Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

De auteurs bedank Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella en Armin Hildebrand voor het verstrekken van lab ruimte en plant materiaal. Het originele werk op het paard van Troje-methode werd gesteund door een Leopoldina postdoc fellowship en NSF project IOS13-39229. Het werk gepresenteerd in dit artikel werd gesteund door SFB924 (projecten A14 en B14) van de DFG.

1. bouw een U. maydis paard van Troje
Opmerking: Zie Figuur 1.
<ol><li>Het versterken van een gen van belang van maïs cDNA met behulp van gen-specifieke primers en een corrigeren polymerase van DNA. Kloon van het primaire product van PCR en transformeren van de constructie in E. coli instructies van de leverancier van de plasmide. Controleer of het juiste gen van belang opeenvolging van Sanger sequencing prior te gebr...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

Moderne gewas onderzoek eist protocollen voor moleculaire analyse van genetische en eiwitniveaus. Genetische toegankelijkheid via transformatie is niet beschikbaar of inefficiënte en tijdrovende voor de meeste soorten van gewassen zoals maïs. Bovendien zijn betrouwbare genetische hulpmiddelen zoals promotor verslaggever systemen schaars is, waardoor het moeilijk is om te studeren in situ eiwitfunctie met hoge Spatio resolutie op verschillende weefsel sites. Die apoplastisch eiwitten kunnen worden bestudeerd do...

De biotrophic pathogen Ustilago maydis is de verwekker van de maïs smut ziekte1. Het infecteert alle luchtfoto delen van maïs resulterend in grote tumoren die melanized, zwarte sporen bevatten. Op mondiaal niveau, wordt U. maydis geraamd op een jaarlijks verlies van ongeveer 2% van de opbrengst van maïs, veroorzaken terwijl tumoren worden gewaardeerd als een gastronomische delicatesse in Mexico. Infectie van de plant wordt geïnitieerd door een appressorium die scheidt van de celwand lysing enzymen te dringen de eerste laag van maïs epidermale cellen. Van een primaire infectie site, U. maydis groeit intracellulair en intercellularly, invasie van één tot twee cel lagen elke dag1,2. Succesvolle infectie resultaten in hypertrofie van de plant dat in zichtbaar tumoren op vijf dagen verandert post infectie1,3,4. Tijdens alle stadia van de infectie invaginate schimmeldraden van de schimmel de plant cytoplasma membraan zonder ieder rechtstreeks contact naar de host cytoplasma1,2. De strakke apoplasmic ruimte tussen de infecteren schimmeldraden en de plant plasmamembraan wordt beschouwd als de host/pathogen interactieve site, genaamd de biotrophic interactie zone. Om te overwinnen van het aangeboren immuunsysteem van de plant, scheidt U. maydis een array van effector eiwitten in de biotrophic interactie zone1. Sommige effectoren worden overgenomen door plantencellen, terwijl anderen in de biotrophic interactie zone5,6,7,8 blijven. Één die apoplastisch effector is UmPit2, die samenwerkt met die apoplastisch maïs proteasen het vrijkomen van de signalering peptide ZmZIP1 van ZmPROZIP door die apoplastisch protease activiteit9,10te voorkomen.
In de afgelopen decennia, U. maydis werd niet alleen een model voor schimmel genetica in plant-pathogen interactions, maar ook een waardevol hulpmiddel in de biotechnologie als gevolg van een goed begrepen life cycle, genetische bereikbaarheid en heterologe uitdrukking van uitgescheiden eiwitten11,12,13. Signalen voor de secretie van zowel conventionele en onconventionele eiwit zijn vastgesteld waarmee de posttranslationele modificaties14. Onlangs, U. maydis was werkzaam als een paard van Troje hulpmiddel om te studeren klein, maïseiwitten in situ15uitgescheiden. Het paard van Troje aanpak werd met succes gebruikt voor het analyseren van de functie van de kleine, secreted eiwit ZmMAC1 dat is betrokken bij helmknop ontwikkeling. ZmMAC1 induceert de periclinal verdeling van pluripotente cellen en cel lot specificatie van de nieuw gevormde cellen15. Op dezelfde wijze, werd de biologische functie van de maïs schade-geassocieerde peptide ZmZIP1 geopenbaard. U. maydis afscheidende de maïs die zmzip1 resulteerde in verminderde tumor vorming10. Dus, het paard van Troje aanpak vormt een waardevolle alternatieve route naar eiwit in situ studies met hoge Spatio resolutie dat noch doet vereisen generatie van stabiele maïs transformatie lijnen noch weefsel infiltratie met geïnfecteerd uitgedrukt en de zuivere eiwitten. In het bijzonder, maakt het paard van Troje-strategie de secretie van een heteroloog eiwit in de maïs apoplast en directe vergelijking van besmette versus niet-besmette plantencellen binnen de dezelfde weefsel.
Dit protocol illustreert de belangrijke stappen voor het genereren van een soort paard van Troje U. maydis om een proteïne van belang bestuderen. Verder bevat precieze informatie over infectie procedures van drie verschillende maïs weefseltypes (HLA) (volwassen bladeren, kwastjes en oren) met U. maydis, dat is een voorwaarde voor het bestuderen van de spatio infectie progressie en eiwit-functie in deze onderzoeken weefsels. Geen bijkomende specificaties zijn bepaald op maïs gene versterking en microscopische beeldvormende technieken, aangezien deze stappen doelgroepen gerichte en instrument-afhankelijk zijn. Dus, dit protocol is bedoeld voor ervaren gebruikers van standaard moleculaire biologietechnieken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Geïnspireerd door Homer´s Trojan paard mythe, we ontworpen de maïs pathogen Ustilago maydis secreted eiwitten om in te leveren de maïs apoplast toelaat in vivo fenotypische analyse. Deze methode niet afhankelijk is van maïs transformatie maar exploiteert microbiële genetica en secretoire mogelijkheden van ziekteverwekkers. Hierin staat het inspectie van in vivo geleverd secreted eiwitten met een hoge Spatio resolutie op verschillende soorten infectie sites en weefsels. De strategie van het paard van Troje kan worden gebruikt om de Transient aanvulling op maïs verlies-van-functie fenotypen, functioneel karakteriseren eiwit domeinen, af-target eiwit effecten te analyseren, of om te studeren van onside eiwit overdosering, waardoor het een krachtig hulpmiddel voor eiwit studies in het systeem van maïs gewas. Dit werk bevat een precieze protocol over het maken van een paard van Troje stam gevolgd door gestandaardiseerde infectie protocollen bij deze methode toepassen op drie verschillende maïs weefseltypes (HLA).

Constructies voor U. maydis Trojaans paard experimenten zijn gekloond in de plasmide p123-PUmpit2-SpUmpit2-gen van belang-mCherry-Ha. De maïs gen van belang is gesmolten tot een verslaggever van de fluorescentie mCherry en een epitoop HA-label. De uitdrukking van de fusieproteïne is onder controle van de promoter van U. maydis Umpit2 die specifiek is geac...

Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten

Dit werk beschrijft het klonen van een Ustilago maydis Trojaans paard stam voor de in-situ levering van secreted maïseiwitten in drie verschillende types van maïs weefsels.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Het onderzoeken van processen op genetische en eiwitniveaus is cruciaal in gewasonderzoek. Onze aanpak maakt inspectie van uitgescheiden doolhofeiwitten met hoogste ruimtelijke temporele resolutie aan verschillende infectiezijden en weefsels mogelijk. De Trojan Horse Methode verkent nuttige automaat secretoire mogelijkheden.Het omzeilt tijdrovende en uitdagende doolhof transformaties, en vergemakkelijkt gedetailleerde studies over uitgescheiden eiwitten binnen het doolhof appelplatz. Gedetailleerde informatie over de juiste infectie van toegevoegde doolhof bladeren, kwasten en oor. En toont de succesvolle studie van infectieprogressie en eiwitfunctie in het doelweefsel.Het aantonen van de procedure zal Zijn Isabell Fiedler, een grad student van het laboratorium. Om te beginnen met het experiment, krassen Eumadous van een pediatr plaat met behulp van een steriele pasteur pipet. Inoculate 5 milliliter YEPS Light Medium met Eumadous.Laat de cultuur groeien op 28 graden Celsius, met constant schudden bij 200 rpm gedurende 16 uur. De volgende dag mix 900 microliters van verse YEPS Light met 100 microliters van de nachtelijke cultuur. Meet de OD-600 met YEPS Light Medium als een blanco in de spectrofotometer analyse.Verdun de nachtcultuur met verse YEPS Light Medium tot een OD-600 van 2. Laat de cultuur groeien op 28 graden Celsius met constante schudden bij 200 rpm, totdat het bereikt het midden van log groeifase, aangegeven door een OD-600 van 8 tot 1,0. Na incubatie, oogst de cellen door ze te draaien op 3000 keer chi gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant weg. Was vervolgens de celpilette een keer met 1 kweekvolume van DDH2O. Draai de cellen op 3000 time chi gedurende 10 minuten en gooi de supernatant.Dan, opnieuw op te schorten de cel pilette zorgvuldig in DDH2O, met behulp van een 20 milliliter glazen pipet. Daardoor het aanpassen van de laatste OD-600 TOT 3.0 voor een Trojaans paard test of 1.0 voor ziekte rating. Cultiveren het doolhof planten tot een stadium van volwassen bladeren, waar ten minste blad 7 groeit binnen de stengel.Breng vervolgens de Eumadous-cultuur over in een 3 milliliter spuit met een 20-meterbiedernaald. Druk voorzichtig op de steel om het spiegelstamweefsel te lokaliseren. De basis van de Mirror Stem kan worden onderscheiden door een overgang van hardere stengel naar zachter weefsel.Markeer de Mirror Stem op de steel met een pen. Injecteer 1,5 milliliter Eumadous cultuur 1 centimeter boven de Shoot Mirror Stem of Inflorescence Mirror Stem. Zodra de doolhofplanten het kwaststadium bereiken, drukt u voorzichtig op de steel om de kwast in de steel te lokaliseren.Markeer de punt en de basis van de kwast op de steel met behulp van een pen. Breng de Eumadous cultuur in een 3 milliliter spuit met een 20 gauge bi een hypodermische naald om een totaal van 1,5 milliliter van het entmateriaal rond de kwast te injecteren. Om gelijke verdeling van het entmateriaal te verzekeren, plaats u langzaam 5 milliliter op de punt, het midden en de basis van de kwast die met de pen is gemarkeerd.Breng de Eumadous cultuur in een 3 milliliter spuit met 20 meter bi een hypodermische naald. Injecteer de inentingsnaald zo diep mogelijk in de ruimte tussen de kafbladeren zonder het oor te verwonden en laat vervolgens 1,5 milliliter van het entmateriaal rond het oor vrij. Verwijder vervolgens de spuit en naald en masseer de kolf zorgvuldig om de Eumadous-oplossing gelijkmatig te verdelen.Drop 10 microliter van entmateriaal op een PD houtskool vijzelplaat. Dan incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen. Hyphae afscheid ZM Mach1 zijn omgeven door fluorescerende en kersensignaal.In tegenstelling, niet-krijten hyphae alleen laten zien fluorescerend signaal in de schimmel cytoplasma. Onjuiste kwastlokalisatie of ongelijke verdeling van het entmateriaal kan leiden tot niet-infecteerde kwast of slechts gedeeltelijke infectie van de kwast in vergelijking met zelfs distributie. De solo pathogene Trojan Horse Progenester stam SG-200, gekweekt op PD houtskool vijzel, vormt witte pluis filamenten op de plaat zoals afgebeeld.Terwijl de Eumadous stam FB1 paring vereist voor infectieuze filamentvorming. Na infectie, de mogelijke reactie van tekenen van de Trojan Horse lever eiwit kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende methoden, waaronder ziekte ratings of microscopische beeldvorming. Voor veel ziekteverwekkers zijn transformatie en afscheiding goed begrepen en kunnen ze op een vergelijkbare manier worden verkend.Daarom maken ze de studie van de gastheer mogelijk, die niet gevoelig zijn voor transformatie.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy als een chirurgische benadering van lokale Drug Delivery tot de Inner oren van volwassen en neonatale muizen

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Chromogene in situ hybridisatie SS een hulpmiddel voor HPV-gerelateerde hoofd-en nek kankerdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...