Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer a Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella e Armin Hildebrand para fornecer material de espaço e a planta do laboratório. O trabalho original sobre o método de cavalo de Troia foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado de Leopoldina e projeto NSF IOS13-39229. O trabalho apresentado neste artigo foi apoiado por SFB924 (projetos A14 e B14) da DFG.

1. construção de um cavalo de Troia maydis U.
Nota: Veja a Figura 1.
<ol><li>Amplifica um gene de interesse do milho do cDNA usando as primeiras demão gene-específico e uma correcção DNA polimerase. Clonar o principal produto do PCR e transformar a construção em Escherichia coli , seguindo as instruções do fornecedor do plasmídeo. Verifique se o gene correto da sequência de interesse pelo prior de sequencia...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

Pesquisa de cultura moderna exige protocolos de análise molecular, a genética e os níveis de proteína. Genética de acessibilidade através de transformação não é disponível ou ineficiente e demorado para a maioria das espécies de culturas como o milho. Além disso, ferramentas genéticas confiáveis tais como sistemas de repórter do promotor são escassas, o que torna difícil para o estudo da função das proteínas in situ com alta resolução spatiotemporal nos sítios de tecidos distintos. Apopl?...

O patógeno biotrófica Ustilago maydis é o agente causador da doença obscenidade milho1. Ele infecta todas as partes aéreas de milho, resultando em tumores grandes que contêm esporos melanized, preto. A nível global, U. maydis é estimado para causar uma perda anual de cerca de 2% do rendimento do milho, enquanto tumores são apreciados como uma iguaria gastronômica no México. Infecção da planta é iniciada por um apressório que secreta enzimas de lise de parede celular para penetrar a primeira camada de células epidérmicas de milho. De um local de infecção primária, U. maydis cresce intracelular e intercellularly, invadindo a célula de uma a duas camadas cada dia1,2. Resultados de infecção bem sucedida na hipertrofia da planta que se transforma em tumores visíveis após cinco dias pós infecção1,3,4. Durante todas as fases da infecção, hifas fúngicas invaginate da membrana do citoplasma de planta sem qualquer contacto directo para o anfitrião citoplasma1,2. O espaço de apoplasmic apertado entre as hifas infectante e a membrana plasmática de planta é considerado a hospedeiro/agente patogénico interativas do site, chamada de zona de interação biotrófica. A fim de superar o sistema imune inato de planta, U. maydis segrega uma matriz de proteínas efetoras para a interação biotrófica zona1. Alguns efetores são ocupados por células vegetais, enquanto os outros permanecem no biotrófica interação zona5,6,7,8. Um efetor apoplástica é UmPit2, que interage com proteases apoplástica milho para impedir a libertação da sinalização do peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplástica protease atividade9,10.
Nas últimas décadas, U. maydis tornou-se não apenas um modelo para a genética de fungosas na interação planta-patógeno, mas também uma ferramenta valiosa na biotecnologia devido a um ciclo de vida bem compreendida, fácil acessibilidade genética e expressão heteróloga de secretado proteínas11,12,13. Foram determinados sinais para ambos secreção de proteína convencional e não convencional que permite o controle de modificações do posttranslational14. Recentemente, U. maydis foi empregado como uma ferramenta de cavalo de Troia para estudar pequeno, secretada milho proteínas em situ15. A abordagem de cavalo de Troia foi usada com sucesso para analisar a função da proteína secretada, pequena ZmMAC1 que está envolvido no desenvolvimento da antera. ZmMAC1 induz a divisão periclinal de células pluripotentes e especificação de destino célula do recém-formado células15. Pelo mesmo método, a função biológica do milho associada a danos peptide ZmZIP1 foi revelada. U. maydis segregar o milho que zmzip1 resultou na deficiente formação de tumor10. Assim, o cavalo de Troia abordagem representa uma valiosa rota alternativa à proteína em situ estudos com alta resolução spatiotemporal que faz nem exigem geração de linhas de transformação de milho estável nem infiltração de tecido com heterologously proteínas expressas e purificadas. Em particular, a estratégia do cavalo de Troia permite a secreção de qualquer proteína heteróloga para o apoplasto milho e comparação direta de infectados contra células não infectadas planta dentro do mesmo tecido.
Este protocolo ilustra as principais etapas para a geração de uma estirpe de cavalo de Troia U. maydis para estudar uma proteína de interesse. Além disso inclui informações precisas sobre os procedimentos de infecção de três tipos de tecido diferentes de milho (folhas adultas, borlas e orelhas) com U. maydis, que é um pré-requisito para estudar a função de progressão e proteína de infecção spatiotemporal nestes tecidos alvo. Sem mais especificações são determinado na amplificação de gene milho e microscópicas de imagens técnicas, uma vez que estas etapas são alvo específico e dependente do instrumento. Assim, o presente protocolo é dirigido aos usuários experientes de técnicas padrão de biologia molecular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Inspirado pelo mito de cavalo de Troia Homer´s, nós produzimos o patógeno milho, Ustilago maydis entregar proteínas secretadas para o apoplasto milho permitindo análise fenotípica em vivo. Este método não se baseia na transformação de milho mas explora recursos secretoras de patógenos e genética microbiana. Neste documento, permite a inspeção de in vivo entregue proteínas secretadas com alta resolução spatiotemporal em diferentes tipos de tecidos e infecção sites. A estratégia do cavalo de Troia pode ser utilizada para complementar transitoriamente milho fenótipos de perda-de-função, caracterizar funcionalmente os domínios da proteína, para analisar os efeitos da proteína alvo, ou estudar a sobredosagem de proteína em jogo, tornando-o uma ferramenta poderosa para estudos de proteína no sistema de colheita de milho. Este trabalho contém um protocolo preciso sobre como gerar uma cepa de cavalo de Troia, seguida de protocolos padronizados de infecção para aplicar esse método para três tipos de tecido diferentes de milho.

Construções para experimentos de cavalo de Troia U. maydis são clonadas em plasmídeo p123-PUmpit2-SpUmpit2-gene de interesse-mCherry-Ha. O milho gene de interesse é fundido a uma repórter de fluorescência de mCherry e um epítopo HA-marca. A expressão da proteína de fusão está sob controle dopit2 U. maydis Um promotor que é especificamente ativa...

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Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Usando o Ustilago maydis como um cavalo de Troia para em Situ entrega de milho proteínas

Este trabalho descreve a clonagem de uma estirpe de cavalo de Troia de Ustilago maydis para a entrega no local das proteínas secretadas de milho em três tipos diferentes de tecidos de milho.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Investigar processos sobre níveis genéticos e proteicos é crucial na pesquisa de culturas. Nossa abordagem permite a inspeção de proteínas de labirinto secretadas com maior resolução temporal espacial em diferentes lados e tecidos de infecção. O Método Cavalo de Tróia explora recursos automatizados úteis.Contorna as transformações de labirintos demoradas e desafiadoras, e facilita estudos detalhados sobre proteínas secretas dentro do labirinto appelplatz. Informações detalhadas sobre a infecção adequada de folhas de labirinto adicionadas, tassels e ouvido. E mostra o estudo bem sucedido da progressão da infecção e da função proteica no tecido alvo.Demonstrando o procedimento será Isabell Fiedler, estudante de pós-graduação do laboratório. Para começar o experimento, arranhe Eumadous de uma placa de pediatr usando uma pipeta pasteur estéril. Inoculado 5 mililitros de YEPS Light Medium com Eumadous.Cresça a cultura a 28 graus Celsius, com agitação constante a 200 rpm por 16 horas. No dia seguinte misture 900 microliters de yeps light frescos com 100 microliters da cultura da noite para o dia. Meça o OD-600 usando o YEPS Light Medium como um branco na análise do espectrofotômetro.Diluir a cultura da noite para o dia com o fresco YEPS Light Medium para um OD-600 de 2. Deixe a cultura crescer a 28 graus Celsius com agitação constante a 200 rpm, até chegar à fase de crescimento do tronco médio, indicada por um OD-600 de 8 a 1,0. Após a incubação, colde as células girando-as a 3000 vezes chi por 10 minutos.Descarte o supernaspeso. Em seguida, lave a pilette celular uma vez com 1 volume de cultura de DDH2O. Gire as células a 3000 vezes chi por 10 minutos e descarte o supernasce.Em seguida, suspenda cuidadosamente a pilette celular em DDH2O, usando uma pipeta de vidro de 20 mililitros. Ajustando assim o OD-600 TO 3.0 final para um ensaio do Cavalo de Tróia ou 1.0 para classificação de doença. Cultive as plantas do labirinto para um estágio de folhas adultas, onde pelo menos a folha 7 cresce dentro do talo.Em seguida, transfira a cultura eumadous para uma seringa de 3 mililitros com uma agulha hipodérmica calibre 20 bi um. Pressione o talo cuidadosamente para localizar o tecido da haste do espelho. A base do Tronco Do Espelho pode ser distinguida por uma transição de talo mais duro para tecido mais macio.Marque o tronco do espelho no talo usando uma caneta. Injete 1,5 mililitros de cultura eurómade 1 centímetro acima do Haste do Espelho de Shoot ou da Haste do Espelho de Inflorescência. Uma vez que as plantas do labirinto cheguem ao estágio tassel, pressione o talo cuidadosamente para localizar o tassel na haste.Marque a ponta e a base do tassel na haste usando uma caneta. Transfira a cultura eumadous para uma seringa de 3 mililitros com uma agulha hipodérmica calibre 20 bi um para injetar um total de 1,5 mililitros do inóculo ao redor da tassel. Para assegurar a distribuição igualitária do inóculo, coloque lentamente 5 mililitros na ponta, no meio e na base do tassel marcado com a caneta.Transfira a cultura eumadous para uma seringa de 3 mililitros com 20 bitolas bi uma agulha hipodérmica. Injete a agulha de inoculação no espaço entre as folhas da casca o mais profundamente possível sem ferir a orelha e, em seguida, solte 1,5 mililitros do inóculo ao redor da orelha. Em seguida, remova a seringa e a agulha e massageie cuidadosamente a espiga para distribuir a solução eurómes igualmente.Solte 10 microliters de inóculo em uma placa de carvão pd. Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 2 dias. Hyphae secretando ZM Mach1 são cercados por sinal fluorescente e cereja.Em contraste, a hifa não inclinada só mostra sinal fluorescente no citoplasma fúngico. A localização inadequada de tassel ou a distribuição desigual do inóculo podem resultar em tassel não infectado ou apenas infecção parcial do tassel em comparação com a distribuição uniforme. A cepa solo patogênica do Cavalo de Tróia Progenester SG-200, cultivada em carvão PD auger, forma filamentos brancos de fluff na placa, como mostrado.Enquanto a cepa eumadous FB1 requer acasalamento antes da formação de filamentos infecciosos. Após a infecção, a possível resposta de sinais da proteína hepática do Cavalo de Tróia pode ser analisada usando vários métodos, incluindo classificações de doenças ou imagens microscópicas. Para muitos patógenos, a transformação e a secreção são bem compreendidas e podem ser exploradas de forma semelhante.Assim, permitem o estudo do hospedeiro, que não são suscetíveis à transformação.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Manipulação genética do patógeno de planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudar Biologia fúngicos e vegetais Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy como uma abordagem cirúrgica para entrega de drogas para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatal

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Hibridização in situ cromogênica SS uma ferramenta para diagnóstico de câncer de cabeça e pescoço relacionados ao HPV

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...