Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
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Die Autoren möchte Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella und Armin Hildebrand danken für die Bereitstellung von Raum und Pflanze Labormaterial. Das ursprüngliche Werk über die Trojaner-Methode wurde von einer Leopoldina postdoc Fellowship und NSF Projekt IOS13-39229 unterstützt. Die in diesem Artikel vorgestellte Arbeit wurde von SFB924 (Projekte A14 und B14) der DFG unterstützt.

(1) Bau einer U. Maydis Trojanisches Pferd
Hinweis: Siehe Abbildung 1.
<ol><li>Ein Gen des Interesses von Mais cDNA mittels Gen-spezifische Primer und ein Lektorat DNA-Polymerase zu verstärken. Klonen Sie das Hauptprodukt der PCR zu und verwandeln Sie das Konstrukt in E. Coli Anweisungen des Verkäufers Plasmid. Stellen Sie sicher das richtige gen Interesse Sequenz von Sanger-Sequenzierung vor für die nächsten Schri...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

Moderne Pflanzenforschung erfordert Protokolle für molekulare Analyse auf genetische und Proteingehalt. Genetischen Zugänglichkeit über Transformation ist nicht verfügbar oder ineffizient und zeitaufwendig für die meisten Kulturarten wie Mais. Darüber hinaus sind zuverlässige genetische Tools wie Veranstalter Reporter Systeme rar, das macht es schwierig, in-situ Proteinfunktion raumzeitlichen hochauflösend an unterschiedliche Gewebe Standorten zu studieren. Apoplasten Proteine können durch Infiltration ...

Der biotrophe Erreger Ustilago Maydis ist der Erreger der Mais Smut Krankheit1. Er infiziert alle oberirdischen Teile von Mais, was zu großen Tumoren, die Melanized, schwarze Sporen enthalten. Auf globaler Ebene dürfte U. Maydis verursachen einen jährlichen Verlust von rund 2 % des Mais Ertrag, während Tumoren als in Mexiko eine gastronomische Delikatesse geschätzt werden. Pflanze-Infektion wird durch eine Appressorium eingeleitet, die Zellwand Lysiereinrichtung Enzyme, die erste Schicht von Mais epidermalen Zellen durchdringen sondert. Von einer Primärinfektion Site U. Maydis wächst intrazellulär und intercellularly, ein bis zwei Zellen eindringen "layers" jeden Tag1,2. Erfolgreiche Infektion Ergebnisse im Werk Hypertrophie, die verwandelt sich in sichtbaren Tumoren auf fünf Tage post Infektion1,3,4. In allen Phasen der Infektion Biomembran pilzliche Hyphen die Pflanze Zytoplasma-Membran ohne direkten Kontakt zum Host Zytoplasma1,2. Der enge Apoplasmic Raum zwischen den infizierenden Hyphen und der Plasmamembran Pflanze gilt als der Host/Erreger interaktive Website mit dem Namen der biotrophe Wechselwirkungszone. Um das angeborene Immunsystem der Pflanze zu überwinden, sondert U. Maydis ein Array von Effektor-Proteine in der biotrophe Interaktion Zone1. Einige Effektoren sind von Pflanzenzellen aufgenommen, während andere in der biotrophe Interaktion Zone5,6,7,8bleiben. Ein Apoplasten Effektor ist UmPit2, die Interaktion mit Apoplasten Mais Proteasen die Freisetzung der Signalisierung Peptid ZmZIP1 aus ZmPROZIP durch Apoplasten Protease-Aktivität9,10zu verhindern.
In den letzten Jahrzehnten U. Maydis wurde nicht nur ein Modell für pilzartige Genetik in Pflanze-Pathogen Interaktion, sondern auch ein wertvolles Instrument in der Biotechnologie aufgrund einer wohlverstandenen Lebenszyklus, genetische Erreichbarkeit und heterologen Expression von abgesondert Proteine11,12,13. Signale für sowohl konventionelle und unkonventionelle Protein Sekretion wurden ermöglicht die Kontrolle der posttranslationale Modifikationen14ermittelt. Vor kurzem, war wie ein Trojanisches Pferd-Werkzeug, um kleine, studieren abgesondert Mais Proteine in Situ15 U. Maydis eingesetzt. Trojanisches Pferd Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um die Funktion des kleinen, sekretierten Proteins ZmMAC1 zu analysieren, die in der Anthere Entwicklung beteiligt ist. ZmMAC1 induziert die periclinal Division von pluripotenten Zellen und Zellen Schicksal Spezifikation der neugebildeten Zellen15. Nach der gleichen Methode wurde die biologische Funktion des Mais Schäden verbundenen Peptids ZmZIP1 offenbart. U. Maydis sezernierenden Mais führte zu ZmZIP1 beeinträchtigt Tumor Bildung10. So, das Trojanische Pferd Ansatz stellt eine wertvolle alternative Route zur Protein in Situ Untersuchungen mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung, der auch nicht erfordern Generation von stabilen Mais Transformation Linien noch Gewebe Infiltration mit heterologously ausgedrückt und gereinigten Proteinen. Die Trojanische Pferd-Strategie ermöglicht insbesondere die Sekretion von jedem heterologen Protein in den Mais Apoplasten und direkter Vergleich von infizierten im Vergleich zu nicht-infizierten Pflanzenzellen innerhalb der gleichen Gewebe.
Dieses Protokoll zeigt die wichtigsten Schritte zur Erzeugung einer U. Maydis Trojanisches Pferd Belastung um ein Protein des Interesses zu studieren. Es enthält weitere präzise Informationen über Infektion Verfahren von drei verschiedenen Mais Gewebetypen (Erwachsene Blätter, Quasten und Ohren) mit U. Maydis, eine Voraussetzung für das Studium der raumzeitlichen Infektion Fortschreiten und Protein-Funktion in diesen Zielgewebe. Keine weiteren Spezifikationen sind auf Mais gen-Amplifikation und mikroskopische bildgebende Verfahren, da diese Schritte gezielt und Instrument-abhängig sind. Somit ist dieses Protokoll an erfahrene Anwender von standard molekularbiologische Techniken gerichtet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Von Homers Trojanische Pferd Mythos inspiriert, haben wir den Mais Erreger Ustilago Maydis sekretierten Proteine in den Mais Apoplast schönem in-vivo phänotypische Analyse liefern entwickelt. Diese Methode setzt nicht auf Mais Transformation aber beutet mikrobielle Genetik und sekretorischen Funktionen von Krankheitserregern. Hierin, ermöglicht es, dass Inspektion von in-vivo sekretierten Proteine mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung bei verschiedenen Arten von Infektion Websites und Gewebe geliefert. Die Trojanische Pferd-Strategie kann genutzt werden, um vorübergehend Maize Verlustfunktion-Phänotypen, um funktionell charakterisieren Protein Domänen, aus Zielprotein Auswirkungen zu analysieren oder zu onside Protein Überdosierung, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug für studieren ergänzen Protein-Studien in der Mais-Ernte-System. Dieses Werk enthält eine genaue Protokoll über wie einen Trojanisches Pferd Stamm, gefolgt von standardisierten Infektion Protokolle dieser Methode zu drei verschiedenen Mais Gewebetypen zu generieren.

Konstrukte für U. Maydis Trojanisches Pferd Experimente werden in das Plasmid p123-pUmpit2-SpUmpit2-gen von Interesse-mCherry-Hageklont. Der Maize gen von Interesse ist, ein mCherry -Fluoreszenz-Reporter und ein Epitop HAverschmolzen-Tag. Der Ausdruck des Fusionsproteins ist unter Kontrolle des U. Maydis Umpit2 Promotors, speziell bei Infektion<sup class="...

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Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Mit Ustilago Maydis als ein Trojanisches Pferd für In Situ Lieferung von Mais Proteine

Diese Arbeit beschreibt das Klonen einer Ustilago Maydis Trojanisches Pferd Belastung für die in-situ Lieferung von sekretierten Proteinen, Mais in drei verschiedene Arten von Mais Gewebe.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Die Untersuchung von Prozessen auf genetischer und Proteinebene ist in der Pflanzenforschung von entscheidender Bedeutung. Unser Ansatz ermöglicht die Inspektion von sezernierten Labyrinthproteinen mit höchster räumlicher zeitlicher Auflösung an verschiedenen Infektionsseiten und Geweben. Die Trojanische Pferd-Methode untersucht nützliche automatisierte Sekretoretheienfunktionen.Es umgeht zeitaufwändige und herausfordernde Labyrinth-Transformationen und ermöglicht detaillierte Studien zu sezernierten Proteinen im Labyrinth appelplatz. Detaillierte Informationen über die richtige Infektion von hinzugefügten Labyrinthblättern, Quasten und Ohr. Und zeigt die erfolgreiche Untersuchung der Infektionsprogression und Proteinfunktion im Zielgewebe.Demonstriert wird das Prozedere von Isabell Fiedler, einer Grad-Studentin aus dem Labor. Um das Experiment zu beginnen, kratzen Sie Eumadous von einer Pediatrplatte mit einer sterilen Pasteurpipette. Impfen Sie 5 Milliliter YEPS Light Medium mit Eumadous.Wachsen Sie die Kultur bei 28 Grad Celsius, mit ständigem Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute für 16 Stunden. Am nächsten Tag 900 Mikroliter frisches YEPS-Licht mit 100 Mikrolitern der Übernachtungskultur mischen. Messen Sie den OD-600 mit YEPS Light Medium als Leerzeichen in der Spektralphotometeranalyse.Verdünnen Sie die Nachtkultur mit frischem YEPS Light Medium auf eine OD-600 von 2. Lassen Sie die Kultur bei 28 Grad Celsius mit ständigem Schütteln bei 200 Rpm wachsen, bis sie die mittlere Log-Wachstumsphase erreicht, die durch eine OD-600 von 8 bis 1,0 angezeigt wird. Nach der Inkubation ernten Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Minuten lang 3000 Mal chi.Entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes waschen Sie die Zelle Pilette einmal mit 1 Kulturvolumen von DDH2O. Drehen Sie die Zellen bei 3000 Zeit Chi für 10 Minuten und entsorgen Sie den Überstand.Dann setzen Sie die Zellpilette vorsichtig in DDH2O, mit einer 20 Milliliter Glaspipette. Hierdurch wird das endgültige OD-600 TO 3.0 für einen Trojanischen Pferdetest oder 1,0 für die Krankheitsbewertung angepasst. Kultivieren Sie die Labyrinthpflanzen zu einem Stadium von erwachsenen Blättern, wo mindestens Blatt 7 innerhalb des Stiels wächst.Als nächstes übertragen Sie die Eumadous-Kultur in eine 3-Milliliter-Spritze mit einer 20 Gauge bi one hypodermischen Nadel. Drücken Sie den Stiel sorgfältig, um das Spiegelstammgewebe zu lokalisieren. Die Basis des Spiegelstammes kann durch einen Übergang vom härteren Stiel zum weicheren Gewebe unterschieden werden.Markieren Sie den Spiegelstamm mit einem Stift auf dem Stiel. Injizieren Sie 1,5 Milliliter eumadische Kultur 1 Zentimeter über dem Shoot Mirror Stem oder Florescence Mirror Stem. Sobald die Labyrinthpflanzen die Quastestufe erreicht haben, drücken Sie den Stiel vorsichtig, um die Quaste im Stiel zu lokalisieren.Markieren Sie die Spitze und die Basis der Quaste auf dem Stiel mit einem Stift. Übertragen Sie die eumadische Kultur in eine 3-Milliliter-Spritze mit einer 20 Gauge bi one hypodermischen Nadel, um insgesamt 1,5 Milliliter des Inokulums um die Quaste zu injizieren. Um die gleichmäßige Verteilung des Inokulums zu sichern, legen Sie langsam 5 Milliliter an der Spitze, der Mitte und der Basis der Quaste, die mit dem Stift markiert ist.Übertragen Sie die eumadische Kultur in eine 3-Milliliter-Spritze mit 20 Gauge bi eine hypodermische Nadel. Injizieren Sie die Impfnadel so tief wie möglich in den Raum zwischen den Schalenblättern, ohne das Ohr zu verletzen, und geben Sie dann 1,5 Milliliter des Inokulums um das Ohr frei. Als nächstes entfernen Sie die Spritze und Nadel und massieren Sie vorsichtig den Cob, um die Eumadous-Lösung gleichmäßig zu verteilen.10 Mikroliter Inokulum auf eine PD-Holzkohle-Schneckenplatte fallen lassen. Dann bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubieren. Hyphae Sekretion ZM Mach1 sind von fluoreszierenden und Kirschsignal umgeben.Im Gegensatz dazu zeigen nicht geheime Hyphen nur fluoreszierendes Signal im Pilzzytoplasma. Unsachgemäße Quastenlokalisierung oder ungleiche Verteilung des Inokulums kann zu einer nicht infizierten Quaste oder nur zu einer teilweisen Infektion der Quaste im Vergleich zur gleichmäßigen Verteilung führen. Der solo pathogene Trojanische Pferd ProgenesterStamm SG-200, kultiviert auf PD-Holzkohleschnecke, bildet weiße Flaumfilamente auf der Platte, wie gezeigt.Während der Eumadous-Stamm FB1 eine Paarung vor der infektiösen Filamentbildung erfordert. Nach der Infektion, die mögliche Reaktion von Anzeichen das Trojanisches Pferd Leberprotein kann mit verschiedenen Methoden einschließlich Krankheitsbewertungen oder mikroskopische Bildgebung analysiert werden. Bei vielen Krankheitserregern sind Transformation und Sekretion gut verstanden und können auf ähnliche Weise erforscht werden.Daher ermöglichen sie die Untersuchung des Wirts, die nicht anfällig für Transformation sind.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

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Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

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Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

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Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

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DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy als ein chirurgisches Vorgehen zu Local Drug Delivery in das innere Ohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

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Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...