Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella og Armin Hildebrand for å gi lab plass og plante materiale. Den opprinnelige arbeidet på trojansk hest metoden ble støttet av en Leopoldina postdoktor fellesskap og NSF prosjekt IOS13-39229. Arbeidet presentert i denne artikkelen ble støttet av SFB924 (prosjekter A14 og B14) av DFG.

1. bygging av en U. maydis trojansk hest
Merk: Se figur 1.
<ol><li>Forsterke et genet av interesse fra mais cDNA gen-spesifikke primer og en korrekturlesing DNA polymerase. Klone primære PCR produktet og Konstruer forvandle E. coli følge plasmider leverandørens instrukser. Kontroller riktig genet av interesse av Sanger sekvensering før bruk neste kloning trinnene. Merk: PCR spesifikasjoner må o...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

Moderne beskjære forskning krever protokoller for molekylær analyse på genetisk og protein nivå. Genetisk tilgjengelighet via transformasjon er ikke tilgjengelig eller ineffektiv og tidkrevende for beskjære artene som mais. Videre er pålitelig genetisk verktøy som formidler reporter systemer knappe, som gjør det vanskelig å studere i situ protein funksjon med høy spatiotemporal oppløsning på forskjellige vev steder. Apoplastic proteiner kan studeres ved infiltrasjon av heterologously uttrykt og rense...

Biotrophic patogen Ustilago maydis er den utløsende agenten av mais sote sykdom1. Den infiserer alle antennen deler av mais som resulterer i store svulster som inneholder melanized, svart sporer. På det globale nivået anslås U. maydis for å forårsake en årlig tap på rundt 2% av mais avkastning, mens svulster er verdsatt som en gastronomisk delikatesse i Mexico. Anlegget infeksjon er initiert av en appressorium som skiller celleveggen lysing enzymer for å trenge gjennom det første laget av mais epidermal celler. Fra en primær infeksjon nettsted, U. maydis vokser intracellulært og intercellularly, invadere en til to cellen lag hver dag1,2. Vellykket infeksjon resultater i anlegget hypertrofi som blir synlige svulster på fem dager legge infeksjon1,3,4. Under alle infeksjon stadier invaginate fungal hyfer plante cytoplasma membranen uten noen direkte kontakt til verten cytoplasma1,2. Stram apoplasmic avstanden mellom de infisere hyfer og plante plasma membranen anses å være vert/patogen interaktive området, kalt biotrophic samspill sonen. For å overvinne plante medfødte immunsystemet, ut U. maydis en rekke effektor proteiner i biotrophic interaksjon sone1. Noen effektor er tatt opp av plante celler, mens andre forblir i biotrophic interaksjon sone5,6,7,8. En apoplastic effektor er UmPit2, som kommuniserer med apoplastic mais proteaser å hindre utgivelsen av signalnettverk peptid ZmZIP1 fra ZmPROZIP av apoplastic protease aktivitet9,10.
De siste tiårene, U. maydis ble ikke bare en modell for sopp genetikk i plante-patogen interaksjon, men også et verdifullt verktøy i bioteknologi på grunn av en godt forstått livssyklus, lett genetisk tilgjengelighet og heterologous uttrykk for utskilles proteiner11,12,13. Signaler for begge konvensjonelle og ukonvensjonelle protein sekresjon har fastslått at kontroll av posttranslational modifikasjoner14. U. maydis ble nylig ansatt som et trojansk hest-verktøy for å studere små, utskilles mais proteiner i situ15. Trojansk hest tilnærming ble brukt til å analysere funksjonen til små, utskilles protein ZmMAC1 som er involvert i anther utvikling. ZmMAC1 induserer periclinal delingen av pluripotent celler og celle skjebne spesifikasjon av nydannede celler15. På samme måte, ble biologiske funksjonen av mais skade-assosiert peptid ZmZIP1 avslørt. U. maydis sekresjon mais ZmZIP1 resulterte i nedsatt tumor formasjon10. Dermed trojansk hest tilnærming representerer en verdifull alternativ rute til proteinet i situ studier med spatiotemporal med høy oppløsning som ikke verken krever generasjon stabil mais transformasjon linjer eller vev infiltrasjon med heterologously uttrykt og renset proteiner. Spesielt kan trojansk hest strategien utskillelsen av noen heterologous protein i mais apoplast og direkte sammenligning av infiserte versus ikke-infiserte anlegget celler i samme vev.
Denne protokollen illustrerer de viktigste trinnene for å generere en U. maydis trojansk hest belastning å studere et protein av interesse. Ytterligere inkluderer presis informasjon om infeksjon prosedyrer av tre forskjellige mais vev (voksen blader, dusker og ører) med U. maydis, som er en forutsetning for å studere spatiotemporal infeksjon progresjon og protein funksjonen i disse mål vev. Ingen ytterligere spesifikasjoner er gitt på mais gene forsterkning og mikroskopiske imaging teknikker, siden disse trinnene er målet spesifikke og instrument-avhengige. Derfor er denne protokollen adressert til erfarne brukere av standard molekylærbiologi teknikker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Inspirert av Homer´s Trojan hest myte, vi utviklet mais patogen Ustilago maydis å levere utskilles proteiner i mais apoplast tillater i vivo fenotypiske analyse. Denne metoden er avhengig ikke av mais transformasjon, men utnytter mikrobiell genetikk og sekretoriske evner av patogener. Dette dokumentet, innrømmer den inspeksjon av i vivo levert utskilles proteiner med høy spatiotemporal oppløsning på forskjellige typer infeksjon nettsteder og vev. Trojansk hest strategien kan benyttes for å utfylle mais tap-av-funksjon fenotyper, funksjonelt betegner protein domener, analysere off-målet protein effekter eller studere onside protein overdosage, gjør det et kraftig verktøy for transiently protein studier i mais beskjære systemet. Dette arbeidet inneholder en presis protokoll på hvor å utvikle en trojansk hest belastning etterfulgt av standardiserte infeksjon-protokoller for å bruke denne metoden på tre forskjellige mais vev typer.

Konstruksjoner for U. maydis trojansk hest eksperimenter er klonet i plasmider p123-PUmpit2-SpUmpit2-genet av interesse-mCherry-Ha. Mais genet av interesse er smeltet mCherry fluorescens reporter og en epitope HA-kode. Uttrykket av fusion protein er under kontroll U. maydis Umpit2 som aktiveres spesielt under infeksjon21. Å direkte ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Bruker Ustilago maydis som en trojansk hest for i Situ levering av mais proteiner

Dette verket beskriver kloning av en Ustilago maydis trojansk hest belastning for i situ levering av utskilles mais proteiner i tre typer mais vev.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Undersøke prosesser på genetiske og proteinnivåer er avgjørende i avling forskning. Vår tilnærming muliggjør inspeksjon av utskillede labyrintproteiner med høyeste romlige temporale oppløsning på forskjellige infeksjonssider og vev. Trojansk hest metoden utforsker nyttige automatiske sekretoriske evner.Det omgår tidkrevende og utfordrende labyrint transformasjoner, og forenkler detaljerte studier på utskillede proteiner i labyrinten appelplatz. Detaljert informasjon om riktig infeksjon av ekstra labyrintblader, dusker og øre. Og viser den vellykkede studien av infeksjonsprogresjon og proteinfunksjon i målvevet.Viser prosedyren vil være Isabell Fiedler, en grad student fra laboratoriet. For å begynne eksperimentet, skrap Eumadous fra en pediatrplate ved hjelp av en steril pasteurpipette. Inokuler 5 milliliter YEPS Light Medium med Eumadous.Øk kulturen ved 28 grader Celsius, med konstant risting på 200 rpm i 16 timer. Neste dag blander du 900 mikroliter friske YEPS Light med 100 mikroliter av overnattingskulturen. Mål OD-600 ved hjelp av YEPS Light Medium som en tom i spektrofotometeranalysen.Fortynn nattkulturen med frisk YEPS Light Medium til en OD-600 av 2. La kulturen vokse på 28 grader Celsius med konstant risting på 200 rpm, til den når midt loggvekstfasen, indikert av en OD-600 av 8 til 1,0. Etter inkubasjon høste cellene ved å spinne dem på 3000 ganger chi i 10 minutter.Kast det overnaturlige. Deretter vasker du cellepilette en gang med 1 kulturvolum ddh2o. Spinn cellene ved 3000 gang chi i 10 minutter og kast supernatanten.Deretter, re-suspendere celle pilette nøye i DDH2O, ved hjelp av en 20 milliliter glass pipette. Dermed justere den endelige OD-600 TIL 3.0 for en trojansk hest analyse eller 1.0 for sykdom rating. Dyrke labyrintplantene til et stadium av voksne blader, hvor minst blad 7 vokser i stilken.Deretter overfører eumadous kulturen til en 3 milliliter sprøyte med en 20 gauge bi en hypodermisk nål. Trykk stilken nøye for å lokalisere Mirror Stem Tissue. Basen av Mirror Stem kan skilles ved en overgang fra hardere stilk til mykere vev.Merk speilstammen på stilken ved hjelp av en penn. Injiser 1,5 milliliter eumadøs kultur 1 centimeter over Shoot Mirror Stem eller Inflorescence Mirror Stem. Når labyrintplantene når duskstadiet, trykker du på stilken nøye for å lokalisere dusken i stammen.Merk spissen og bunnen av dusken på stammen ved hjelp av en penn. Overfør eumadous kulturen til en 3 milliliter sprøyte med en 20 gauge bi en hypodermisk nål for å injisere totalt 1,5 milliliter av inokulumet rundt dusken. For å sikre lik fordeling av inokulumet, legg sakte 5 milliliter på spissen, midten og bunnen av dusken merket med pennen.Overfør eumadøskulturen til en 3 milliliter sprøyte med 20 gauge bi en hypodermisk nål. Injiser inokulasjonsnålen i mellomrommet mellom skallbladene så dypt som mulig uten å skade øret, og slipp deretter 1,5 milliliter av inokulen rundt øret. Deretter fjerner du sprøyten og nålen og masserer forsiktig cob for å fordele Eumadous-løsningen likt.Slipp 10 mikroliter inokuler på en PD kullskruerplate. Deretter inkuber ved romtemperatur i 2 dager. Hyphae utskillende ZM Mach1 er omgitt av fluorescerende og kirsebær signal.I motsetning viser ikke-hemmelige hyphae bare fluorescerende signal i soppcytoplasma. Feil dusk lokalisering eller ulik fordeling av inoculum kan resultere i ikke-infisert dusk eller bare delvis infeksjon av dusk sammenlignet med selv distribusjon. Den solo patogene trojanske hesten Progenester belastning SG-200, dyrket på PD kull auger, danner hvite fluff filamenter på platen som vist.Mens Eumadous belastning FB1 krever parring før smittsom filament dannelse. Etter infeksjon, mulig respons av tegn trojansk hest leveren protein kan analyseres ved hjelp av ulike metoder, inkludert sykdomsvurderinger eller mikroskopisk avbildning. For mange patogener er transformasjon og sekresjon godt forstått og kan utforskes på en lignende måte.Derfor aktiverer de studiet av verten, som ikke er utsatt for transformasjon.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk manipulering av Plant Patogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Å studere Fungal Biology and Plant mikrobe interaksjoner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; mutagenese av Histone Gener i Budding Gjær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA replikering Timing bruker sebrafisk som en In Vivo modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy som en kirurgisk tilnærming til lokale stoffet levering indre ører voksne og Neonatal mus

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick Guts av hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vev-spesifikke miRNA Expression profilering i musen hjertet delene bruke In Situ hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Kromogen in situ hybridisering SS et verktøy for HPV-relaterte hode og nakke kreftdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...