Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
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著者は、ラボ スペースおよび植物材料を提供するためトーマス ドレッセルハウス場、マーティン Parniske、ヌールディン Djella とアーミン ヒルデブラントを感謝したいです。トロイの木馬方式のオリジナル作品は、レオポルジナ ポスドク親睦と NSF プロジェクト IOS13 39229 によって支えられました。この記事で紹介した作品は、DFG の SFB924 (A14 と B14 のプロジェクト) によって支えられました。

1.米国アルテリシジン木馬の建設
注:図 1を参照してください。
<ol><li>遺伝子特定のプライマーおよび校正のポリメラーゼは DNA を使用してトウモロコシの cDNA からの興味の遺伝子を増幅します。プライマリの PCR の製品をクローンし、大腸菌プラスミドのベンダーの指示に従って.構造体に変換サンガーのクローン作...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

現代の作物研究は、遺伝子の分子生物学的解析とタンパク質レベルのプロトコルを要求します。遺伝的アクセシビリティを介して変換はありません利用可能なまたは非効率的でトウモロコシなどほとんどの作物種のため時間がかかるです。また、プロモーター レポーター システムなど信頼性の高い遺伝的ツールが不足している、異なる組織サイトで高時空間解像度でその場でタンパ?...

赤病原体経路トウモロコシ黒穂病病1の原因となるエージェントです。Melanized、黒い胞子を含む大きな腫瘍でトウモロコシのすべての空中部分に感染します。グローバル レベルで米国アルテリシジンはメキシコで美食珍味として腫瘍を感謝しながらトウモロコシ収量の約 2% の年次損失を引き起こすと推定されます。植物の感染症は、トウモロコシの表皮細胞の最初の層を貫通する細胞壁溶解酵素を分泌する付着器によって開始されます。一次感染サイトから米国アルテリシジン成長細胞内と intercellularly、毎日1,2層 1 ~ 2 セルに侵入します。5 日に目に見える腫瘍に変わる植物の肥大で成功の感染結果感染1,3,4を投稿します。段階すべて感染菌糸はホスト細胞質1,2に任意の直接接触しなくても植物細胞質膜を鞘に収めた。感染菌糸と植物細胞膜間のタイトな apoplasmic スペースは、赤の相互作用ゾーンと呼ばれる宿主・病原体のインタラクティブなサイトと見なされます。植物自然免疫系を克服するためには、米国アルテリシジンは赤相互作用ゾーン1にエフェクター蛋白質の配列を分泌します。他の赤の相互作用ゾーン5,6,7,8のままいくつかのエフェクタの植物細胞にとられます。1 つ細胞壁のエフェクターは、シグナル伝達ペプチド ZmZIP1 ZmPROZIP から細胞壁プロテアーゼ活性9,10のリリースを防ぐためにトウモロコシの細胞壁酵素と相互作用する UmPit2 です。
最後の十年にわたって米国アルテリシジンなった植物-病原菌の相互作用、菌類の遺伝学もバイオ テクノロジー遺伝子手軽周知のライフ サイクルのために貴重なツールのためのモデルだけとの異種発現分泌タンパク質11,12,13。両方の従来型およびタンパク質の分泌のための信号は、翻訳後修飾14の制御を可能に決定されています。最近、米国アルテリシジンは小さい、勉強するトロイの木馬ツール分泌されるその場15トウモロコシ蛋白質として採用されました。トロイの木馬のアプローチは、小さな、分泌された蛋白質は葯の発達に関与する ZmMAC1 の機能を分析する正常に使用されました。ZmMAC1 は、多能性細胞と新しく生まれてくる細胞15の細胞運命仕様の周縁部を誘導します。同じ方法では、トウモロコシの被害関連ペプチド ZmZIP1 の生物学的機能が明らかになった。米国アルテリシジンZmZIP1 は、トウモロコシを分泌障害、腫瘍形成10です。したがって、トロイの木馬のアプローチを表す貴重な代替ルートはどちらも高時空間解像度でその場研究でタンパク質に必要な安定したトウモロコシ変換行もの組織浸潤の世代クローン発現と精製したタンパク質。特に、トロイの木馬戦略は、トウモロコシのアポプラストに任意の異種タンパク質の分泌と同じ組織内にある感染対非感染植物細胞の直接比較をできます。
このプロトコルは興味の蛋白質を調査する米国アルテリシジントロイの木馬歪みを生成するための主な手順を示しています。それさらを含む 3 つの異なるトウモロコシ組織型 (成人の葉、タッセルと耳) の感染対策に関する正確な情報米菌と時空間感染の進行そして蛋白質の機能を研究するための前提条件であります。これらのターゲットのティッシュ。それ以上の仕様は、トウモロコシの遺伝子増幅し顕微鏡イメージング技術、手順、ターゲット特定機器に依存したので。したがって、このプロトコルは、標準的な分子生物学の技術の経験豊富なユーザーに解決されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Homer´s トロイの木馬神話に触発され、我々 はトウモロコシの病原体に体内の表現型解析を許可するトウモロコシのアポプラストから分泌されるタンパク質を提供する経路を設計されています。このメソッドは、トウモロコシの変換に依存しないが、微生物遺伝学、病原体の分泌機能を悪用します。ここで、体内の検査感染サイトや組織の異なる種類の高時空間解像度の分泌された蛋白質を配信できます。トロイの木馬戦略は一過性機能的タンパク質ドメイン、オフのターゲット蛋白質の効果を分析したり、オンサイド タンパク質過量投与、それにのための強力なツールを研究を特徴づけるためのトウモロコシの機能喪失の表現型を補完するために利用できます。トウモロコシの収穫システムにおけるタンパク質研究。この作業には、3 種類の異なるトウモロコシ組織にこのメソッドを適用するプロトコルを標準化された感染症に続いてトロイの木馬ひずみが発生する方法の正確なプロトコルが含まれています。

米国アルテリシジンのトロイの木馬の実験のための構造は、プラスミド p123 PUmpit2-Umpit2Sp-関心 mCherry の遺伝子-Haに複製されます。MCherry蛍光レポーターとエピトープHAに興味のトウモロコシの遺伝子を融合-タグ。融合タンパク質の発現は、特に感染21中に活性化され...

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Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

トロイの木馬として経路を用いたトウモロコシ蛋白質場配信で

この作品は、3 つの異なったタイプのトウモロコシのティッシュに分泌されたトウモロコシ蛋白質の原配信経路トロイの木馬ひずみのクローニングについて説明します。

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

遺伝的およびタンパク質レベルに関するプロセスを調査することは、作物研究において非常に重要です。我々のアプローチは異なった伝染の側面およびティッシュで最も高い空間時間分解能の分泌された迷路蛋白質の点検を可能にする。トロイの木馬法は有用なオトマトスの分泌能力を探る。それは時間がかかり、挑戦的な迷路の変換を回避し、迷路のアペルプラッツ内の分泌タンパク質に関する詳細な研究を容易にします。追加された迷路の葉、タッセルや耳の適切な感染に関する詳細情報。そして、標的組織における感染の進行とタンパク質機能の成功した研究を示す。手順を実証するのは、研究室の卒業生であるイザベル・フィドラーです。実験を開始するには、滅菌パスツールピペットを使用してペディエータープレートからユーマドゥーを引っ掻きます。ユーマドゥーでYEPSライトミディアムを5ミリリットル接種する。200 rpmで16時間一定の揺れをとり、28°Cで培養を成長させます。翌日は、新鮮なYEPSライト900マイクロリットルと100マイクロリットルの一晩培養液を混合します。分光光度計分析で、YEPSライトメディアをブランクとしてOD-600を測定します。新鮮なYEPSライトミディアムで一晩培養して、2のOD-600に希釈します。培養は、8~1.0のOD-600で示される、中間対数成長期に達するまで、200rpmで一定の揺れで28°Cで成長させます。インキュベーション後、細胞を3000回のchiで10分間回転させて収穫する。上清を捨てます。次に、セルピレットを1回DDH2Oの培養体積で1回洗浄する。3000タイムチーで細胞を10分間回転させ、上清を捨てます。次いで、20ミリリットルのガラスピペットを用いて、DDH2Oで細胞ピレットを慎重に再懸濁する。トロイの木馬アッセイの最終的なOD-600 TO 3.0を調整し、疾患評価のために1.0を調整する。少なくとも葉7が茎の中に成長する成体の葉の段階に迷路植物を栽培します。次に、ユーマドゥー文化を20ゲージbi 1皮下注射針で3ミリリットルの注射器に移す。茎を慎重に押して、ミラーステム組織を局所化します。ミラーステムの基部は、より硬い茎からより柔らかい組織への移行によって区別することができる。ペンを使用して、茎のミラーステムをマークします。シュートミラーステムまたは花序ミラーステムの上に1センチメートルのユーマズ培養液1.5ミリリットルを注入します。迷路の植物がタッセルステージに到達したら、茎を慎重に押して茎のタッセルを局所化します。ペンを使用して、ステムの先端とタッセルのベースをマークします。ユーマドゥー文化を20ゲージのビ1皮下注射針で3ミリリットルの注射器に移し、タッセルの周りに合計1.5ミリリットルの接種液を注入する。接種物の等分布を保証するために、ペンでマークされた先端、真ん中、およびタッセルのベースに5ミリリットルをゆっくりと置きます。ユーマドゥー文化を20ゲージビ1皮下注射針で3ミリリットルシリンジに移す。耳を傷つけずに、できるだけ深く殻の葉の間の空間に接種針を注入し、耳の周りに接種物の1.5ミリリットルを放出する。次に、注射器と針を取り出し、慎重にコブをマッサージしてユーマドゥー溶液を均等に分配します。PD炭オーガープレートに10マイクロリットルの接種液を滴下します。その後、室温で2日間インキュベートします。ZMマッハ1を分泌するハイファエは、蛍光と桜の信号に囲まれています。対照的に、非分泌性ヒphphaeは真菌細胞質において蛍光シグナルのみを示す。不適切なタッセルの局在またはinoculumの不等分分布は、非感染したタッセルまたは偶数分布と比較して、タッセルの部分的な感染をもたらす可能性があります。単独病原性トロイの木馬プロジェネ生成株SG-200は、PD炭オーガー上で培養され、図示されるようにプレート上に白い綿毛フィラメントを形成する。ユーマドゥー株FB1は感染性フィラメント形成前に交配を必要とする。感染後、トロイの木馬の肝臓タンパク質の兆候の可能性のある応答は、疾患評価または顕微鏡イメージングを含む様々な方法を使用して分析することができる。多くの病原体にとって、形質転換と分泌はよく理解されており、同様の方法で探索することができる。したがって、これらは、変換の影響を受けにくいホストの研究を可能にします。

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

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ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

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In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

成人および新生児マウス内耳への薬剤の局所投与への外科的アプローチとしての Canalostomy

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

発色性の発色性ハイブリダイゼーションは、HPV関連の頭頸部癌診断のためのツールを提供する

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...