Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
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저자는 토마스 Dresselhaus, 마틴 Parniske, 누 Djella, 그리고 아 르 민 힐 데 브란트 실험실 공간 및 식물 소재 제공 감사 하 고 싶습니다. 트로이 목마 방법에 원래 작업 Leopoldina postdoc 친교와 NSF 프로젝트 IOS13 39229에 의해 지원 되었다. 이 문서에 제공 된 작업 (프로젝트 A14 및 나사 B14) SFB924 DFG의 지원 했다.

1. 미국 maydis 트로이 목마의 건설
참고: 그림 1을 참조 하십시오.
<ol><li>옥수수 cDNA 유전자 특정 뇌관과 교정의 DNA 중 합 효소를 사용 하 여에서 관심사의 유전자를 증폭. 기본 PCR 제품을 복제 하 고 대장균 플라스 미드 공급 업체의 지침. 구조를 변환 생어 시퀀싱 전에 다음 복제 단계 사용 하 여 관심 시퀀스의 정확한 유?...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

현대 작물 연구에서 유전 분자 분석 및 단백질 수준에 대 한 프로토콜을 요구합니다. 유전 접근을 통해 변환 사용할 수 또는 비효율적이 고 옥수수 등 대부분 작물 종에 대 한 시간이 아니다. 또한, 발기인 기자 시스템 등 신뢰할 수 있는 유전 도구 부족, 어려운 별개 조직 사이트에서 고해상도 spatiotemporal 원래의 단백질 기능을 공부 하는. Apoplastic 단백질 조직으로 heterologously 표현 하 고 순화...

Biotrophic 병원 체 Ustilago maydis 1옥수수 smut 질병 원인이 되는 에이전트입니다. 그것은 모든 공중 부분 melanized, 검은 포자를 포함 하는 큰 종양에 따른 옥수수의 감염. 글로벌 수준에서 미국 maydis 종양 멕시코의 gastronomical 진미로 평가 되는 동안 옥수수 생산량의 약 2%의 연간 손실 발생으로 추정 된다. 식물 감염 옥수수 표 피 세포의 첫 번째 계층에 침투를 lysing 효소 세포 벽을 분 비 하는 appressorium에 의해 시작 됩니다. 1 차 감염 사이트에서 미국 maydis 성장 침 및 intercellularly, 모든 주1,2레이어 1 ~ 2 셀에 침입. 5 일 시 보이는 종양으로 공장 비 대에 성공적인 감염 결과 감염1,,34게시. 모든 감염 단계 곰 팡이 균 invaginate 호스트 세포질1,2에 직접 접촉 하지 않고 공장 세포질 막. 감염 균과 식물 원형질 막 사이 공간을 꽉 apoplasmic biotrophic 상호 작용 영역 이라는 호스트/병원 체 인터랙티브 사이트로 간주 됩니다. 극복 하기 위해 공장 타고 난 면역 계통, 미국 maydis biotrophic 상호 작용 영역1에 effector 단백질의 배열을 은닉 한다. 반면 다른 사람 biotrophic 상호 작용 영역5,6,,78에 어떤 이펙터 식물 세포에 의해 찍힌다. 1 apoplastic 이펙터 UmPit2 신호 펩 티 드 ZmZIP1 ZmPROZIP에서 apoplastic 프로 테아 제 활동9,10의 출시를 방지 하기 위해 옥수수 apoplastic 프로 테아 제와 상호 작용 하는.
지난 십년 동안 미국 maydis 되었다만 식물 병원 체 상호 작용에서 곰 팡이 유전학 뿐만 아니라 생명 공학 파악된 수명 주기, 쉬운 유전 접근 가능성 때문에 귀중 한 도구에 대 한 모델 및 분리 식의 분 비 단백질11,,1213. 모두 기존과 파격적 단백질 분 비에 대 한 신호 posttranslational 수정14의 제어를 허용 결정 되었습니다. 최근, 미국 maydis 트로이 목마 도구 작은, 공부를 해 라15옥수수 단백질 분 비로 고용 되었다. 트로이 목마 접근 작은, 분 비 단백질은 꽃 밥 개발에 관여 하는 ZmMAC1의 기능 분석을 성공적으로 사용 되었다. ZmMAC1 유도 만능 세포 및 세포 운명 명세의 새로 형성된 된 셀15의 periclinal 부문 합니다. 같은 방법으로는 옥수수 손상 관련 된 펩 티 드 ZmZIP1의 생물 학적 기능으로 밝혀졌다. 미국 maydis 귀착되 었 다 ZmZIP1 옥수수 은닉 종양 형성10손상. 따라서, 트로이 목마 접근 방식을 나타내는 단백질도 않는 spatiotemporal 고해상도 현장 연구에 귀중 한 대체 경로 필요 안정적인 옥수수 변환 라인도 함께 조직 침투의 세대 heterologously 표현 및 순화 된 단백질입니다. 특히, 트로이 목마 전략 옥수수 apoplast에 어떤 분리 단백질의 분 비와 같은 조직 내에서 감염 되지 않은 식물 세포 감염 대 의 직접 비교 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 관심사의 단백질을 공부 하는 미국 maydis 트로이 목마 스트레인을 생성 하기 위한 주요 단계를 보여 줍니다. 그것은 더 포함 (성인 잎, 술과 귀) 3 다른 옥수수 조직 유형의 감염 절차에 정확한 정보 미 maydis, spatiotemporal 감염 진행 및 단백질 기능을 공부에 대 한 전제 조건입니다. 이러한 대상 조직. 아니 추가 사양은 옥수수 유전자 증폭에 부여 하 고 있기 때문에 이러한 단계는 특정 대상 및 악기 종속적 기법, 영상 현미경입니다. 따라서,이 프로토콜은 표준 분자 생물학 기술의 숙련 된 사용자에 게 제시 된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Homer´s 트로이 말 신화에서 영감을, 우리 옥수수 병원 체 Ustilago maydis vivo에서 phenotypic 분석을 허용 하는 옥수수 apoplast으로 분 비 단백질을 제공 하도록 설계. 이 방법은 옥수수 변환에 의존 하지 않는 하지만 미생물 유전학 및 병원 균의 분 비 기능을 악용. 여기, vivo에서의 검사 전달 감염 사이트 및 직물의 다른 종류에서 spatiotemporal 고해상도 단백질 분 비 수 있습니다. 트로이 목마 전략 정도 기능 단백질 도메인, 분석에서 대상 단백질 효과, 또는 온 사 이드 단백질 overdosage를 위한 강력한 도구를 만드는 연구를 특성화 하기 위해 옥수수 기능 손실 고기를 보완 하기 위해 이용 될 수 있다 옥수수 작물 시스템에서 단백질 연구입니다. 이 작품 뒤에 3 개의 다른 옥수수 조직 형식에이 메서드를 적용 하는 표준화 된 감염 프로토콜 트로이 목마 긴장을 생성 하는 방법에 정확한 프로토콜을 포함 합니다.

미국 maydis 트로이 목마 실험에 대 한 구문은 플라스 미드 p123 PUmpit2-SpUmpit2-관심-mCherry의 유전자-하에 복제 됩니다. 관심의 옥수수 유전자 mCherry 형광 기자와 하는 epitope에 융합-태그. 융해 단백질의 표정은 감염21동안 활성화 특히 미국 maydis Umpit2 발기인의 ...

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Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 사용 하

이 작품 옥수수 조직의 세 가지 유형으로 옥수수 단백질 분 비의 원래의 장소에 배달에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 스트레인의 복제에 대해 설명 합니다.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

유전 및 단백질 수준에 프로세스를 조사하는 것은 작물 연구에서 중요합니다. 우리의 접근은 다른 감염 측및 조직에 가장 높은 공간 측두성 해상도를 가진 분비한 미로 단백질의 검사를 가능하게 합니다. 트로이 목마 방법은 유용한 오토마토 분비 기능을 탐구한다.그것은 시간이 많이 걸리고 도전적인 미로 변환을 우회하고, 미로 아펠 플라츠 내에서 분비 된 단백질에 대한 자세한 연구를 용이하게한다. 추가 된 미로 잎, 술 및 귀의 적절한 감염에 대한 자세한 정보. 및 표적 조직에서 감염 진행 및 단백질 기능에 대한 성공적인 연구를 보여줍니다.절차를 시연하는 것은 실험실에서 졸업생인 이사벨 피들러(Isabell Fiedler)가 될 것입니다. 실험을 시작하려면 멸균 저온 살균 기르 파이펫을 사용하여 페디아트 플레이트에서 유마두를 긁습니다. 유마두와 YEPS 빛 매체의 5 밀리리터를 접종.16시간 동안 200rpm에서 일정한 흔들림으로 28도에서 문화를 성장시다. 다음날 신선한 YEPS 빛의 900 마이크로리터와 100 마이크로리터의 하룻밤 문화를 혼합합니다. YEPS 라이트 매체를 분광광계 분석에서 빈 값으로 사용하여 OD-600을 측정합니다.신선한 YEPS 라이트 매체로 하룻밤 문화를 희석하여 OD-600의 2개에 희석합니다. 문화권이 200rpm에서 일정한 흔들림으로 섭씨 28도에서 성장하게 하고, 8~1.0의 OD-600으로 표시된 중간 로그 성장 단계에 도달할 때까지. 인큐베이션 후, 10 분 동안 3000 번 치로 회전하여 세포를 수확하십시오.상부체를 폐기합니다. 다음으로, DDH2O의 배양부 1부로 셀 필렛을 한 번 세척한다. 셀을 3000시간 치에서 10분 동안 회전시키고 상체를 폐기합니다.그런 다음, 20 밀리리터 유리 파이펫을 사용하여 DDH2O에서 셀 필렛을 조심스럽게 다시 중단합니다. 따라서 트로이 목마 분석에 대한 최종 OD-600 ~ 3.0 또는 질병 등급의 경우 1.0을 조정합니다. 미로 식물을 성인 잎의 단계로 육성하여 적어도 잎 7이 줄기 안에서 자랍니다.다음으로, 유마드 문화를 20 게이지 bi 하나의 피하 바늘로 3 밀리리터 주사기로 옮는다. 줄기를 조심스럽게 눌러 거울 줄기 조직을 국소화하십시오. 거울 줄기의 베이스는 더 단단한 줄기에서 부드러운 조직으로의 전환으로 구별 될 수 있습니다.펜을 사용하여 줄기에 거울 줄기를 표시합니다. 촬영 거울 줄기 또는 꽃무성 거울 줄기 위의 유마드 문화의 1센티미터 1.5 밀리리터를 주입합니다. 미로 식물이 술 단계에 도달하면 줄기를 조심스럽게 눌러 줄기의 술들을 국소화하십시오.펜을 사용하여 줄기에 술의 끝과 베이스를 표시합니다. 유마드 문화를 3 밀리리터 주사기로 옮기고 20 게이지 bi 1 피하 바늘을 사용하여 술 주위의 접종비의 총 1.5 밀리리터를 주입합니다. 무접종의 동등한 분포를 보장하기 위해 펜으로 표시된 술의 끝, 중간 및 바닥에 5 밀리리터를 천천히 놓습니다.유마드 문화를 20 게이지 bi 1 피하 바늘로 3 밀리리터 주사기로 옮는다. 귀를 손상시키지 않고 가능한 한 깊게 껍질 잎 사이의 공간에 접종 바늘을 주입한 다음 귀 주위의 접종 비응고 1.5 밀리리터를 방출합니다. 다음으로 주사기와 바늘을 제거하고 조심스럽게 코브를 마사지하여 유마드 용액을 동등하게 분배합니다.PD 숯 오거 플레이트에 10 마이크로리터의 접종을 떨어 뜨립니다. 그런 다음 실온에서 2 일 동안 배양하십시오. Hyphae 분비 ZM Mach1은 형광및 체리 신호로 둘러싸여 있습니다.대조적으로, 비분균 최면은 곰팡이 세포질에서 형광 신호를 보여줍니다. 부적절한 술 국소화 또는 부동적 분포는 비감염된 술또는 짝수 분포에 비해 술의 부분적인 감염을 초래할 수 있다. PD 숯 오거에서 배양된 솔로 병원성 트로이 목마 프로게스터 균주 SG-200은 표시된 대로 접시에 흰색 보풀 필라멘트를 형성합니다.유목민 균주 FB1 전염성 필라멘트 형성 전에 짝짓기를 필요로하는 동안. 감염 후, 트로이 목마 간 단백질의 가능한 반응은 질병 등급 또는 현미경 이미징을 포함한 다양한 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 많은 병원균의 경우, 변형과 분비도 잘 이해되며 유사한 방식으로 탐구 할 수 있습니다.따라서 변환에 취약하지 않은 호스트의 연구를 활성화합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달에 대 한 외과 접근으로 Canalostomy

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

시투 혼성화에서 발색성 HPV 관련 두경부 암 진단을 위한 도구

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...