Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella og Armin Hildebrand for at give plads og plante materiale, lab. Det oprindelige værk på metoden trojansk hest blev støttet af en Leopoldina postdoc stipendium og NSF projekt IOS13-39229. Det arbejde, der er præsenteret i denne artikel blev støttet af SFB924 (projekter A14 og B14) af DFG.

1. opførelse af en trojansk hest, U. maydis
Bemærk: Se figur 1.
<ol><li>Forstærke et gen af interesse fra majs cDNA ved hjælp af gen-specifikke primere og en korrekturlæsning DNA polymerase. Klone den primære PCR produkt og omdanne konstruktionen til E. coli efter leverandørens plasmid instruktioner. Kontrollér den korrekte gen af interesse sekvens af Sanger sekventering før brug for de næste skridt, kloning....

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

Moderne afgrøde forskning kræver protokoller for Molekylær analyse på genetiske og protein niveauer. Genetiske tilgængelighed via transformation er ikke tilgængelig eller ineffektive og tidskrævende for de fleste afgrøder arter såsom majs. Derudover er pålidelige genetiske værktøjer som promotor reporter systemer sparsomme, hvilket gør det vanskeligt at studere in situ protein funktion med høj spatiotemporelle opløsning på forskellige væv steder. Apoplastisk proteiner kan studeres ved infiltrati...

Biotrophic patogen Ustilago maydis er den udløsende agens af majs sjofelheder sygdom1. Det inficerer alle antenne dele af majs resulterer i store tumorer, der indeholder melanized, sort sporer. På det globale niveau skønnes U. maydis for at medføre et årligt tab på omkring 2% af majs udbytte, mens tumorer er værdsat som et gastronomisk delikatesse i Mexico. Plante infektion er initieret af en appressorium, der udskiller cellevæg lysing enzymer for at trænge ind på det første lag af majs epidermale celler. Fra en primær infektion websted, U. maydis vokser intracellulært og intercellularly, invaderer en til to celle lag hver dag1,2. Vellykket infektion resultaterne i anlægget hypertrofi, der forvandler til synlige tumorer på fem dage post infektion1,3,4. Alle infektion stadier invaginate svampe hyfer plante cytoplasma membran uden nogen direkte kontakt til værten cytoplasma1,2. Den stramme apoplasmic plads mellem de inficerer hyfer og plante plasmamembran anses for at være vært/patogen interaktivt site, kaldet zonen biotrophic interaktion. For at overvinde plante medfødte immunsystem, udskiller U. maydis et array af effektor proteiner i biotrophic interaktion zone1. Nogle effektorer er taget af planteceller, mens andre forbliver i biotrophic interaktion zone5,6,7,8. Én apoplastisk effektor er UmPit2, som interagerer med apoplastisk majs proteaser at forhindre frigivelse af signaling peptid ZmZIP1 fra ZmPROZIP af apoplastisk protease aktivitet9,10.
I de sidste årtier, U. maydis blev ikke kun en model for svampe genetik i plante-patogen interaktion, men også et værdifuldt redskab i bioteknologi på grund af en velforståede livscyklus, let genetiske tilgængelighed og Heterolog ekspression af udskilles proteiner11,12,13. Signaler til både traditionelle og utraditionelle protein sekretion har fastslået at tillade kontrol af posttranslationelle modifikationer14. For nylig, U. maydis var ansat som en trojansk hest værktøj til at studere små, udskilles majs proteiner i situ15. Den trojanske hest tilgang var med held bruges til at analysere funktionen af de små, udskilles protein ZmMAC1, der er involveret i anther udvikling. ZmMAC1 inducerer pluripotente celler og celle skæbne specifikation af de nydannede celler15periclinal deling. På samme måde, blev den biologiske funktion af den majs skader-associerede peptid ZmZIP1 afsløret. U. maydis secernerende majs ZmZIP1 resulterede i nedsat svulst dannelse10. Således, den trojanske hest tilgang repræsenterer en værdifuld alternativ rute til protein i situ studier med høj spatiotemporelle opløsning, der gør hverken kræver generation af stabil Majs transformation linjer eller væv infiltration med heterologously udtrykt og rensede proteiner. Navnlig gør den trojanske hest strategi udskillelsen af enhver heterolog protein i majs apoplast og direkte sammenligning af inficerede versus ikke-inficerede planteceller inden for det samme væv.
Denne protokol illustrerer de vigtigste trin for at generere en U. maydis trojansk hest stamme for at studere et protein af interesse. Det yderligere indeholder præcise oplysninger om infektion procedurer af tre forskellige majs vævstyper (voksne blade, kvaster og ører) med U. maydis, som er en forudsætning for at studere spatiotemporelle infektion progression og protein funktion i disse målvæv. Ingen yderligere specifikationer er givet på majs gen forstærkning og mikroskopisk billeddannelse teknikker, da disse trin er målet-specifikke og instrument-afhængige. Således, denne protokol henvender sig til erfarne brugere af standard molekylærbiologiske teknikker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Inspireret af Homer´s Trojan hest myte, vi manipuleret majs patogenet Ustilago maydis at levere udskilles proteiner i majs apoplast tillader in vivo fænotypiske analyser. Denne metode stole ikke på majs transformation men udnytter mikrobielle genetik og sekretoriske funktioner af patogener. Heri, det giver mulighed for inspektion af in vivo leveret udskilles proteiner med høj spatiotemporelle opløsning på forskellige former for infektion websteder og væv. Den trojanske hest strategi kan udnyttes til at forbigående supplere majs tab af funktion fænotyper, at funktionelt karakterisere protein domæner, analysere off target protein effekter eller studere onside protein overdosering, hvilket gør det til et kraftfuldt værktøj protein undersøgelser i majsen afgrøde system. Dette værk indeholder en præcis protokol om hvordan man kan generere en trojansk hest stamme efterfulgt af standardiserede infektion protokoller til at anvende denne metode til tre forskellige majs vævstyper.

Konstruktioner for U. maydis trojansk hest eksperimenter er klonet i plasmidet p123-PUmpit2-SpUmpit2-gen af interesse-mCherry-Ha. Majs-gen af interesse er sammenvoksede til en mCherry fluorescens reporter og en epitop HA-tag. Udtryk for fusion protein er under kontrol af U. maydis Umpit2 initiativtageren, som er specifikt aktiveret under infektion<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Ved hjælp af Ustilago maydis som en trojansk hest for i Situ levering af majs proteiner

Dette arbejde beskriver kloning af en Ustilago maydis trojansk hest stamme for in situ levering af udskilles majs proteiner i tre forskellige typer af majs væv.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Undersøgelse af processer på genetiske og protein niveauer er afgørende i afgrødeforskning. Vores tilgang muliggør inspektion af udskilles labyrint proteiner med højeste rumlige tidsmæssige opløsning på forskellige infektion sider og væv. Den trojanske hest metode udforsker nyttige automatiske sekretoriske kapaciteter.Det omgår tidskrævende og udfordrende labyrint transformationer, og letter detaljerede undersøgelser af udskilles proteiner i labyrinten appelplatz. Detaljerede oplysninger om korrekt infektion af tilsat labyrintblade, kvaster og øre. Og viser den vellykkede undersøgelse af infektion progression og protein funktion i målvævet.Demonstration af proceduren vil være Isabell Fiedler, en grad studerende fra laboratoriet. For at begynde forsøget, ridse Eumadous fra en pediatr plade ved hjælp af en steril pasteur pipette. Inokuler 5 milliliter YEPS Lysmedium med Eumadous.Dyrk kulturen ved 28 grader Celsius, med konstant rystelser ved 200 rpm i 16 timer. Den næste dag blandes 900 mikroliter frisk YEPS Light med 100 mikroliter af nattens kultur. Mål OD-600 ved hjælp af YEPS Light Medium som en tom i spektrofotometeranalysen.Fortynd natten kultur med frisk YEPS Light Medium til en OD-600 af 2. Lad kulturen vokse ved 28 grader Celsius med konstant rystelser ved 200 rpm, indtil den når midten log vækstfase, angivet ved en OD-600 på 8 til 1,0. Efter inkubationen høstes cellerne ved at dreje dem 3000 gange chi i 10 minutter.Kassér supernatanten. Vask derefter cellebunken én gang med 1 kulturvolumen DDH2O. Drej cellerne ved 3000 tid chi i 10 minutter og kassér supernatanten.Derefter re-suspendere cellen pilette omhyggeligt i DDH2O, ved hjælp af en 20 milliliter glas pipette. Derved justere den endelige OD-600 TIL 3,0 for en trojansk hest assay eller 1,0 for sygdom rating. Dyrk labyrintplanterne til en fase af voksne blade, hvor mindst blad 7 vokser inden for stilken.Dernæst overføres den eumadøse kultur til en 3 milliliter sprøjte med en 20 gauge bi en hypodermisk nål. Tryk stilken omhyggeligt for at lokalisere Mirror Stem Tissue. Bunden af Mirror Stem kan skelnes ved en overgang fra hårdere stilk til blødere væv.Marker spejlstammen på stilken ved hjælp af en pen. Injicer 1,5 milliliter eumadøs kultur 1 centimeter over Shoot Mirror Stem eller Blomsterstand Mirror Stem. Når labyrintplanterne når kvasterscenen, skal du trykke stilken omhyggeligt for at lokalisere kvasteren i stilken.Marker spidsen og bunden af kvasteren på stilken ved hjælp af en pen. Den eumadøse kultur overføres til en 3 millilitersprøjte med en 20 gauge bi en hypodermisk nål for at injicere i alt 1,5 milliliter af inokulummen omkring kvasten. For at sikre en lige fordeling af inokulumet skal du langsomt placere 5 milliliter på spidsen, midten og bunden af kvasteren markeret med pennen.Den eumadøse kultur overføres til en 3 millilitersprøjte med 20 gauge bi en hypodermisk nål. Inokuleringsnålen indsprøjtes så dybt som muligt uden at skade øret, og slip derefter 1,5 milliliter inokulumet omkring øret. Fjern derefter sprøjten og kanylen, og massér forsigtigt cob'en for at fordele Den Eumadous-opløsningen ligeligt.Drop 10 mikroliter inokulum på en PD trækostylteplade. Derefter inkuberes ved stuetemperatur i 2 dage. Hyphae udskiller ZM Mach1 er omgivet af fluorescerende og kirsebær signal.I modsætning hertil viser ikke-hemmelige hyphae kun fluorescerende signal i svampecytoplasmaet. Forkert kvast lokalisering eller ulige fordeling af inoculum kan resultere i ikke-inficeret kvast eller kun delvis infektion af kvast i forhold til jævn fordeling. Den solo patogene trojanske hest Progenester stamme SG-200, kulturperler på PD trækul snegl, danner hvide fnug filamenter på pladen som vist.Mens Eumadous stamme FB1 kræver parring før infektiøs glødetråd dannelse. Efter infektion, den mulige reaktion af tegn den trojanske hest leverprotein kan analyseres ved hjælp af forskellige metoder, herunder sygdom ratings eller mikroskopisk billeddannelse. For mange patogener, transformation og sekretion er godt forstået og kan udforskes på samme måde.Derfor gør de det muligt at studere værten, som ikke er modtagelige for transformation.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk Manipulation af afgroedesygdomme<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; At studere Fungal Biology og Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; Mutagenese af histon-gener i knopskydende gær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikation Timing ved hjælp af zebrafisk som en In Vivo modelsystem.

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy som en kirurgisk tilgang til lokale Drug Delivery indre ører af voksne og Neonatal mus

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering af mikrobiota i kryds tarme af hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Væv-specifikke miRNA udtryk profilering i mus hjerte sektioner ved hjælp af In Situ hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Kromogen in situ hybridisering SS et værktøj til HPV-relateret hoved-og hals kræftdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...