Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

लेखक थॉमस Dresselhaus, मार्टिन Parniske, Noureddine Djella, और आर्मिन Hildebrand लैब अंतरिक्ष और संयंत्र सामग्री प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । ट्रोजन हॉर्स विधि पर मूल काम एक Leopoldina postdoc फैलोशिप और NSF परियोजना IOS13-39229 द्वारा समर्थित किया गया था । इस लेख में प्रस्तुत कार्य को DFG के SFB924 (प्रोजेक्ट्स A14 एण्ड B14) द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. एक यू मेडिस ट्रोजन हॉर्स का निर्माण
नोट: चित्र 1देखें ।
<ol><li>जीन विशिष्ट प्राइमरों और एक शु डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर मक्का सीडीएनए से ब्याज की एक जीन बढ़ाना. प्राथमिक ?...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

आधुनिक फसल अनुसंधान आनुवंशिक और प्रोटीन के स्तर पर आणविक विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल की मांग । परिवर्तन के माध्यम से आनुवंशिक पहुंच उपलब्ध है या अक्षम और मक्का के रूप में सबसे अधिक फसल प्रजातियों के ...

biotrophic रोगज़नक़ Ustilago मेडिस मकई मैल रोग की प्रेरणा का एजेंट है1। यह बड़े ट्यूमर में जिसके परिणामस्वरूप मक्का के सभी हवाई भागों को संक्रमित करता है जिसमें melanized, काले बीजाणु होते हैं । वैश्विक स्तर पर, मेडिस को मकई की उपज के लगभग 2% की वार्षिक हानि का कारण अनुमान है, जबकि ट्यूमर मेक्सिको में एक लजीज विनंरता के रूप में सराहना की जाती है । संयंत्र संक्रमण एक appressorium है कि सेल दीवार lysing एंजाइमों को मक्का एपिडर्मल कोशिकाओं की पहली परत घुसना स्रावित द्वारा शुरू की है । एक प्राथमिक संक्रमण साइट से, मेडिस intracellularly और सेलुलर बढ़ता है, एक दो सेल परतों हर दिन1,2पर हमला । संयंत्र अतिवृद्धि में सफल संक्रमण के परिणाम है कि पांच दिनों के बाद संक्रमण1,3,4पर दिखाई ट्यूमर में बदल जाता है । सभी संक्रमण चरणों के दौरान, कवक hyphae invaginate के बिना किसी भी सीधे संपर्क के संयंत्र कोशिका द्रव्य झिल्ली कोशिका द्रव्य1,2। संक्रमित hyphae और संयंत्र प्लाज्मा झिल्ली के बीच तंग apoplasmic अंतरिक्ष मेजबान/रोगज़नक़ इंटरएक्टिव साइट माना जाता है, biotrophic संपर्क क्षेत्र कहा जाता है । आदेश में संयंत्र जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली को दूर करने के लिए, मेडिस biotrophic संपर्क क्षेत्र1में प्रभावक प्रोटीन की एक सरणी स्रावित । कुछ प्रभाव संयंत्र कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, जबकि अंय biotrophic संपर्क क्षेत्र5,6,7,8में रहते हैं । एक apoplastic प्रभाव UmPit2 है, जो apoplastic मक्का के साथ सूचना का आदान प्रदान करने के लिए ZmPROZIP से संकेतन पेप्टाइड ZmZIP1 की रिहाई को रोकने के साथ इंटरैक्ट करता गतिविधि9,10।
पिछले दशकों में, मेडिस न केवल संयंत्र में कवक आनुवंशिकी के लिए एक मॉडल-रोगज़नक़ संपर्क बन गया है , लेकिन यह भी एक अच्छी तरह से समझ में आ जीवन चक्र, आसान आनुवंशिक पहुंच और heterologous अभिव्यक्ति की वजह से जैव प्रौद्योगिकी में एक महत्वपूर्ण उपकरण स्रावित प्रोटीन्स11,12,13. दोनों पारंपरिक और अपरंपरागत प्रोटीन स्राव के लिए संकेत posttranslational संशोधनों के नियंत्रण की अनुमति निर्धारित किया गया है14। हाल ही में, मेडिस 15सीटू में छोटे, गुप्त मक्का प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक ट्रोजन हॉर्स उपकरण के रूप में कार्यरत था । ट्रोजन हॉर्स दृष्टिकोण सफलतापूर्वक छोटे, गुप्त प्रोटीन ZmMAC1 है कि anther विकास में शामिल है के समारोह का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ZmMAC1 नई गठित कोशिकाओं के pluripotent कोशिकाओं और सेल भाग्य विनिर्देश के periclinal विभाजन लाती है15. इसी विधि द्वारा खाद्यान क्षति से संबंधित पेप्टाइड ZmZIP1 के जैविक कार्य का पता चला । यू मेडिस स्रावित मक्का ZmZIP1 बिगड़ा ट्यूमर गठन10में हुई । इस प्रकार, ट्रोजन हॉर्स दृष्टिकोण उच्च spatiotemporal संकल्प है कि न तो स्थिर मक्का परिवर्तन लाइनों के उत्पादन की आवश्यकता होती है और न ही heterologously के साथ ऊतक घुसपैठ के साथ सीटू के अध्ययन में प्रोटीन के लिए एक मूल्यवान वैकल्पिक मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है व्यक्त और शुद्ध प्रोटीन । विशेष रूप से, ट्रोजन हॉर्स रणनीति एक ही ऊतक के भीतर मक्का apoplast और संक्रमित बनाम गैर संक्रमित संयंत्र कोशिकाओं के प्रत्यक्ष तुलना में किसी भी heterologous प्रोटीन के स्राव को सक्षम बनाता है ।
इस प्रोटोकॉल एक यू मेडिस ट्रोजन हार्स तनाव पैदा करने के लिए ब्याज की एक प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए प्रमुख कदम दिखाता है । यह आगे spatiotemporal संक्रमण प्रगति और प्रोटीन समारोह का अध्ययन करने के लिए एक शर्त है जो मेडिसके साथ तीन अलग मक्का ऊतक प्रकार (वयस्क पत्तियों, लटकन और कान) के संक्रमण प्रक्रियाओं पर सटीक जानकारी शामिल इन लक्ष्य ऊतकों में । कोई आगे विनिर्देशों मक्का जीन प्रवर्धन और सूक्ष्म इमेजिंग तकनीक पर दिया जाता है, क्योंकि इन कदमों के लक्ष्य विशिष्ट और साधन-निर्भर कर रहे हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल मानक आणविक जीवविज्ञान तकनीक के अनुभवी उपयोगकर्ताओं को संबोधित किया है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

होमर ´ एस ट्रोजन हॉर्स मिथक से प्रेरित होकर, हम मक्का रोगज़नक़ Ustilago मेडिस vivo phenotypic विश्लेषण में अनुमति apoplast मक्का में स्रावित प्रोटीन देने के लिए इंजीनियर । इस विधि मक्का परिवर्तन पर निर्भर नहीं करता है, लेकिन माइक्रोबियल आनुवंशिकी और रोगजनकों के स्रावी क्षमताओं का दोहन । इस के साथ साथ, यह के निरीक्षण की अनुमति देता है vivo में संक्रमण साइटों और ऊतकों के विभिंन प्रकार पर उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ स्रावित प्रोटीन दिया । ट्रोजन हॉर्स रणनीति क्षणिक मक्का नुकसान का उपयोग किया जा सकता है-समारोह phenotypes, कार्यात्मक प्रोटीन डोमेन विशेषताएं करने के लिए, ऑफ लक्ष्य प्रोटीन प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, या onside प्रोटीन खुराक का अध्ययन करने के लिए, यह एक शक्तिशाली उपकरण बनाने के लिए खाद्यान फसल प्रणाली में प्रोटीन की पढ़ाई । यह काम कैसे एक ट्रोजन हॉर्स मानकीकृत संक्रमण प्रोटोकॉल के बाद तनाव उत्पंन करने के लिए तीन अलग मक्का ऊतक प्रकार के लिए इस पद्धति को लागू करने पर एक सटीक प्रोटोकॉल शामिल हैं ।

construction for U. मेडिस ट्रोजन हॉर्स प्रयोगों में क्लोन कर रहे हैं प्लाज्मिड p123-Pउमpit2-एसपीउमpit2-जीन ऑफ इंटरेस्ट-mCherry-हा. ब्याज की मक्का जीन एक mCherry प्रतिदीप्ति रिपो?...

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Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

मकई प्रोटीन की सीटू प्रसव में के लिए एक ट्रोजन हॉर्स के रूप में Ustilago मेडिस का उपयोग

इस काम का वर्णन एक Ustilago मेडिस ट्रोजन हॉर्स तनाव के लिए में सीटू प्रसव के लिए स्रावित मक्का प्रोटीन की क्लोनिंग मक्का के ऊतकों के तीन विभिन्न प्रकार में.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

फसल अनुसंधान में आनुवंशिक और प्रोटीन के स्तर पर जांच प्रक्रियाएं महत्वपूर्ण हैं । हमारा दृष्टिकोण विभिन्न संक्रमण पक्षों और ऊतकों पर उच्चतम स्थानिक लौकिक संकल्प के साथ स्रावित भूलभुलैया प्रोटीन के निरीक्षण में सक्षम बनाता है। ट्रोजन हॉर्स विधि उपयोगी स्वचालित गुप्त क्षमताओं की पड़ताल करती है।यह समय लेने वाली और चुनौतीपूर्ण भूलभुलैया परिवर्तनों को दरकिनार करता है, और भूलभुलैया appelplatz के भीतर स्रावित प्रोटीन पर विस्तृत अध्ययन की सुविधा । जोड़ा भूलभुलैया पत्ते, लटकन और कान के उचित संक्रमण के बारे में विस्तृत जानकारी। और लक्ष्य ऊतक में संक्रमण प्रगति और प्रोटीन समारोह के सफल अध्ययन से पता चलता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन इसाबेल सारंगी, प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा । प्रयोग शुरू करने के लिए, एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पेडिएटर प्लेट से यूमाडस को खरोंच करें। यूमाडस के साथ YEPS लाइट मीडियम के 5 मिलीलीटर टीका।28 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बढ़ें, 16 घंटे के लिए २०० आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए के साथ । अगले दिन रातोंरात संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर के साथ ताजा YEPS प्रकाश के 900 माइक्रोलीटर मिश्रण। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर विश्लेषण में एक खाली के रूप में YEPS लाइट मीडियम का उपयोग कर OD-600 को मापें।ताजा YEPS लाइट मीडियम के साथ रातोंरात संस्कृति को 2 के एक ओडी-६०० तक पतला करें । चलो संस्कृति २०० आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए के साथ 28 डिग्री सेल्सियस की दर से बढ़ने, जब तक यह मध्य लॉग विकास चरण तक पहुंचता है, एक OD-६०० द्वारा 8 से १.० के संकेत दिया । इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 3000 बार ची में घूमते हुए फसल करें।सुपरनेट को त्याग दें। इसके बाद, DDH2O की 1 संस्कृति मात्रा के साथ सेल पिलेट को एक बार धोएं। कोशिकाओं को 3000 समय ची पर 10 मिनट के लिए स्पिन करें और सुपरनेट को त्यागें।फिर, 20 मिलीलीटर ग्लास पिपेट का उपयोग करके, DDH2O में सावधानी से सेल पिलेट को फिर से निलंबित करें। जिससे ट्रोजन हॉर्स परख के लिए अंतिम ओडी-600 से 3.0 या रोग रेटिंग के लिए 1.0 का समायोजन किया जा सके। भूलभुलैया के पौधों को वयस्क पत्तियों के चरण में खेती करें, जहां कम से कम पत्ती 7 डंठल के भीतर बढ़ती है।इसके बाद, यूमाडस संस्कृति को 20 गेज द्वि एक हाइपोडर्मिक सुई के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंज में स्थानांतरित करें। दर्पण स्टेम ऊतक को स्थानीयकृत करने के लिए डंठल को सावधानी से दबाें। दर्पण स्टेम के आधार को कठिन डंठल से नरम ऊतक तक संक्रमण से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।एक कलम का उपयोग कर डंठल पर दर्पण स्टेम चिह्नित करें। शूट मिरर स्टेम या इनफ्लोरेसेंस मिरर स्टेम के ऊपर 1.5 मिलीलीटर यूमाडस कल्चर 1 सेंटीमीटर इंजेक्ट करें। एक बार भूलभुलैया के पौधे लटकन चरण तक पहुंच जाते हैं, तो तने में लटकन को स्थानीयकृत करने के लिए डंठल को ध्यान से दबादें।एक कलम का उपयोग कर स्टेम पर लटकन के टिप और आधार को चिह्नित करें। तासल के चारों ओर इनोकुलम के कुल 1.5 मिलीलीटर इंजेक्ट करने के लिए 20 गेज द्वि एक हाइपोडर्मिक सुई के साथ 3 मिलीलीटर सिरिंज में यूमाडस संस्कृति को स्थानांतरित करें। इनोकुलम के समान वितरण का बीमा करने के लिए, धीरे-धीरे 5 मिलीलीटर टिप, मध्य और कलम के साथ चिह्नित लटकन के आधार पर रखें।20 गेज द्वि एक हाइपोडर्मिक सुई के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज में यूमाडस संस्कृति स्थानांतरित करें। कान को घायल किए बिना भूसी के पत्तों के बीच अंतरिक्ष में टीका सुई को गहराई से इंजेक्ट करें, फिर कान के चारों ओर 1.5 मिलीलीटर को छोड़ दें। इसके बाद, सिरिंज और सुई को हटा दें और यूमाडस समाधान को समान रूप से वितरित करने के लिए कोख की सावधानीपूर्वक मालिश करें।एक पीडी चारकोल बरमा प्लेट पर इनोकुलम के 10 माइक्रोलीटर ड्रॉप। फिर 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। हाइफाई स्राव ZM Mach1 फ्लोरोसेंट और चेरी सिग्नल से घिरे हुए हैं।इसके विपरीत, गैर-सचिव हाइफा केवल फंगल साइटोप्लाज्म में फ्लोरोसेंट सिग्नल दिखाते हैं। अनुचित लटकन स्थानीयकरण या इनोकुलम के असमान वितरण के परिणामस्वरूप गैर संक्रमित लटकन या यहां तक कि वितरण की तुलना में लटकन का केवल आंशिक संक्रमण हो सकता है। एकल रोगजनक ट्रोजन हॉर्स प्रोजेनस्टर तनाव एसजी-200, पीडी चारकोल बरमा पर सुसंस्कृत, प्लेट पर सफेद फुलाना तंतु के रूप में दिखाया गया है।जबकि यूमाडस तनाव FB1 संक्रामक फिलामेंट गठन से पहले संभोग की आवश्यकता है । संक्रमण के बाद, संकेतों की संभावित प्रतिक्रिया ट्रोजन हॉर्स लिवर प्रोटीन का विश्लेषण रोग रेटिंग या सूक्ष्म इमेजिंग सहित विभिन्न तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है। कई रोगजनकों के लिए, परिवर्तन और स्राव को अच्छी तरह से समझा जाता है और इसी तरह से पता लगाया जा सकता है।इसलिए, वे मेजबान के अध्ययन को सक्षम करते हैं, जो परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील नहीं होते हैं।

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

संयंत्र पैथोजन की आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; फफूंद जीवविज्ञान और संयंत्र सूक्ष्म जीव बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

लक्षित<em&gt; बगल में</emनवोदित खमीर में&gt; mutagenesis Histone के जीन

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Drosophila भ्रूण और Tyramide संकेत प्रवर्धन का उपयोग कर ऊतकों में सीटू संकरण में उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

डीएनए प्रतिकृति एक Vivo में मॉडल प्रणाली के रूप में Zebrafish का उपयोग समय की रूपरेखा

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

वयस्क और नवजात चूहों के भीतरी कानों में स्थानीय दवा वितरण के लिए एक शल्य दृष्टिकोण के रूप में Canalostomy

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

सीटू संकरण में पूरे माउंट द्वारा टिक हिम्मत में Microbiota के दृश्य

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

वैकल्पिक पूर्व का मात्रात्मक विश्लेषण माउस मस्तिष्क वर्गों में mRNA ब्याह सीटू संकरण परख में आरएनए का उपयोग

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

टिशू-विशिष्ट miRNA में अभिव्यक्ति की रूपरेखा माउस दिल वर्गों में प्रयोग सीटू संकरण

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

क्रोमोजेनिक में सीटू हाइब्रिडाइजेशन एचपीवी से संबंधित सिर और गर्दन कैंसर निदान के लिए एक उपकरण एस

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...