Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

الكتاب يود أن يشكر هيلدبراند أرمين ونور الدين ديلا، توماس دريسيلهاوس ومارتن بارنيسكي لتوفير مواد المختبر الفضائي ومحطة. كان يدعمها العمل الأصلي على طريقة حصان طروادة زمالة بوستدوك ليوبولدينا وجبهة الخلاص الوطني المشروع IOS13-39229. وأيد SFB924 (مشاريع A14 و B14) من DFG العمل المعروضة في هذه المقالة.

1-بناء حصان طروادة مايديس u.
ملاحظة: انظر الشكل 1.
<ol><li>تضخيم جين للفائدة من الذرة كدنا استخدام الإشعال الخاصة بالجينات وتصحيح التجارب المطبعية بوليميريز الحمض النووي. استنساخ المنتج بكر الأولية وتحويل بنية كولاي اتباع الإرشادات الخاصة با...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

بحوث المحاصيل الحديثة تتطلب البروتوكولات للتحليل الجزيئي في الجينية ومستويات البروتين. الوصول الوراثية عن طريق التحول غير متاح أو غير فعال وتستغرق وقتاً طويلاً لمعظم أنواع المحاصيل مثل الذرة. وعلاوة على ذلك، الأدوات الوراثية الموثوقة، مثل نظم مراسل المروج نادرة، مما يجعل من الصعب ?...

الممرض بيوتروفيك مايديس Ustilago هو المسبّب ل مرض التفحم الذرة1. أنه يصيب جميع أجزاء الجوي من الذرة الناتج في الأورام الكبيرة التي تحتوي على جراثيم ميلانيزيد، أسود. على الصعيد العالمي، يقدر مايديس U. يسبب خسارة سنوية من حوالي 2 في المائة محصول الذرة، بينما تقدر الأورام كطعام شهي تذوقي في المكسيك. مصنع العدوى هو بدأها أبريسوريوم التي تفرز الإنزيمات ليسينج جدار الخلية لاختراق الطبقة الأولى من خلايا البشرة الذرة. من موقع إصابة الأولية، ينمو مايديس U. إينتراسيلولارلي وإينتيرسيلولارلي، وغزو الخلية واحد إلى اثنين طبقات كل يوم1،2. نتائج الإصابة بنجاح في تضخم النباتات التي تتحول إلى أورام مرئية إلى خمسة أيام بعد الإصابة1،،من34. خلال جميع مراحل العدوى، إينفاجيناتي الفطرية خيوط فطرية الغشاء الهيولى المصنع دون أي اتصال مباشر إلى1،السيتوبلازم المضيف2. أبوبلاسميك ضيق المساحة بين خيوط فطرية إصابة وغشاء البلازما النبات يعتبر الموقع المضيف/الممرض التفاعلية، وتسمى منطقة التفاعل بيوتروفيك. وللتغلب على نظام المناعة الفطرية النباتية، تفرز U. مايديس صفيف بروتينات المستجيب في منطقة التفاعل بيوتروفيك1. وتتخذ بعض المستجيبة بالخلايا النباتية، بينما البعض الآخر لا يزال في بيوتروفيك تفاعل المنطقة5،6،،من78. واحد أبوبلاستيك المستجيب هو UmPit2، الذي يتفاعل مع البروتياز أبوبلاستيك الذرة لمنع الإفراج عن الببتيد ZmZIP1 من زمبروزيب،أبوبلاستيك البروتياز النشاط9مما يشير إلى10.
على مدى العقود الماضية، U. مايديس أصبح ليس إلا نموذجا لعلم الوراثة الفطرية في تفاعل الكائنات الممرضة النباتية، ولكن أيضا أداة قيمة في مجال التكنولوجيا الأحيائية بسبب دورة الحياة مفهومة جيدا، سهولة الوراثية وتعبير مغايرة يفرز البروتينات11،،من1213. إشارات لإفراز البروتين التقليدية وغير التقليدية على حد سواء قد تم تحديد السماح بالتحكم في تعديلات بوستترانسلاشونال14. في الآونة الأخيرة، استخدمت U. مايديس كأداة حصان طروادة لدراسة صغيرة، ويفرز البروتينات الذرة في الموقع15. النهج حصان طروادة الذي استخدمت بنجاح لتحليل وظيفة البروتين الصغيرة، ويفرز ZmMAC1 التي تشارك في وضع العضو الذكرى. ZmMAC1 يدفع شعبة بيريكلينال pluripotent الخلايا ومواصفات مصير خلية من خلايا المنشأ حديثا15. بنفس الطريقة، كشف عن الوظيفة البيولوجية للذرة الببتيد المرتبط بالضرر ZmZIP1. مايديس U. إفراز الذرة ZmZIP1 أدت إلى إعاقة الورم تشكيل10. وهكذا، تمثل النهج حصان طروادة طريقا بديلة قيماً للبروتين في دراسات الموقع مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية التي لا لا تتطلب توليد خطوط تحويل الذرة مستقرة ولا تسلل الأنسجة مع هيتيرولوجوسلي أعرب عنه وتنقية البروتينات. على وجه الخصوص، استراتيجية حصان طروادة يتيح إفراز أي البروتين مغايرة في أبوبلاست الذرة والمقارنة المباشرة للمصابين مقابل الخلايا النباتية غير المصابة داخل النسيج نفسه.
هذا البروتوكول يوضح الخطوات الرئيسية لتوليد عبئا حصان طروادة مايديس الولايات المتحدة لدراسة وتين فائدة. كذلك يتضمن معلومات دقيقة عن إجراءات العدوى من ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة (أوراق الكبار، شرابات وآذان) مع مايديس شين، الذي شرط أساسي لدراسة وظيفة البروتين وتطور الإصابة الزمانية المكانية في هذه الأنسجة المستهدفة. أي مواصفات أخرى معين على الذرة الجينات التضخيم والمجهري تقنيات، التصوير منذ هذه الخطوات محددة الهدف وتعتمد على الصك. وهكذا، هذا البروتوكول هو موجهة إلى المستخدمين ذوي الخبرة من تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

مستوحاة من أسطورة حصان طروادة Homer´s، نحن هندسيا الممرض مايديس Ustilago توصيل البروتينات يفرزها إلى أبوبلاست الذرة التي تسمح بتحليل المظهرية المجراة في الذرة. هذا الأسلوب لا يعتمد على تحويل الذرة ولكن يستغل قدرات الافرازية من مسببات الأمراض وعلم الوراثة الميكروبية. هذه الوثيقة، فإنه يسمح تفتيش المجراة في تسليم البروتينات يفرزها مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية في أنواع مختلفة من مواقع الإصابة والأنسجة. يمكن استخدامها لعابر يكمل الذرة خسارة للدالة تعمل، لتوصيف وظيفيا نطاقات البروتين، لتحليل آثار البروتين خارج الهدف، أو لدراسة البروتين هدوئي الجرعة الزائدة، مما يجعله أداة قوية لاستراتيجية حصان طروادة دراسات البروتين في النظام محصول الذرة. ويتضمن هذا العمل بروتوكول دقيق بشأن كيفية توليد سلالة حصان طروادة تليها البروتوكولات العدوى موحدة لتطبيق هذا الأسلوب على ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة.

يتم استنساخ بنيات لإجراء التجارب على حصان طروادة U. مايديس إلى بلازميد ف p123أمpit2-سأمpit2-الجينات للاهتمام--متشيري--هكتار. الجين الذرة للفائدة هو تنصهر فيها مراسل مشري fluorescence وبيفرتون ها--الوسم. يتم التعبير عن الب...

Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

استخدام مايديس Ustilago كحصان طروادة "إيصال بروتينات الذرة في الموقع"

ويصف هذا العمل استنساخ عبئا مايديس Ustilago حصان طروادة لإيصال بروتينات الذرة يفرز في الموقع إلى ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة الذرة.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

إنّ تحري العمليات على مستويات الجينات والبروتينات أمر بالغ الأهمية في بحوث المحاصيل. نهجنا تمكن من فحص البروتينات المتاهة المفرزة مع أعلى دقة الزمانية المكانية في مختلف جوانب العدوى والأنسجة. تستكشف طريقة حصان طروادة قدرات إفرازية تلقائية مفيدة.أنه يتحايل على الوقت المستهلكة وتحدي التحولات المتاهة، ويسهل الدراسات التفصيلية على البروتينات المفرزة داخل appelplatz المتاهة. معلومات مفصلة عن العدوى السليمة من أوراق المتاهة المضافة، شرابات والأذن. ويظهر الدراسة الناجحة لتطور العدوى ووظيفة البروتين في الأنسجة المستهدفة.ومن خلال هذا الإجراء، ستكون إيزابيل فيدلر، وهي طالبة خرّج من المختبر. لبدء التجربة، خدش Eumadous من لوحة pediatr باستخدام ماصة معجنات معقمة. تلقيح 5 ملليلتر من المتوسط الخفيف YEPS مع Eumadous.تنمو الثقافة في 28 درجة مئوية، مع اهتزاز مستمر في 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي مزيج 900 ميكرولترات من ضوء YEPS الطازجة مع 100 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها. قياس OD-600 باستخدام ضوء متوسطة YEPS كفراغ في تحليل مقياس الطيف.تمييع ثقافة بين عشية وضحاها مع ضوء YEPS جديدة المتوسطة إلى OD-600 من 2. اسمحوا ثقافة تنمو في 28 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر في 200 دورة في الدقيقة، حتى تصل إلى منتصف مرحلة النمو سجل، المشار إليها من قبل OD-600 من 8 إلى 1.0. بعد الحضانة، حصاد الخلايا عن طريق الغزل لهم في 3000 مرات تشي لمدة 10 دقائق.تجاهل المُندفع. بعد ذلك ، قم بغسل كومة الخلية مرة واحدة مع حجم ثقافة 1 من DDH2O. تدور الخلايا في 3000 وقت تشي لمدة 10 دقائق وتجاهل افر.ثم, إعادة تعليق كومة الخلية بعناية في DDH2O, باستخدام ماصة زجاجية 20 ملليلتر. وبالتالي تعديل النهائي OD-600 إلى 3.0 لم مقايسة حصان طروادة أو 1.0 لتصنيف المرض. زراعة النباتات المتاهة إلى مرحلة من أوراق الكبار، حيث على الأقل ورقة 7 ينمو داخل ساق.بعد ذلك، نقل الثقافة Eumadous إلى حقنة 3 ملليلتر مع 20 قياس ثنائية واحد إبرة تحت الجلد. اضغط على ساق بعناية لتوطين الأنسجة الجذعية مرآة. يمكن تمييز قاعدة جذع المرآة بالانتقال من ساق أصعب إلى أنسجة أكثر ليونة.وضع علامة على جذع المرآة على الساق باستخدام القلم. حقن 1.5 ملليلتر من الثقافة Eumadous 1 سنتيمتر فوق الجذعية تبادل لاطلاق النار مرآة أو استنفرس مرآة الجذعية. بمجرد أن تصل نباتات المتاهة إلى مرحلة شرابة ، اضغط على الساق بعناية لتوطين شرابة في الساق.وضع علامة على طرف وقاعدة شرابة على الجذعية باستخدام القلم. نقل الثقافة Eumadous في حقنة 3 ملليلتر مع 20 قياس ثنائية واحد هدمة حقن ما مجموعه 1.5 ملليلتر من inoculum حول شرابة. لضمان التوزيع المتساوي للـ inoculum، ضع ببطء 5 ملليلترات في الطرف، الأوسط، وقاعدة شرابة مع علامة القلم.نقل الثقافة Eumadous في حقنة 3 ملليلتر مع 20 قياس ثنائية واحد إبرة تحت الجلد. حقن إبرة التلقيح في الفضاء بين أوراق قشر أعمق قدر الإمكان دون إصابة الأذن، ثم الافراج عن 1.5 ملليلتر من inoculum حول الأذن. بعد ذلك، قم بإزالة الحقنة والإبرة وتدليك الكوز بعناية لتوزيع محلول Eumadous بالتساوي.إسقاط 10 ميكرولتر من inoculum على لوحة الفحم PD أوجير. ثم احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 أيام. هيفا يفرز ZM Mach1 محاطة الفلورسنت وإشارة الكرز.في المقابل، لا تظهر الهزيمة غيرsecreting سوى إشارة الفلورسنت في السيتوبلازم الفطري. غير لائق تعريب شرابة أو توزيع غير متساو من inoculum يمكن أن يؤدي إلى شرابة غير المصابة أو عدوى جزئية فقط من شرابة مقارنة حتى التوزيع. منفردا المسببة للأمراض حصان طروادة سلالة SG-200، مثقف على أوجير الفحم PD، يشكل خيوط زغب أبيض على لوحة كما هو مبين.في حين أن سلالة Eumadous FB1 يتطلب التزاوج قبل تشكيل خيوط المعدية. بعد العدوى، يمكن تحليل الاستجابة المحتملة للعلامات بروتين الكبد حصان طروادة باستخدام طرق مختلفة بما في ذلك تقييمات المرض أو التصوير المجهري. بالنسبة للعديد من مسببات الأمراض ، فإن التحول والإفراز مفهومان جيدًا ويمكن استكشافهما بطريقة مماثلة.ولذلك، فإنها تمكن دراسة المضيف، والتي ليست عرضة للتحول.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

كانالوستومي كنهج العمليات جراحية لإيصال الأدوية المحلية إلى آذان الداخلية من الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

التصور الحجمية في الشجاعة القراد بالجامعة-جبل في الموقع التهجين

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

تهجين في الموقع كروميجيني في أداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة ذات الصلة بفيروس الورم الحليمي البشري

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...