Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
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Les auteurs aimeraient remercier Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella et Armin Hildebrand pour la fourniture de matériel de laboratoire espace et. Le œuvre originale sur la méthode de cheval de Troie était soutenue par une bourse post-doc de Leopoldina et projet NSF IOS13-39229. Le travail présenté dans cet article a été soutenu par SFB924 (projets A14 et B14) de la DFG.

1. construction d’un cheval de Troie maydis U.
Remarque : Voir la Figure 1.
<ol><li>Amplifier un gène d’intérêt de maïs cDNA utilisant des amorces spécifiques de gènes et une relecture ADN polymérase. Cloner le principal produit PCR et transformer la construction de e. coli en suivant les instructions du fournisseur plasmide. Vérifiez le gène correct de la séquence d’intérêt par avant séquençage Sa...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

Recherche sur les cultures modernes exige des protocoles pour l’analyse moléculaire sur la génétique et des niveaux de protéine. L’accessibilité génétique par transformation n’est pas disponible ou inefficaces et fastidieuse pour la plupart des espèces de cultures telles que le maïs. En outre, des outils génétiques fiables tels que les systèmes de journaliste promoteur sont rares, ce qui rend difficile d’étudier la fonction des protéines in situ avec une haute résolution spatio-temporelle ...

Le pathogène biotrophe Ustilago maydis est l’agent causal du maïs charbon maladie1. Il infecte tous les parties aériennes de maïs ayant pour résultat les grosses tumeurs qui renferment des spores mélanisées, noir. Au niveau mondial, U. maydis est estime susceptible de causer une perte annuelle d’environ 2 % du rendement du maïs, tandis que les tumeurs sont appréciés comme un délice gastronomique au Mexique. Infection des plantes est initiée par un appressorium qui sécrète des enzymes lyse de la paroi cellulaire pour pénétrer dans la première couche de cellules épidermiques de maïs. Partir d’un site d’infection primaire, U. maydis se développe dans les cellules et entre les cellules, envahir les cellules d’une à deux couches chaque jour1,2. Résultats infection réussie dans l’hypertrophie de plante qui se transforme en tumeurs visibles sur cinq jours après l’infection1,3,4. Durant tous les stades de l’infection, les hyphes fongiques invaginent la membrane de cytoplasme de plante sans aucun contact direct au cytoplasme hôte1,2. L’espace apoplasme serré entre les hyphes infectant et la membrane plasmique de la plante est réputé être le site interactif de l’hôte/pathogène, appelé la zone d’interaction biotrophe. Afin de surmonter le système immunitaire inné de plante, U. maydis sécrète un tableau des protéines effectrices dans biotrophe interaction zone1. Certains effecteurs sont absorbés par les cellules végétales, tandis que d’autres restent dans l’interaction biotrophe zone5,6,7,8. Un effecteur apoplastique est UmPit2, qui interagit avec des protéases apoplastique maïs pour éviter la sortie de la signalisation du peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP par apoplastique protéase activité9,10.
Au cours des dernières décennies, U. maydis est devenu non seulement un modèle pour la génétique des champignons dans l’interaction plante-pathogène, mais aussi un outil précieux en matière de biotechnologie en raison d’un cycle de vie bien compris, facilité d’accès génétique et expression hétérologue de sécrétée protéines11,12,13. Signaux pour la sécrétion de ces deux protéines conventionnelles et non conventionnelles ont été déterminées en permettant le contrôle des modifications post-traductionnelles14. Récemment, U. maydis a été employée comme un outil de cheval de Troie pour étudier petit, sécrétée protéines de maïs en situ15. L’approche d’un cheval de Troie a été utilisé avec succès pour analyser la fonction de la protéine de petite, sécrétée ZmMAC1 qui est impliqué dans le développement de l’anthère. ZmMAC1 induit la division Péricline de cellules pluripotentes et la spécification des cellules nouvellement formé15sort des cellules. Selon la même méthode, la fonction biologique du peptide associés aux dommages maïs ZmZIP1 a été révélée. U. maydis sécrétant le maïs que zmzip1 entraîné avec facultés affaiblies tumeur formation10. Ainsi, le cheval de Troie approche représente un itinéraire alternatif précieux à la protéine de situ études à haute résolution spatio-temporelle qui ne fait ni exiger génération de lignes de transformation de maïs stable ni infiltration des tissus avec façon hétérologue protéines exprimées et purifiées. En particulier, la stratégie du cheval de Troie permet la sécrétion d’une protéine hétérologue dans l’apoplaste maïs et une comparaison directe des infectés contre les cellules végétales non infectés dans le même tissu.
Ce protocole illustre les principales étapes pour générer une souche de cheval de Troie d’u. maydis afin d’étudier une protéine d’intérêt. Il comprend également des informations précises sur les procédures de l’infection de trois types de différents tissus de maïs (les feuilles adultes, les glands et les oreilles) avec U. maydis, qui est une condition sine qua non pour l’étude de la fonction spatio-temporelle de l’infection de progression et de protéines dans ces tissus de cible. Aucune précisions ne sont donnée sur maïs amplification génique et microscopiques imaging techniques, étant donné que ces étapes sont spécifiques à la cible et instrument-dépendante. Ainsi, le présent protocole s’adresse aux utilisateurs expérimentés des techniques standard de biologie moléculaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Inspiré par le mythe de cheval Troie Homer´s, nous avons conçu le pathogène maïs Ustilago maydis pour fournir des protéines sécrétées dans l’apoplaste maïs permettant une analyse phénotypique in vivo. Cette méthode ne s’appuie pas sur la transformation de maïs, mais exploite la génétique microbienne et des capacités sécrétoires des agents pathogènes. Il permet aux présentes, inspection in vivo livré des protéines sécrétées à haute résolution spatio-temporelle à différents types de tissus et de sites d’infection. La stratégie du cheval de Troie peut être utilisée en complément transitoirement maïs phénotypes de perte de fonction, afin de caractériser sur le plan fonctionnel des domaines protéiques, pour analyser les effets de la protéine hors cible, ou d’étudier un surdosage onside protéine, ce qui en fait un outil puissant études de protéine dans le système de récolte de maïs. Cet ouvrage contient un protocole précis sur la façon de générer une souche de cheval de Troie suivie de protocoles normalisés de l’infection à appliquer cette méthode à trois types de différents tissus de maïs.

Des constructions pour des expériences de cheval de Troie U. maydis sont clonées dans le plasmide p123-PUmpit2-SpUmpit2-gène d’intérêt-mCherry-Ha. Le maïs gène d’intérêt est fusionné à un journaliste de fluorescence mCherry et un épitope HA-tag. L’expression de la protéine de fusion est sous contrôle du promoteurpit2 U. maydis mu qui est...

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Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

À l’aide d’Ustilago maydis comme un cheval de Troie pour la livraison de la protéine maïs In Situ

Cet ouvrage décrit le clonage d’une souche de cheval de Troie Ustilago maydis pour la prestation in situe des protéines sécrétées de maïs en trois différents types de tissus de maïs.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

L’étude des processus sur les niveaux génétiques et protéiques est cruciale dans la recherche sur les cultures. Notre approche permet l’inspection des protéines de labyrinthe sécrétées avec la résolution temporelle spatiale la plus élevée à différents côtés et tissus d’infection. La méthode cheval de Troie explore des capacités de sécrétion automates utiles.Il contourne les transformations de labyrinthe longues et difficiles, et facilite des études détaillées sur les protéines sécrétées dans l’appelplatz labyrinthe. Informations détaillées sur l’infection appropriée des feuilles de labyrinthe ajoutées, glands et oreille. Et montre l’étude réussie de la progression de l’infection et la fonction protéique dans le tissu cible.Isabell Fiedler, étudiante diplômée du laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer l’expérience, grattez Eumadous à partir d’une plaque de pediatr à l’aide d’une pipette pasteur stérile. Inoculer 5 millilitres de YEPS Light Medium avec Eumadous.Cultivez la culture à 28 degrés Celsius, avec des secousses constantes à 200 rpm pendant 16 heures. Le lendemain, mélangez 900 microlitres de lumière YEPS fraîche avec 100 microlitres de la culture nocturne. Mesurez l’OD-600 à l’aide du milieu lumineux YEPS comme blanc dans l’analyse du spectrophotomètre.Diluer la culture de nuit avec frais YEPS Light Medium à un OD-600 de 2. Laissez la culture croître à 28 degrés Celsius avec des secousses constantes à 200 rpm, jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase de croissance du rondin moyen, indiquée par un OD-600 de 8 à 1,0. Après l’incubation, récolter les cellules en les faisant tourner à 3000 fois chi pendant 10 minutes.Jeter le surnatant. Ensuite, lavez la pilette cellulaire une fois avec 1 volume de culture de DDH2O. Faire tourner les cellules à 3000 chi temps pendant 10 minutes et jeter le supernatant.Ensuite, suspendez soigneusement la pilette cellulaire dans DDH2O, à l’aide d’une pipette en verre de 20 millilitres. Ajustant ainsi l’OD-600 final à 3.0 pour un essai de cheval de Troie ou 1.0 pour l’évaluation de la maladie. Cultivez les plantes du labyrinthe à un stade de feuilles adultes, où au moins la feuille 7 pousse dans la tige.Ensuite, transférez la culture eumadous dans une seringue de 3 millilitres avec une aiguille bi une hypodermique de calibre 20. Appuyez soigneusement sur la tige pour localiser le tissu de tige miroir. La base de la tige miroir peut être distinguée par une transition de la tige plus dure aux tissus plus mous.Marquez la tige miroir sur la tige à l’aide d’un stylo. Injectez 1,5 millilitres de culture Eumadous 1 centimètre au-dessus de la tige du miroir shoot ou de la tige miroir d’inflorescence. Une fois que les plantes du labyrinthe atteignent le stade du gland, appuyez soigneusement sur la tige pour localiser le gland dans la tige.Marquez la pointe et la base du gland sur la tige à l’aide d’un stylo. Transférer la culture eumadous dans une seringue de 3 millilitres avec une aiguille hypodermique bi une de calibre 20 pour injecter un total de 1,5 millilitres de l’inoculum autour du gland. Pour assurer une répartition égale de l’inoculum, placez lentement 5 millilitres à la pointe, au milieu et à la base du gland marqué du stylo.Transférer la culture eumadous dans une seringue de 3 millilitres avec une aiguille hypodermique bi une de calibre 20. Injecter l’aiguille d’inoculation dans l’espace entre les feuilles d’enveloppe aussi profondément que possible sans blesser l’oreille, puis libérer 1,5 millilitres de l’inoculum autour de l’oreille. Ensuite, retirez la seringue et l’aiguille et massez soigneusement l’épi pour distribuer la solution Eumadous également.Déposer 10 microlitres d’inoculum sur une plaque d’auger au charbon de bois. Puis incuber à température ambiante pendant 2 jours. Hyphae sécrétant ZM Mach1 sont entourés de signal fluorescent et cerise.En revanche, les hyphes nonsecreting montrent seulement le signal fluorescent dans le cytoplasme fongique. Une localisation inappropriée du gland ou une répartition inégale de l’inoculum peut entraîner une infection non infectée du gland ou seulement une infection partielle du gland par rapport à la distribution uniforme. La souche solo pathogène Trojan Horse Progenester SG-200, cultivé sur la tarière de charbon de bois, forme des filaments de peluches blanches sur la plaque comme indiqué.Alors que la souche eumadous FB1 nécessite un accouplement avant la formation de filaments infectieux. Après l’infection, la réponse possible des signes de la protéine hépatique cheval de Troie peut être analysée en utilisant diverses méthodes, y compris les cotes de la maladie ou l’imagerie microscopique. Pour de nombreux agents pathogènes, la transformation et la sécrétion sont bien comprises et peuvent être explorées de la même manière.Par conséquent, ils permettent l’étude de l’hôte, qui ne sont pas sensibles à la transformation.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Manipulation génétique de l&#39;agent pathogène des plantes<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions

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Recherche

Génétique

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