de vesículas sinápticas, con el fin de evaluar los cambios en la conectividad neuronal y la activación entre las diferentes condiciones experimentales. Además, nos interesó la densidad numérica de vesículas de núcleo denso (DCV) en las neuronas para determinar la cantidad de neuropéptidos almacenado en cierta área del cerebro.
El éxito de nuestro enfoque de los estudios descritos anteriormente, en nuestro siguiente paso, hemos adaptado nuestro flujo de trabajo para seleccionar áreas para imparciales análisis elementales en muestras de cerebro humano. Esto se hizo al hierro de la imagen, que se almacena en moléculas de ferritina en neuronas y células gliales. Para ello, compilamos un script que nos ha permitido automatizar la mayoría de las operaciones de un proceso de selección al azar de secciones del cerebro en un área definida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:611px;" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Pentobarbital</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:135px;">P3761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutardialdehyde</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 16210</td>
			<td>25%; 100ml; EM grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cacodylate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C4945</td>
			<td style="width:167px;">250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thionine acetate/Ceristain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>861340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1000631000</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1064951000</td>
			<td>1 kg, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">osmium tetraoxide</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 19110</td>
			<td>10x1g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TAAB embedding resin</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAT001</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DMP-30</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD024</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DDSA</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD025</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>19481</td>
			<td>depleted, 25g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Ultrastain 2</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td>Lead citrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Toluidine blue solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td>10g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pioloform</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1275</td>
			<td>10g Powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proylenoxide</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>82320-1L</td>
			<td>1L</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;">DPX embedding medium</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1320</td>
			<td style="width:167px;">embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vibratome, Leica VT 1000</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Leica Ultracut UCT, ultramicrotom</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tecnai G2 20</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Megaview wide angle camera</td>
			<td>Olympus Soft Imaging Solution, M&#252;nster, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">US 1000 digital camera</td>
			<td>Gatan, Pleasanton, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEM Imaging Analysis Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FEI Serial Section Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiji, ImageJ 1.52e</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPSS 20.0</td>
			<td>SPSS Inc., Chicago, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SerialEM</td>
			<td>Regents of the University of Colorado</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPS (random point sampling) software 0.9a</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disector v1.0.2 (ImageJ macro)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EFTEMSerialEM (SerialEM script)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience

Las investigaciones de las características ultraestructurales de las neuronas y sus sinapsis sólo son posibles con microscopia electrónica. Especialmente para estudios comparativos de los cambios en las densidades y distribuciones de tales características, un protocolo de muestreo imparcial es vital para obtener resultados fiables. Presentamos un flujo de trabajo para la adquisición de imágenes de muestras de cerebro. El flujo de trabajo permite sistemático muestreo aleatorio uniforme dentro de una región definida del cerebro y las imágenes pueden ser analizadas utilizando un disector. Esta técnica es mucho más rápida que una examinación extensa de las secciones seriales pero aún presenta un enfoque factible para estimar las densidades y distribuciones de características ultraestructura. Antes de incrustar, secciones manchadas vibratome fueron utilizadas como referencia para identificar la región del cerebro bajo investigación, proceso que ayudó a acelerar la preparación de la muestra total. Este acercamiento fue utilizado para estudios comparativos investigando el efecto de un ambiente enriquecido de vivienda en varios parámetros ultraestructurales en el cerebro de ratón. Basado en el uso acertado del flujo de trabajo, adaptado a los efectos de análisis elemental de muestras de cerebro. Hemos optimizado el protocolo en el momento de la interacción del usuario. Automatizar todos los pasos lentos al compilar una secuencia de comandos para el software de código abierto SerialEM ayuda al usuario a centrarse en el trabajo principal de la adquisición de los mapas elementales. Como en el flujo de trabajo original, hemos prestado atención al enfoque de muestreo imparcial para garantizar resultados confiables.

Aquí, describimos un flujo de trabajo para seleccionar las áreas para TEM de forma automática y objetiva. El usuario selecciona el área de interés dentro de una sección ultra delgada el TEM y utiliza varias soluciones de software para el flujo de trabajo incluyendo nuestro software RPS que calcula automáticamente las coordenadas de 20 zonas de muestreo dentro del área de interés. Luego, la etapa TEM se traslada a cada área de muestreo para la fotografía. Esto es posible para el análisis de cada sección y para el análisis de pares de secciones, una distancia conocida, que permite la selección de áreas para la proyección de imagen sin el sesgo del investigador.
Este flujo de trabajo resultó valiosa al documentar las características ultraestructurales en cerebro de ratón secciones4,5. En estos estudios, la capa de células polimorfo del giro dentado (DGpl) se examinó como área de interés. Nuestro método resultó adecuado para examinar la dirección general, porque una sección coronal de la DG dorsal (Bregma −1.3) encaja en una sección ultrafina y sus contornos son fácilmente reconocibles en la ampliación baja. Si otras regiones cerebrales debían ser examinados, sería importante comprobar su tamaño y características particulares antes de planear los experimentos.
Aplicar el flujo de trabajo descrito aquí demostró que EE carcasa aumenta la anchura de la hendidura sináptica significativamente en la DGpl4, respecto a las condiciones de vivienda estándar. Por otra parte, el número de vesículas de núcleo denso disminuyó significativamente en los animales encuentra EE4, indicando los cambios en el hogar de los neuropéptidos. Cuando WT y NPY ratones knockout se mantuvieron bajo condiciones EE, el número de neuronas/µm³ en la DGpl aumentó mientras que disminuyó la densidad de DCV respecto a vivienda SE5. Por el contrario, nocaut NPY dio lugar a un aumento significativo de vesículas sinápticas en la piscina de reserva (vesículas sinápticas desacopladas) independiente de la vivienda las condiciones5. El efecto de EE en la anchura de la hendidura sináptica se invirtió en el grupo NPY KO dando por resultado una diferencia significativa entre EE encuentra WT y NPY KO ratones5. Junto con estudios de comportamiento de WT y NPY animales knockout celebró bajo ambos tipos de condiciones de vivienda, esto indica un papel crucial los efectos neurobiológicos de la EE5de NPY.
Para visualizar el hierro almacenado en el cerebro humano, una secuencia de comandos fue compilado para que el software de SerialEM elegir al azar los puntos de adquisición de dentro de una sección entera ultrafina, con el fin de obtener una energía filtraron micrográfo de electrón de cada uno de estos puntos . Después de cargar la sección en el microscopio electrónico, el script realiza la estabilización de la sección (es decir., la rutina de 'cocina de muestra') durante la noche. La escritura entonces seleccionó al azar un número de puntos predefinidos por el usuario de los marcados con una reja en la figura 3. Produciendo una micrografía de prueba y comprobación de sus niveles de gris, la secuencia de comandos comprueba si los puntos solicitados fueron situados en una parte visible de la sección, rechazar los puntos que aterrizaron en barras de la rejilla. La mayor parte del flujo de trabajo fue manejado por la secuencia de interacción mínima del usuario. Sin embargo, no fue posible registrar automáticamente energía filtrada micrografías (con esta configuración), ya que había muy poca luz para la rutina de enfoque automático de SerialEM. Por lo tanto, hemos cambiado a DM software tan pronto como la secuencia de comandos había traslada el escenario a cada punto, ajustar el foco con la mano y hecho una imagen EFTEM de hierro. En la figura 4se muestra un ejemplo de una imagen de hierro EFTEM de cerebro humano postmortem.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> Figura 1. Ilustración del flujo de trabajo. (A) se muestran los pasos principales de la preparación de la muestra (en dirección de la flecha): vibratome secciones (i), embedding(ii), corte secciones semi-delgadas y ultrafina (iii) y captura de pares de secciones ultra delgadas sobre rejillas de cobre (iv). (B) el uso de software y software RPS por encargo del proveedor microscopio para crear coordenadas de área de toma de muestras que determinan los sitios de grabación. Los puntos de la esquina de las secciones se almacenan en el software de la microscopia y el ROI se describe (identificado con la ayuda de las secciones semi-delgadas) (i); una red de áreas de muestreo se genera sobre el retorno de la inversión, se introduce un cambio al azar (flecha roja) en x e y. El cambio es menor que la distancia entre las zonas de muestreo, (flechas negras), para que en vez de los cuadrados negros, que no hay cambio, los cuadrados azules, que se desplazan al azar, se utilizan para determinar los sitios de grabación (ii); sólo zonas de muestreo dentro de las fronteras de la ROI (dibujados como cuadrados negros y azules) se utilizan para la grabación. Las fotografías están hechas en la sección de referencia (cuadrados negros) y en los lugares correspondientes en la sección de búsqueda (cuadrados azules) (iii). (C) una micrografía se realiza en cada área de muestreo en una ampliación suficiente; se hace un montaje que consta de varias imágenes combinados si es necesario (en este caso, 2 x 2 imágenes combinaron juntos) (i); un marco de cuenta se genera y se muestra como una superposición de la imagen, se contará las estructuras dentro del marco y en las 'líneas de aceptación' (líneas discontinuas marco), pero no los de las 'líneas prohibidas' (líneas de marco sólido) (ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> Figura 2 . Medición de parámetros ultraestructurales en un par de secciones ultra delgados con un marco de conteo imparcial. (A) Resumen de las ventanas de ImageJ utilizado para el conteo y análisis de las estructuras celulares. Lado izquierdo muestra la micrografía electrónica con el marco de la cuenta como una superposición. En el lado derecho: la interfaz de usuario de ImageJ (rectángulo azul) con el menú (arriba) y la barra de herramientas (abajo); el editor de objetos de ObjectJ (rectángulo verde); la ventana de Herramientas de ObjectJ (rectángulo naranja) donde se pueden seleccionar las herramientas para la medición y la ventana de resultados de ObjectJ (rectángulo negro) donde se documentan todas las mediciones. (B) detalle de mostrar las sinapsis marcadas en el micrográfo de electrón (sinapsis en ambas secciones - flechas; sinapsis sólo en la sección de búsqueda-puntas de flecha). Los marcados con la multipunto-herramienta (círculo rojo) desde la barra de herramientas en ImageJ. (C) los nombres y parámetros de medición de las funciones sinápticas se definen mediante las Herramientas de ObjectJ. Seleccionan la Herramienta de marcador y la característica de interés y el contorno dibujado en la imagen por clics de ratón de izquierda a lo largo de la estructura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> Figura 3. Selección de muestreo de áreas de mapeo elemental dentro de un retorno de la inversión energía filtrada microscopía electrónica de transmisión. SerialEM se utiliza para seleccionar una región de interés y sugieren un gran número de áreas de muestreo en un espaciado regular (Rosa Cruces en las imágenes A y B). Una secuencia de comandos a continuación al azar selecciona zonas de muestreo (a partir de estas coordenadas predefinidas) para la adquisición. Áreas de muestreo con mala iluminación son rechazadas para evitar barras de la rejilla y las paradas de escritura tan pronto como se han seleccionado 20 áreas de muestreo bien iluminada en el ROI. (A) Resumen de toda la zona de interés, delimitada por un polígono, con un alto número de áreas de muestreo posibles marcados con x. (B) detalle de A que muestra las áreas de muestreo antes de selección al azar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> Figura 4. Ejemplo de adquisición elemental mapa (EFTEM). (A) micrografía TEM de campo brillante de área alrededor punto de adquisición. El área seleccionada al azar se utilizó para obtener un mapa elemental y se caracteriza por un rectángulo negro. (B) EFTEM borde la imagen de ventana en el área seleccionado al azar. (C) EFTEM borde posterior imagen de ventana en la misma zona. (D) mapa Elemental de hierro de la misma zona (M-edge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Se introduce un nuevo flujo de trabajo para investigaciones de microscopia electrónica del tejido de cerebro. El método permite al usuario examinar características neuronales de una manera imparcial. Para el análisis elemental, también presentamos un script que automatiza la mayor parte del flujo de trabajo para el muestreo al azar.

Un enfoque imparcial del muestreo secciones TEM en Neurociencia

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Un protocolo de muestreo imparcial es vital para la microscopía electrónica. Si desea cuantificarlo sobre la densidad numérica de las sinapsis u otras estructuras en un área cerebral determinada, la principal ventaja de nuestra técnica es que es imparcial, y permite producir automáticamente micrografías electrónicas con una mínima intervención del usuario. Esta técnica también es valiosa en otras áreas de investigación, como la neurociencia, donde se puede utilizar en la evaluación de la fuerza de una red neuronal.Para aplicar nuestro protocolo, es necesario tener experiencia en técnicas microscópicas electrónicas, como la preparación de muestras y el funcionamiento de un microscopio electrónico de transición. Stefan Wernitznig, un post-doc de mi laboratorio. Este protocolo consiste en preparar muestras cerebrales para la microscopía electrónica, cortando pares de secciones delgadas.A continuación, describirá cómo producir automáticamente un número definido de micrografías electrónicas en un área de interés. A continuación, utilizará un marco de recuento para evaluar la densidad numérica de las entidades estructurales. Para comenzar, diseccionar, fijar, corregir e incrustar muestras de interés en la incrustación de resina siguiendo junto con el protocolo de texto adjunto.A continuación, coloque la muestra en un ultramicrotoma y produzca secciones seriales ultradelgadas de 55 nanómetros. Coloque las secciones en una rejilla de ranura con las dimensiones de un milímetro por dos milímetros, recubiertas con forma de piola. A continuación, contrarresta las secciones ultra delgadas en las rejillas de ranura utilizando 2%acetato de uranilo durante 30 minutos, seguido de citrato de plomo durante 30 segundos a temperatura ambiente.Coloque la rejilla en el TEM y examine las secciones de la cuadrícula con el TEM utilizando un aumento bajo para orientar y evaluar la calidad de las secciones. A continuación, inicie el software TEM Serial Section, seleccione Sección y elija Insertar para agregar los puntos de esquina para la sección de referencia y búsqueda. Siga las instrucciones de la ventana emergente.Comience con la sección de referencia y, a continuación, continúe con la sección de búsqueda. Asegúrese de que los bordes de la sección son paralelos a la siguiente sección, ya que se introducen los puntos uno y dos. A continuación, visualice la sección de referencia en baja ampliación para identificar la región de interés.Mueva la etapa del microscopio utilizando el análisis de imágenes TEM en la sección de referencia a varios puntos de esquina del ROI para crear un esquema del ROI. Registre las coordenadas del polígono resultante utilizando el software Random Point Sampling. Para ello, presione Agregar coordenadas en el cuadro de diálogo del software Muestreo de puntos aleatorios en cada punto del polígono que sea necesario para delinear el ROI en la sección.A continuación, defina e introduzca un tamaño adecuado para las áreas de muestreo y las distancias entre las áreas en el software de muestreo de puntos aleatorios. A continuación, presione Calcular ráster para generar coordenadas de forma sistemática, uniforme y aleatoria para las posiciones del micrográfico dentro del polígono. Almacene los puntos de muestreo en las secciones de referencia y búsqueda, utilizando el software Random Point Sampling y el software TEM Serial Section.Estas son las coordenadas de los montajes que se registran después. En el software Random Point Sampling, pulse ir a la siguiente posición para mover la etapa del microscopio a las coordenadas x y de cada área de muestreo en la sección de referencia. A continuación, seleccione Ubicación y elija Insertar para importar estas coordenadas en el software TEM Serial Section en la sección de referencia.Repita esto para todas las coordenadas. Para reflejar las coordenadas de la sección de referencia en la sección de búsqueda, seleccione Sección y elija Ir a sección. Introduzca el número de la sección de búsqueda en la ventana de diálogo.Para la grabación de los montajes, cambie entre la sección de referencia y búsqueda, como se describió anteriormente, y cambie la posición en la sección de referencia con ubicación y vaya al número. Elija la siguiente coordenada en la ventana de diálogo. Para los montajes de SerialEM, en cada coordenada de muestreo, vaya a Archivo y elija Nuevo montaje en el menú desplegable.Seleccione el número correcto de teselas y el porcentaje de superposición en la ventana de diálogo. Para el presente estudio, un aumento de 5000 es suficiente para reconocer las características sinápticas en el estudio. Pero el campo de visión limitado de la cámara CCD requería hacer montajes de dos por dos imágenes.Los montajes están hechos para SerialEM. Antes de grabar cada montaje, reajuste el enfoque o active la opción de enfoque automático en el software de grabación. Elija la carpeta para guardar el archivo de montaje e inicie la grabación del montaje pulsando Inicio en el submenú de montaje, a la izquierda en SerialEM.Inicie el microdissector y defina el tamaño del marco de recuento y el número de segmentos según sea necesario. Cuente la densidad de la sinapsis utilizando la macro de dissector. Con la herramienta multipunto ubicada en la barra de herramientas, limite las sinapsis que se intersecan con las dos líneas prohibidas del dissector, pero cuente las sinapsis en las líneas de aceptación opuestas.Marque cada sinapsis dentro del marco de recuento que esté visible en la sección de referencia, pero no visible en la sección de búsqueda, con una selección ovalada. Para medir los parámetros de la sinapsis, seleccione solo las sinapsis con una hendidura sináptica orientada en sección transversal que se encuentra en la sección de referencia. Esto debe estar dentro de los mismos marcos de imagen utilizados para el dissector.A continuación, vaya a Plugins y luego a Analizar e inicie el plugin ObjectJ desde el menú desplegable. Abra un nuevo proyecto desde el cuadro de diálogo desplegable ObjectJ que abrirá una ventana que permite al usuario esbozar y marcar estructuras con la herramienta de marcador. En primer lugar, utilice la herramienta de marcador para medir la longitud de la membrana presináptica y la longitud de densidad postsináptica dibujando una línea a lo largo de la estructura.A continuación, obtenga el ancho medio de la hendidura sináptica dibujando un polígono, cubriendo tanto la membrana pre y post-sináptica. Para determinar el número de vesículas acopladas, cuente todas las vesículas que tengan una distancia máxima de la membrana presináptica de un diámetro de vesícula o menos. A continuación, determine el número de vesículas desacopladas contando las vesículas con una distancia máxima de un diámetro de vesícula desde vesículas ancladas u otras vesículas desacopladas en la misma sinapsis.Una versión adaptada del protocolo permite análisis elementales en ubicaciones obtenidas de forma imparcial dentro de la sección ultra delgada. Para ello, en el modo de imagen TEM, inicie SerialEM y abra un nuevo proyecto. A continuación, abra el Navegador y compruebe la configuración de la cámara en los controles de cámara y script para ver y grabar e iniciar vista.Para crear un mapa de esquina de la sección ultra delgada, elija Agregar puntos en la ventana Navegador. A continuación, establezca los puntos de esquina en los bordes de una sección ultra delgada. Mueva el escenario a un punto de esquina manteniendo pulsada la tecla derecha del ratón.Cuando se alcance una esquina de la sección, agregue un punto de esquina con un clic izquierdo del ratón. Repita el procedimiento para agregar tres puntos de esquina más. Asegúrese de que en la ventana Navegador, la casilla C para los puntos de esquina esté marcada para los puntos almacenados.Para iniciar el montaje de esquina, vaya a Navegador en la barra de menús de SerialEM y elija Cuadrículas de montaje y Montaje de esquina de configuración en el menú desplegable. Elija Agregar polígono en la ventana Navegador y delinee la región de interés con varios clics derecho del ratón. A continuación, elija Añadir cuadrícula de puntos en el menú desplegable Navegador y defina una distancia entre los puntos.Inicie el script EFTEMSerialEM, siga los comandos de script, introduzca el número de puntos de cuadrícula como se muestra en el Navegador e introduzca el número de puntos de adquisición. A continuación, establezca el umbral de iluminación para que el script pueda evitar las barras de cuadrícula. Siga los comandos de script y mueva la etapa manualmente para cubrir el campo de visión en un cuarto de la barra de cuadrícula.Según el valor mostrado, introduzca un valor de iluminación de umbral superior al valor mostrado. Espere hasta que se seleccionen los puntos para la adquisición y finalice la rutina de cocción. Esto toma mucho tiempo y se puede hacer de la noche a la mañana.Después de configurar el análisis elemental TEM filtrado por energía, adquiera un mapa elemental con ajustes específicos del elemento. El enfoque de muestreo imparcial es útil para contar y analizar características sinápticas en regiones cerebrales específicas. Además, el script EFTEMSerialEM para el software SerialEM permite elegir aleatoriamente los puntos de adquisición dentro de una sección completamente ultra delgada, con el objetivo de obtener un micrografo electrónico filtrado por energía en cada uno de estos puntos.El script seleccionó aleatoriamente una serie de puntos, predefinidos por el usuario de los marcados con una calificación. Al producir un micrográfico de prueba y comprobar sus niveles de grado, el script comprobó si los puntos elegidos estaban situados en una parte visible de la sección, rechazando los puntos que aterrizaron en las barras de cuadrícula. La mayor parte del flujo de trabajo se controló mediante el script, con una interacción mínima del usuario.Sin embargo, con la muestra mostrada aquí, había muy poca luz para la rutina de enfoque automático de SerialEM. Por lo tanto, tan pronto como el script movió la etapa a cada punto, el enfoque se ajustó y se hizo un mapa elemental de hierro. Es importante seleccionar cuidadosamente la región de interés y asegurarse de que el mismo número de puntos de muestreo cae en cada área de interés.No olvide que muchos de los productos químicos utilizados para la preparación de muestras son tóxicos. Así que use una bata de laboratorio y guantes de protección y trabaje bajo una cubierta de humos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

Relacionados con eventos de alta densidad de adquisición de datos posibles en Neurociencia Cognitiva

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Investigación

Neurociencias

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Los análisis morfométricos de las Secciones de retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos