Name: an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience at JoVE.com

Finansieras av det österrikiska Science fond, FWF, projektnumret P 29370 B27

<ol>
	<li>Howard, V., Reed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , (1998).</li><li>Nakamura, H., Kobayashi, S., Ohashi, Y., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-changes+of+brain+synapses+and+synaptic+plasticity+in+response+to+an+enriched+environment.">Age-changes of brain synapses and synaptic plasticity in response to an enriched environment.</a> Journal of Neuroscience Research. 56 (3), 307-315 (1999).</li><li>Landers, M. S., Knott, G. W., Lipp, H. P., Poletaeva, I., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+in+adult+barrel+cortex+following+naturalistic+environmental+enrichment.">Synapse formation in adult barrel cortex following naturalistic environmental enrichment.</a> Neuroscience. 199, 143-152 (2011).</li><li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+unbiased+counting+method+for+the+quantification+of+synapses+in+the+mouse+brain.">A novel unbiased counting method for the quantification of synapses in the mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 240, 13-21 (2015).</li><li>Reichmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+induces+behavioural+disturbances+in+neuropeptide+Y+knockout+mice.">Environmental enrichment induces behavioural disturbances in neuropeptide Y knockout mice.</a> Scientific Report. 6, 28182 (2016).</li><li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Tissue+Samples+from+the+Placenta:+An+Illustration+of+Principles+and+Strategies.">Taking Tissue Samples from the Placenta: An Illustration of Principles and Strategies.</a> Placenta. 29, 1-14 (2008).</li><li>Ferguson, S., Steyer, A. M., Mayhew, T. M., Schwab, Y., Lucocq, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Golgi+structure+using+EM:+combing+volume-SEM+and+stereology+for+higher+throughput.">Quantifying Golgi structure using EM: combing volume-SEM and stereology for higher throughput.</a> Histochemistry and Cell Biology. 147, 653-669 (2017).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> Journal of Microscopy. 134 (2), 127-136 (1984).</li><li>Gundersen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+stereological+tools:+disector,+fractionator,+nucleator+and+point+sampled+intercepts+and+their+use+in+pathological+research+and+diagnosis.">The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis.</a> APMIS. 96 (10), 857-881 (1988).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).</li><li>Lewis, P. R., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Staining Methods for Sectioned Material. , (1988).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Rampon, C., Tang, Y. P., Goodhouse, J., Shimizu, E., Kyin, M., Tsien, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+induces+structural+changes+and+recovery+from+nonspatial+memory+deficits+in+CA1+NMDAR1-knockout+mice.">Enrichment induces structural changes and recovery from nonspatial memory deficits in CA1 NMDAR1-knockout mice.</a> Nature Neuroscience. 3 (3), 238-244 (2000).</li><li>Xu, X., Ye, L., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+enrichment+induces+synaptic+structural+modification+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats.">Environmental enrichment induces synaptic structural modification after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 234 (3), 296-305 (2009).</li><li>Lonetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+environmental+enrichment+moderates+the+behavioral+and+synaptic+phenotype+of+MeCP2+null+mice.">Early environmental enrichment moderates the behavioral and synaptic phenotype of MeCP2 null mice.</a> Biological Psychiatry. 67 (7), 657-665 (2010).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Det arbetsflöde som presenteras här kan forskaren få data på ultrastrukturella funktioner på ett opartiskt sätt. Detta är mycket mindre tidskrävande än volym utredningar från seriell avsnitt. Flera olika program används för att uppnå detta mål. Först används vår skräddarsydda RPS -programvara (för information om tillgänglighet, vänligen kontakta motsvarande författare) för att införa en slumpmässig scenen-shift för att välja provtagnings området koordinaterna. Detta tillåter en systematisk enhetliga stickprov av ROI. Nästa, för räkning av särskilda strukturer, vi anpassade den disector metoden, där 2 på varandra följande sektioner med känd distans jämförs, på ett nytt sätt jämfört med tidigare studier13,14,15 som vi använde våra skräddarsydda RPS programvara för systematisk enhetliga stickprov. Detta sparar tid jämfört med 3D-rekonstruera hela volymer från seriell avsnitt. Skräddarsydda RPS programvaran är speciellt utvecklat för en typ av Mikroskop som är en begränsande faktor för återgivning av arbetsflödet. Ett alternativ från denna specifika programvara skulle vara ett program som tillåter skriptkörning och är kompatibel med andra Mikroskop modeller.
Vi har framgångsrikt använt denna metod för vår jämförande studier4,5. På ultra-tunn sektioner av neuronal vävnad, området av intresse skissades och bilder togs av systematisk enhetliga stickprov inom detta område. Det måste noteras att området av intresse, polymorph lagret av dentate gyrus, är ett ganska litet område att undersöka vilket kan vara fördelaktigt för vår strategi. Inom ett slumpmässigt placerade disector, vi utvärderat antalet DCV och flera ultrastrukturella funktioner av synapser i DGpl av vuxna möss inrymt i SE och EE samt vuxen WT möss kontra vuxna NPY knockoutmöss. Insamlade data med våra förhållningssätt, och visade förändringar i några av de undersökta parametrarna. Fynden bekräftade de från andra liknande studier på unga djur2.
En nackdel med den experimentella användningen av detta arbetsflöde kan vara att denna multi-application-strategi inte är perfekt när det gäller användarvänlighet, eftersom användarna måste få bekväm med olika användargränssnitt (i vårt fall, användargränssnittet, TEM seriell avsnitt RPS programvaran och SerialEM programvara). Lära sig att hantera alla ansökningar på ett effektivt sätt är tidskrävande och bör beaktas. Investera tid i att lära sig att använda det här arbetsflödet är dock fortfarande klart gynnsamt under den tid som behövs för att analysera hela volymer med seriell avsnitt TEM. Metoden att använda en disector som placeras genom systematisk enhetliga stickprov i området av intresse är tillräckligt att presentera tillförlitlig data1 utan att behöva undersöka en hög mängd sektioner/volym.
För att maximera resultatet i våra studier, var det viktigt att ta god vård under Provberedning, som bevarandet av vävnaden och strukturer inte är bara avgörande för att utvärdera strukturella funktioner, men också för att identifiera det intresse otvetydigt. En avgörande faktor, och kanske en annan nackdel med denna metod, är att det krävs en hög kvalitet på ultra tunna snitt par: det måste finnas några hål eller rynkor som täcker området under utredning i någon av punkterna och snittjockleken måste vara underhålls homogen. Forskaren måste vara välutbildade i ultramicrotomy. Vård har också vidtas när imaging avsnitten i TEM, eftersom avsnitten är känsliga för electron beam skador och kan enkelt riva isär. Dessutom är det viktigt att välja rätt antal provtagning områden i ROI. Beroende på syftet experimentella måste förstoringen av elektronmikrografier ställas in noggrant. För våra experiment specifikt är räknar synapser i centrala nervsystemet, 20 regioner av intresse på ett avsnitt med området av 30.25 µm2 optimal. Det rekommenderas att utbilda personal väl i erkänner funktionerna som är i fråga (i vårt fall synapser, synaptic funktioner och DCV) att få tillförlitliga resultat. För att identifiera synapser, de synaptiska vesikler måste vara identifierbar och detta kräver en upplösning på minst 10 nm. För detta, en förstoring på 5000 X var optimal, men det måste noteras att förstoringen beror på hårdvara parametrar såsom typ och position av kameror och skulle behöva anpassas för andra Mikroskop eller kamera typer. Det måste också noteras att protokollet använder program som är specifika för en TEM och att användare med andra modeller har att beakta skillnaderna i installationen.
Vi tror att vårt arbetsflöde kan anpassas för många andra tillämpningar inte bara i neurovetenskap men i ett brett fält av biologisk vetenskap och även materialvetenskap (när den höga upplösningen av en TEM behövs) närhelst forskningsfrågan kräver en systematisk uniform stickprov och antalet prover som skall undersökas frågar efter en tid effektivt sätt för analys. Vi är till exempel för närvarande intresserade lokalisera järnförråd i den mänskliga hjärnan. För detta har vi nyligen anpassat vårt arbetsflöde, om du vill aktivera elementaranalys på ultra-tunn sektioner i slumpvis utvalda områden. För att minimera antalet program som behövs för arbetsflödet, syftar vi till att tillämpas med hjälp av SerialEM-programvara bara, eftersom den kan programmeras att flytta scenen till förutbestämda punkter som kan väljas på ett slumpmässigt sätt. Vi skapade anpassade skript för att styra TEM, med målet att automatizing arbetsflödet helt. Detta visade sig vara genomförbart utom autofokus i filtrerade imaging läge, vilket inte ger tillfredsställande resultat. Vi använde därmed DM programvara för fokusering och för att få energi-filtrerad bilder.
Sammanfattningsvis presentera vi lösningar som hjälper att få elektronmikrografier på ett opartiskt sätt.

I elektronmikroskopi är det ofta utmanande att prova representativa regioner inom avsnitten. Vi, är som observatör ofta vinklade för att titta på specifika regioner dras till vår uppmärksamhet av iögonfallande funktioner av provet, hindrar en väl fördelad, opartisk provtagning. Provtagning bias kan endast undvikas om varje del av regionen av intresse får samma chans att hamna i en elektron mikrograf1. Det är möjligt att undvika provtagning partiskhet utan en programvarulösning, till exempel genom att trycka trackball av mikroskopet manuellt utan att titta på bilden, så välj provtagning regioner där scenen slutar. Men strängt taget, detta är inte ett slumpmässigt förfarande, eftersom, medvetet eller omedvetet, användaren kan påverka rörelsen av scenen, och, dessutom, detta är inte ett sofistikerat sätt att välja provtagning regioner. Slumpmässig provtagning blir särskilt viktigt om par sektioner används för att bedöma antalet strukturer i en viss volym, till exempel för stereology1, vilket kräver par sektioner, en känd sträcka apart. Det skulle också vara möjligt att bara titta på ett avsnitt och uppskatta antalet specifika strukturer2, men med detta synsätt utredare tenderar att överskatta den numeriska tätheten av större strukturer, om strukturer är mycket små i jämförelse till snittjockleken. Alternativa metoder är att rekonstruera volymer av vävnad från seriell sektioner och därmed få önskad data3. Men detta är mycket tidskrävande och inte en genomförbar strategi för (större) jämförande studier.
För att övervinna dessa problem, har vi utvecklat ett arbetsflöde som tillåter forskare att automatiskt välja prov för att erhålla elektronmikrografier på regelbundna avstånd inom ultratunn sektioner. Placera av elektronmikrografier är slumpmässig, så att opartisk provtagning. Metoden är lämplig både för att fastställa numeriska tätheter av strukturer (till exempel synapser inom en viss neuropil volym4,5) och måtten på strukturella funktioner (exempelvis bredden på den synaptiska spalten, (eller diametern på den postsynaptiska density4,5).
Arbetsflödet använder en skräddarsydd slumpmässig punkt provtagning (RPS) programvara (skriven i Java-skript som använder skript programvara medföljer våra Mikroskop) som automatiskt beräknar rutnät ståndpunkter inom ett fördefinierat område av intresse i en ultratunn avsnitt. RPS programvaran flyttar scenen av elektronmikroskopet till dessa fördefinierade punkter, så att en elektron mikrograf kan göras vid varje punkt. Användaren definierar först, en region av intresse inom avsnittet tunn. Därefter beräknar RPS programvaran rutnät ståndpunkter inom denna region. X / y-koordinaterna för den första positionen skapas slumpmässigt, och de resterande positionerna placeras regelbundet rutnät mellanrum i avseende till den första positionen. Eftersom varje del av regionen av intresse har samma chans att granskas, tillåter detta minimal datainsamling. Denna strategi för provtagning också kallas systematisk enhetliga stickprov (se referenser6,7 för mer detaljer).
För att fastställa den numeriska täthet av strukturer, arbetar vi med par av sektioner som är en känd sträcka apart. Efter att få en elektron mikrograf från det första avsnittet i en av de förutbestämda positionerna, flyttar TEM seriell avsnitt programvara (ingår i programpaketet medföljer våra elektronmikroskop) till motsvarande punkt i det andra avsnittet, för att få en elektron mikrograf av motsvarande plats. Detta upprepas för varje plats i rutnätet förutbestämd. I vår strategi används en disector att räkna antalet partiklar i varje par elektronmikrografier8,9. En disector består av ett par counting bågar, en för varje avsnitt8,9. Numeriska tätheten av objekt bestäms genom att bara räkna objekt synliga på första avsnittet (eller referensavsnitt) men inte på andra avsnittet (eller uppslag avsnitt). Detta tillåter för att uppskatta den numeriska täthet av objekt i en snabbt och effektivt sätt8,9. Dessutom på enstaka sektioner, kan tvådimensionell strukturella egenskaper mätas.
Vi har tillämpat detta arbetsflöde framgångsrikt för att bedöma skillnader i synapsen numrerar i hippocampus av möss som utsätts för syreberikad miljö (EE) boendeförhållanden jämfört med standard miljö (SE) bostäder villkor4,5, och även att utvärdera ultrastrukturella skillnaderna mellan vildtyp (WT) möss och neuropeptid Y (NPY) KO möss hålls under SE och EE5. Vårt mål var att titta specifikt på strukturella funktioner av nervceller, såsom numeriska synaptisk densitet, längderna av den aktiva zonen i tvärsnitt och postsynaptiska tätheten, bredden på den synaptiska spalten, och antalet synaptic vesicles, för att bedöma förändringar i neuronala connectivity och aktivering mellan de olika experimentella villkor. Dessutom var vi intresserade av numeriska tätheten av tät-core blåsor (DCV) i nervceller att bestämma mängden lagrade neuropeptider i ett visst hjärnområde.
Baserat på framgången för vår strategi för de studier som beskrivs ovan, på vårt nästa steg, har vi anpassat vårt arbetsflöde för att välja områden för opartisk elementära analyser inom mänskliga hjärnan prover. Detta gjordes till bild järn, som lagras i ferritin molekyler i både neuron och gliaceller. För detta sammanställt vi ett skript som tillät oss att automatisera de flesta åtgärder för en slumpmässig screening process av hjärnan delar i ett avgränsat område.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:611px;" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Pentobarbital</td>
			<td style="width:139px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:135px;">P3761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>1kg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutardialdehyde</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 16210</td>
			<td>25%; 100ml; EM grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cacodylate buffer</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C4945</td>
			<td style="width:167px;">250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Thionine acetate/Ceristain</td>
			<td>Merck</td>
			<td>861340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1000631000</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1064951000</td>
			<td>1 kg, pellets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">osmium tetraoxide</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E 19110</td>
			<td>10x1g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TAAB embedding resin</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAT001</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DMP-30</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD024</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">DDSA</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>TAD025</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uranyl acetate dihydrate</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>19481</td>
			<td>depleted, 25g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Ultrastain 2</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16707235</td>
			<td>Lead citrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Toluidine blue solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1727</td>
			<td>10g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pioloform</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1275</td>
			<td>10g Powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proylenoxide</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>82320-1L</td>
			<td>1L</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;">DPX embedding medium</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>R1320</td>
			<td style="width:167px;">embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vibratome, Leica VT 1000</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Leica Ultracut UCT, ultramicrotom</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tecnai G2 20</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:171px;">Megaview wide angle camera</td>
			<td>Olympus Soft Imaging Solution, M&#252;nster, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">US 1000 digital camera</td>
			<td>Gatan, Pleasanton, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEM Imaging Analysis Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FEI Serial Section Software</td>
			<td>FEI,Eindhoven, Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiji, ImageJ 1.52e</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPSS 20.0</td>
			<td>SPSS Inc., Chicago, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SerialEM</td>
			<td>Regents of the University of Colorado</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPS (random point sampling) software 0.9a</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disector v1.0.2 (ImageJ macro)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EFTEMSerialEM (SerialEM script)</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an unbiased approach of sampling tem sections in neuroscience

Utredningar av de ultrastrukturella funktionerna av nervceller och deras synapser är endast möjligt med elektronmikroskopi. Speciellt för jämförande studier av förändringar i densiteter och fördelningar av sådana funktioner är en opartisk provtagning-protokollet avgörande betydelse för tillförlitliga resultat. Här presenterar vi ett arbetsflöde för bild förvärv av hjärnan prover. Arbetsflödet kan systematisk enhetliga slumpmässig provtagning inom en definierad hjärnregionen, och bilderna kan analyseras med hjälp en disector. Denna teknik är mycket snabbare än omfattande undersökning av seriell avsnitt men fortfarande utgör en genomförbar strategi för att uppskatta de tätheter och fördelningar av ultrastruktur funktioner. Innan inbäddning användes färgade vibratome sektioner som referens för att identifiera hjärnregionen under utredning, som hjälpte påskynda den övergripande prov förberedelsen bearbeta. Denna metod användes för jämförande studier som undersöker effekten av en berikad-Boende miljö på flera ultrastrukturella parametrar i mus hjärnan. Baserat på den framgångsrika användningen av arbetsflödet, anpassade vi den för elementaranalys av hjärnan prover. Vi har optimerat protokollet när det gäller tidpunkten för användar-interaktion. Automatisera alla tidskrävande steg genom att sammanställa ett skript för öppen källkod SerialEM hjälper användaren att fokusera på det huvudsakliga arbetet att förvärva elementärt kartor. Liksom i det ursprungliga arbetsflödet uppmärksammade vi den opartiska urvalsmetod innebär att garantera tillförlitliga resultat.

Här beskriver vi ett arbetsflöde för att markera områdena för TEM i en automatisk och opartiskt sätt. Användaren väljer området av intresse inom en ultratunn avsnitt under TEM, och använder flera mjukvarulösningar för arbetsflödet inklusive vår RPS programvara som automatiskt beräknar koordinaterna för 20 provtagning områden inom området intresse. Sedan, TEM scenen flyttas till varje provtagningsområdet för fotografering. Detta är möjligt både för att analysera enstaka sektioner och för att analysera par sektioner, en känd sträcka isär, vilket gör att välja områden för avbildning utan bias av prövaren.
Detta arbetsflöde visade sig vara värdefull när dokumentera ultrastrukturella funktioner i mus hjärnan avsnitt4,5. I dessa studier undersöktes det polymorph celllagrar av dentate gyrus (DGpl) som ett område av intresse. Vår metod visat sig lämplig för att undersöka generaldirektoratet, eftersom en koronalt avsnitt dorsala GD (Bregma −1, 3) passar in i en ultratunn avsnitt och dess konturer redovisas lätt i låg förstoring. Om andra regioner i hjärnan skulle undersökas, skulle det vara viktigt att kontrollera deras storlek och utmärkande egenskaper innan du planerar experiment.
Tillämpa arbetsflödet beskrivs här visade att EE bostäder ökar bredden på den synaptiska spalten betydligt i DGpl4, i respekt för standard boendeförhållanden. Dessutom minskade antalet tät kärna blåsor betydligt EE-inrymt djur4, som anger förändringar i hushållet av neuropeptider. När WT och NPY knockoutmöss hölls EE villkor, ökade antalet nervceller/µm³ i DGpl medan tätheten av DCV minskat i förhållande till SE-bostäder5. Däremot resulterade NPY knockout i en betydande ökning av synaptiska vesikler i reserven poolen (fråndockade synaptiska vesikler) oberoende av bostäder villkor5. Effekten av EE på bredden på den synaptiska spalten återfördes i gruppen NPY KO vilket resulterar i en betydande skillnad mellan EE-inrymt WT och NPY KO möss5. Tillsammans med beteendemässiga studier av WT och NPY knockout djur som hölls under båda typerna av boendeförhållanden, detta indikerar en avgörande roll för NPY för neurobiologiska effekterna av EE5.
För att visualisera järn lagras i den mänskliga hjärnan, sammanställdes ett skript för SerialEM programvara för att slumpmässigt välja punkterna i förvärv från inom en hela ultrathin avsnitt, i syfte att erhålla en energi filtreras electron mikrograf på alla dessa punkter . Efter lastning avsnittet i elektronmikroskopet, manuset utförs stabiliseringen av avsnittet (dvs., rutinen 'specimen-matlagning') över natten. Skriptet sedan ut slumpmässigt ett antal punkter som fördefinierade av användaren från de markerade med ett galler i figur 3. Genom att producera en test mikrograf och kontrollera dess gråskalor, kontrolleras skriptet om de valda punkterna var belägna på en synlig del av avsnittet, att förkasta de punkter som landade på rutnätet barer. De flesta av arbetsflödet hanterades av skriptet med minimal interaktion med användaren. Dock var det inte möjligt att automatiskt registrera energi filtreras micrographs (med denna setup), som det fanns för lite ljus för rutinen autofokus av SerialEM. Därför bytte vi till DM programvaran så fort skriptet hade flyttat scenen till varje punkt, justerat fokus för hand, och gjort en EFTEM bild av järn. Ett exempel för en EFTEM järn bild från postmortala mänskliga hjärnan visas i figur 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> Figur 1. Illustration av arbetsflödet. (A) de viktigaste stegen i provberedningen visas (i pilens riktning): vibratome sektioner (i), embedding(ii), skära semi tunn och ultra-tunn sektioner (iii), och att fånga par ultratunn sektioner på koppar nät (iv). (B) användning av både Mikroskop leverantörens programvara och skräddarsydda RPS programvara skapa provtagning området koordinater som avgör inspelning webbplatser. Hörnpunkter av avsnitt lagras i programvaran Mikroskopi och ROI beskrivs (identifieras med hjälp av avsnitten semi tunna) (i); ett rutnät med provtagning områden genereras över ROI, en slumpmässig förskjutning (röd pil) introduceras i x och y. Skiftet är mindre än avståndet mellan områdena provtagning, (svarta pilar), så att istället för de svarta rutorna, som har inga SKIFT, de blå fyrkanter, som skiftas slumpmässigt, används för att bestämma de inspelning webbplatserna (ii). endast provtagning områden inom gränsar av ROI (dragna som svart och blå fyrkanter) används för inspelning. Micrographs görs både i referensavsnittet (svarta fyrkanter) och i motsvarande platser i avsnittet sökning (blå fyrkanter) (iii). (C) en mikrograf görs vid varje provtagning område vid tillräcklig förstoring; ett montage som består av flera sammanfogade bilder görs vid behov (i detta fall, 2 x 2 bilder slogs tillsammans) (i); en inventering bildruta genereras och visas som en överlagring i bilden, strukturer inom ramen och på 'Accept linjer' (streckad ram linjer) kommer att räknas, men inte de på 'förbjudna linjer' (fast ram linjer) (ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> Figur 2 . Mäta ultrastrukturella parametrar på ett par ultra tunna snitt med en opartisk counting ram. (A) översikt av ImageJ windows används för att räkna och analysera cellulära strukturer. Vänster sida visar den elektron Mikrofotografi med counting ramen som ett överlägg. Till höger: ImageJ användargränssnittet (blå rektangel) med droppa-ned menyn (överst) och verktygsfältet (nedan); ObjectJ Objektredigerare (grön rektangel); fönstret ObjectJ verktyg (orange rektangel) där verktyg för att mäta kan väljas och fönstret ObjectJ resultat (svart rektangel) där alla mätningar dokumenteras. (B) detalj från en visar de markerade synapserna på den elektron mikrograf (synapser på båda delar - pilar, synaps endast på uppslag avsnitt-pilspetsar). De är märkta med Multipoint-verktyget (röd cirkel) i verktygsfältet i ImageJ. (C) namn och mäta parametrar synaptic funktioner definieras med hjälp av ObjectJ verktyg. Markör-verktyg och funktionen av intresse väljs och kontur dras in bilden av vänster-klick längs struktur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> Figur 3. Välja provtagning områden för elementär kartläggning inom en ROI för energi filtreras transmissionselektronmikroskopi. SerialEM används för att markera ett område av intresse och föreslå ett stort antal provtagning områden på en vanlig avstånd (rosa korsar i bilder A och B). Ett skript väljer sedan slumpmässigt stickprov områden (från dessa fördefinierade koordinater) för förvärv. Provtagning områden med dålig belysning avvisas för att undvika rutnätet barer och skriptet stannar så snart 20 väl belysta provtagning områden har valts inom ROI. (A) översikt över hela området av intresse, beskrivs av en polygon, med ett stort antal möjliga provtagning områden markerade med X. (B) detalj av A visar områdena provtagning innan slumpmässigt urval. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> Figur 4. Exempel på elementär karta (EFTEM) förvärv. (A) ljusa fält TEM mikrograf av området kring förvärvet punkt. Ett slumpmässigt valt område användes för att få en elementär karta och är markerad med en svart rektangel. (B) EFTEM pre kant fönster bild gjort under slumpmässigt utvalda området. (C) EFTEM efter kant fönster bild gjord på samma område. (D) elementär karta av järn i samma område (M-edge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience at JoVE.com

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Vi introducerar ett nytt arbetsflöde för elektronmikroskopi utredningar av hjärnvävnad. Metoden tillåter användaren att undersöka neuronala funktioner på ett opartiskt sätt. För elementaranalys presenterar vi också ett skript som automatisk de flesta av arbetsflödet för randomiserade provtagning.

En förutsättningslös strategi för provtagning TEM sektioner i neurovetenskap

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Ett förutsättningssökt provtagningsprotokoll är livsviktigt för elektronmikroskopi. Om du vill kvantifiera det på numerisk täthet av synapser eller andra strukturer i ett visst hjärnområde, är den största fördelen med vår teknik att den är opartisk, och gör det möjligt att automatiskt producera elektronmikrografer med minimal användarintervention. Denna teknik är också värdefull inom andra forskningsområden, såsom neurovetenskap, där den kan användas vid bedömning av styrkan i ett neuralt nätverk.För att tillämpa vårt protokoll är det nödvändigt att ha erfarenhet av elektronmikroskopiska tekniker, såsom provberedning och drift av ett övergångselektronmikroskop. Demonstrera vårt förfarande kommer att Dr.Stefan Wernitznig, en post-doc från mitt laboratorium. Detta protokoll består av att förbereda hjärnan prover för elektronmikroskopi, skära par av tunna sektioner.Därefter kommer det att beskriva hur man automatiskt producerar ett definierat antal elektronmikrografer inom ett område av intresse. Sedan kommer det att använda en räkna ram för att bedöma den numeriska densiteten av strukturella funktioner. Till att börja dissekera, åtgärda, efterfixera och bädda in exempel av intresse i inbäddning harts genom att följa tillsammans med det medföljande textprotokollet.Placera sedan provet på en ultramicrotome och producera 55 nanometer ultra tunna seriesektioner. Placera sektionerna på ett fackgaller med måtten en millimeter med två millimeter, belagda med piolaform. Sedan räknar de ultratunna sektionerna på kortplatsruttarna med 2%uranylacetat i 30 minuter, följt av blycitrat i 30 sekunder vid rumstemperatur.Placera gallret i TEM och undersöka avsnitten på rutnätet med TEM med hjälp av en låg förstoring för att orientera och utvärdera kvaliteten på avsnitten. Sedan startar du programvaran TEM Serial Section, välj Avsnitt och välj Infoga för att lägga till hörnpunkterna för referens- och uppslagsavsnittet. Följ instruktionerna från popup-fönstret.Börja med referensavsnittet och fortsätt sedan med uppslagsavsnittet. Se till att sektionens kanter är parallella med nästa avsnitt, eftersom punkt ett och två matas in. Nästa visualisera referensavsnittet under låg förstoring för att identifiera regionen av intresse.Flytta mikroskopet scenen med hjälp av TEM bildanalys på referensavsnittet till flera hörnpunkter i avkastningen på investeringen för att skapa en disposition av avkastningen på investeringen. Registrera koordinaterna för den resulterande polygonen med hjälp av Random Point Sampling programvara. För detta trycker du på Lägg till koordinater i dialogrutan för programvaran Random Point Sampling vid varje punkt i den polygon som behövs för att skissera roi-investeringen i avsnittet.Nästa definiera och ange en lämplig storlek för provtagning områden och avstånd mellan områdena i Random Point Sampling programvara. Tryck sedan på Beräkna raster för att generera koordinater på ett systematiskt, enhetligt, slumpmässigt sätt för mikrografens positioner inom polygonen. Lagra provtagningspunkterna på referens- och uppslagssektionerna, med hjälp av programvaran Random Point Sampling och programvaran TEM Serial Section.Dessa är koordinaterna för de montage som spelas in efteråt. I programvaran Random Point Sampling trycker du på gå till nästa position för att flytta mikroskopstadiet till x-, y-koordinaterna för varje provtagningsområde i referensavsnittet. Sedan väljer du Plats och väljer Infoga för att importera dessa koordinater i programvaran TEM Serial Section i referensavsnittet.Upprepa detta för alla koordinater. Om du vill spegla koordinaterna från referensavsnittet på uppslagsavsnittet väljer du Avsnitt och väljer Gå till Avsnitt. Ange nummer för uppslagsavsnittet i dialogfönstret.För inspelningen av montagen växlar du mellan referens- och uppslagsdelen, enligt beskrivningen tidigare, och ändrar placeringen på referensavsnittet med plats och går till nummer. Välj nästa koordinat i dialogfönstret. För SerialEM-montagena, vid varje samplingskoordinat, gå till Arkiv och välj Nytt montage från rullgardinsmenyn.Välj rätt antal paneler och procent av överlappningen i dialogfönstret. För den föreliggande studien är en förstoring på 5000 tillräcklig för att känna igen synapsfunktionerna på studien. Men det begränsade synfältet för CCD-kameran krävs gör montage av två av två bilder.Montagena är gjorda till SerialEM. Innan du spelar in varje montage, justera fokus eller aktivera alternativet auto fokus i inspelningsprogramvaran. Välj mapp för att spara montagefilen och starta inspelningen av montaget genom att trycka på Start i undermenyn montage, till vänster i SerialEM.Starta mikrodissector och definiera storleken på räkna ramen och antalet segment efter behov. Räkna synapsdensiteten med hjälp av dissekatormakron. Med hjälp av multipunktsverktyget som finns i verktygsfältet begränsar du de synapser som skär varandra med dissekatorens två förbjudna linjer, men räknar synapser på de motsatta acceptanslinjerna.Markera varje synaps inom räkneramen som syns i referensavsnittet, men som inte syns i uppslagsdelen, med en oval markering. För mätning av synapsparametrar väljer du endast synapserna med en synaptisk kluven orienterad i tvärsnitt som finns på referenssektionen. Detta bör vara inom samma bildramar som används för dissekator.Därefter går du till Plugins och sedan till Analysera och starta plugin ObjectJ från rullgardinsmenyn. Öppna ett nytt projekt från den nedrullningsdroppade objektj som kommer att öppna ett fönster som gör att användaren kan skissera och markera strukturer med markörverktyget. Använd först markörverktyget för att mäta längden på pre-synapsmembranet och postsynaptisk densitetslängd genom att dra en linje längs strukturen.Därefter, erhålla medelvärdet bredden av synaptiska spalten genom att dra en polygon, som täcker både pre-och post-synaptiska membranet. För att bestämma antalet dockade vesiklar, räkna alla vesiklar som har ett maximalt avstånd från pre-synaptiska membranet av en vesikeldiameter eller mindre. Därefter, bestämma antalet avdockade vesiklar genom att räkna vesiklarna med ett maximalt avstånd av en vesikeldiameter från dockad eller andra avdockade vesiklar vid samma synaps.En anpassad version av protokollet tillåter elementära analyser på förutsättningsseringsvis erhållna platser inom den ultratunna sektionen. För detta, i TEM imaging-läge, starta SerialEM och öppna ett nytt projekt. Öppna sedan Navigatorn och kontrollera inställningarna för kameran i kamera- och skriptkontroller för visning och spela in och starta vy.Om du vill göra en hörnkarta över det ultratunna avsnittet väljer du Lägg till punkter i Navigator-fönstret. Ställ sedan in hörnpunkterna i kanterna på en ultratunn sektion. Flytta scenen till en hörnpunkt genom att hålla ned höger mustangent.När ett hörn av avsnittet nås lägger du till en hörnpunkt med vänster musklickning. Upprepa proceduren för att lägga till ytterligare tre hörnpunkter. Se till att i Navigator-fönstret kryssas rutan C för hörnpunkter för de lagrade punkterna.För att starta hörnmontaget, gå till Navigator i SerialEM-menyraden och välja Montaging Grids och Setup Corner Montage från rullgardinsmenyn. Välj Lägg till polygon i navigatorfönstret och dra kontur åt den region som är intresserad med flera höger musklick. Därefter väljer du Lägg till rutnät av punkter i nedrullningsdymen Navigator och definierar ett avstånd mellan punkterna.Starta SKRIPTET EFTEMSerialEM, följ skriptkommandona, ange antalet rutnätspunkter enligt navigatorn och ange antalet anskaffningspoäng. Ställ sedan in belysningströskeln så att skriptet kan undvika rutnätsstaplar. Följ skriptkommandona och flytta scenen manuellt för att täcka synfältet med en fjärdedel av rutnätsfältet.Ange ett tröskelvärde för tröskelvärde som är högre än det värde som visas enligt det visade värdet. Vänta tills poängen för förvärv har valts och tillagningsrutinen är klar. Detta tar lång tid och kan göras över natten.Efter inställning för energi-filtrerade TEM elemental analys, skaffa en elemental karta med element-specifika inställningar. Den opartiska provtagningsmetoden är användbar för att räkna och analysera synaptiska funktioner i specifika hjärnregioner. Dessutom, DEN EFTEMSerialEM skriften för den SerialEM mjukvaran tillåt en till tillfällig välja den punkt av förvärvande från inom en helhet ultra tunn avsnitt, med det syfte av skaffa en energi- filtrerat elektron micrograph på var av de här punkt.Skriptet valde slumpmässigt ett antal punkter, i förväg definierade av användaren från de som markerats med en gradering. Genom att producera en testmikrograf och kontrollera dess betygsnivåer kontrollerade manuset om de valda punkterna var placerade på en synlig del av avsnittet, och avvisade de punkter som landade på gallerstänger. Det mesta av arbetsflödet hanterades av skriptet, med minimal interaktion av användaren.Men med provet som visas här, det fanns för lite ljus för auto fokus rutin SerialEM. Så fort manuset flyttade scenen till varje punkt justerades därför fokus och en elementell karta gjordes av järn. Det är viktigt att noggrant välja ut den intresseområde och se till att samma antal provtagningspunkter hamnar på varje intresseområde.Glöm inte att många av de kemikalier som används för preparat av preparat av preparat av preparat av exemplar är giftiga. Så bär en labbrock och skyddshandskar och arbeta under ett rökskydd.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High Density Event-related Potential  Data Acquisition in Cognitive Neuroscience

High Density Händelse-relaterade Potentiella Datainsamling i kognitiv neurovetenskap

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is currently the standard method of evaluating brain function in the field of Cognitive Neuroscience, in part ...

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Dubbel Fluorescens På plats Hybridisering i Fresh Brain § §

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriska Analyser av näthinnans avsnitt

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, ett innovativt automatiserat strategi för ögonmuskelförlamningar analys

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: An<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Upptäckt av Axonally Lokaliserad mRNA i hjärnan sektioner Använda hög upplösning<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging strategi som bygger på Bioluminescent Kalcium indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

En strategi för att öka Justering och myelinisering av Dorsal Root ganglieneuroner

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo