Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Томас Дресселгауз, Мартин Parniske, Нуреддин Djella и Армин Хильдебранд для предоставления лаборатории пространства и растительных материалов. Оригинальные работы по методу троянский конь было поддержано Леопольдина постдока стипендий и NSF проекта IOS13-39229. Работы, представленные в этой статье было поддержано SFB924 (проекты A14 и В14) от DFG.

1. Строительство U. maydis троянский конь
Примечание: Смотрите Рисунок 1.
<ol><li>Усилить ген интереса от кукурузы кДНК гена специфические праймеры и корректура ДНК-полимеразы. Клон основной продукт PCR и превратить конструкцию в E. coli следуя инс...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

Исследование современных культур требует протоколы для молекулярного анализа генетических и уровни белка. Генетическая доступность через преобразование не доступен или неэффективным и трудоемким для большинства видов сельскохозяйственных культур, например кукурузы. Кроме тог...

Возбудитель biotrophic maydis пузырчатая является возбудителем болезни головня кукурузы1. Он заражает все надземные части кукурузы, что приводит к большой опухоли, которые содержат споры melanized, черный. На глобальном уровне U. maydis оценивается вызвать ежегодные потери около 2% урожая кукурузы, в то время как опухоли ценятся как гастрономическим деликатесом в Мексике. Аппрессории, который выделяет лизировать ферменты клеточной стенки проникнуть первый слой кукурузы эпидермальных клеток инициируется завод инфекции. С сайта первичной инфекции U. maydis растет внутриклеточно и intercellularly, вторгаясь клетки один или два слоя каждый день1,2. Успешное инфекции приводит к гипертрофии завод, который превращается в видимые опухоли после пяти дней должность инфекции1,3,4. На всех стадиях инфекции грибные гифы инвагинировать мембраны цитоплазме завод без прямого контакта в цитоплазме принимающей1,2. Жесткие apoplasmic пространство между заражение гифы и завод плазматической мембраны считается хост/возбудителя интерактивный сайт, называется biotrophic зоны взаимодействия. Для того, чтобы преодолеть иммунной системы растений, U. maydis выделяет массив эффекторных белков в biotrophic взаимодействия зоны1. Некоторые эффекторов занимают растительных клеток, в то время как другие остаются в biotrophic взаимодействия зоны5,6,,78. Один apoplastic эффектора — UmPit2, который взаимодействует с apoplastic кукурузы протеазы для предотвращения выхода сигнальный пептид ZmZIP1 от ZmPROZIP,apoplastic протеазы деятельность910.
За последние десятилетия U. maydis стал не только модель для грибковых генетики растений возбудитель взаимодействия, но и ценным инструментом в области биотехнологии в силу понятных жизненного цикла, доступность генетических и гетерологичных выражение выделяется белки11,12,13. Сигналы для обоих традиционных и нетрадиционных белка секрецию были определены разрешение контроль Посттрансляционная изменения14. Недавно U. maydis работал как троянский конь инструмент для изучения малых, выделяется кукуруза белков в situ15. Троянский конь подход успешно использовался для анализа функции небольшой, выделяется белка ZmMAC1, который участвует в развитии пыльников. ZmMAC1 вызывает periclinal разделение плюрипотентных клеток и клеток судьба спецификации новообразованной клетки15. Таким же методом была выявлена биологическая функция кукурузы ущерб связанных пептидной ZmZIP1. U. maydis секреции кукурузы, ZmZIP1 привели к нарушение формирования опухоли10. Таким образом троянский конь подход представляет ценные альтернативный маршрут для белка в situ исследований с высоким пространственно-временных резолюцией, которая делает не требуют поколение стабильной кукурузы преобразование линии ни инфильтрации тканей с участием выраженное и очищенных белков. В частности троянский конь стратегия позволяет секрецию любой гетерологичных белка в кукурузы Апопласт и прямое сравнение инфицированных и неинфицированных растительных клеток внутри же ткани.
Этот протокол иллюстрирует основные шаги для создания штамма троянский конь U. maydis для изучения протеина интереса. Она далее включает в себя точную информацию о процедурах инфекции трех типов различных кукурузы ткани (взрослый листья, кистями и уши) с U. maydis, который является предпосылкой для изучения пространственно-временных инфекции прогрессии и белков функции в этих тканях-мишенях. Без дальнейших спецификаций приводятся кукурузы амплификации генов и микроскопических изображений техники, поскольку эти шаги являются целевыми и инструмент зависимой. Таким образом этот протокол предназначен для опытных пользователей стандартных молекулярные методы биологии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Вдохновленный Homer´s троянский конь миф, мы инженерии кукурузы возбудителя пузырчатая maydis доставить секретируемые белки в кукурузы апопласт, позволяющие в естественных условиях фенотипического анализа. Этот метод не полагаться на кукурузу трансформации, но подвиги микробной генетики и секреторную возможности патогенов. Здесь он позволяет осмотр в естественных условиях доставлены секретируемые белки с высоким пространственно-временных резолюции на различные виды сайтов инфекции и тканей. Троянский конь стратегия может быть использован для временно дополнять кукурузы фенотипы функция потерь, функционально характеризовать доменов протеина, анализировать-целевого белка эффекты, или для изучения передозировка играющий белка, что делает его мощным инструментом для изучений протеина в системе урожая кукурузы. Эта работа содержит точный протокол о том, как генерировать штамм троянский конь, следуют стандартизированных инфекции протоколы применить этот метод к трем типам различных кукурузы ткани.

Конструкции для U. maydis троянский конь экспериментов клонируются в плазмиду p123-PUmpit2-Sppit2Um-гена интереса mCherry-ха. Кукурузы гена интереса сливается с репортером флуоресценции mCherry и epitope ха-тег. Выражение синтез ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

С помощью пузырчатая maydis как троянский конь в месте доставки кукурузу белков

Эта работа описывает клонирования штамма троянский конь пузырчатая maydis на месте доставки секретируемые белки кукурузы в три различных видов кукурузы тканей.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Исследование процессов на генетическом и белковом уровнях имеет решающее значение в исследованиях сельскохозяйственных культур. Наш подход позволяет осмотреть секретные белки лабиринта с наивысшим пространственным временным разрешением на разных сторонах инфекции и тканях. Метод троянского коня исследует полезные возможности автоматической секретории.Он обходит трудоемкие и сложные преобразования лабиринта, и облегчает детальные исследования секретных белков в лабиринте аппельплац. Подробная информация о надлежащей инфекции добавленных листьев лабиринта, кисточки и ухо. И показывает успешное изучение прогрессирования инфекции и белковой функции в ткани-мишени.Демонстрацией процедуры будет Изабель Фидлер, аспирант из лаборатории. Чтобы начать эксперимент, поцарапать Eumadous от pediatr пластины с помощью стерильных пастер пипетки. Прививка 5 миллилитров YEPS Light Medium с Eumadous.Выращиваем культуру при 28 градусах Цельсия, с постоянной тряской при 200 об/мин в течение 16 часов. На следующий день смешайте 900 микролитров свежего YEPS Light со 100 микролитров ночной культуры. Измерьте OD-600 с помощью YEPS Light Medium в качестве пробела в анализе спектрофотометра.Разбавьте ночную культуру свежим YEPS Light Medium до OD-600 из 2. Пусть культура растет на 28 градусов по Цельсию с постоянной тряской при 200 об/мин, пока не достигнет средней фазы роста журнала, указанной OD-600 от 8 до 1,0. После инкубации, урожай клеток, вращая их в 3000 раз чи в течение 10 минут.Откажитесь от супернатанта. Далее, мыть клетки свайт один раз с 1 объем культуры DDH2O. Спин клетки на 3000 времени чи в течение 10 минут и отказаться от супернатанта.Затем, повторно приостановить ячейки свайт тщательно в DDH2O, используя 20 миллилитров стеклянной пипетки. Таким образом, корректировка окончательного OD-600 TO 3.0 для анализа троянского коня или 1,0 для оценки заболеваний. Выращивайте растения лабиринта до стадии взрослых листьев, где по крайней мере лист 7 растет в стебле.Затем перенесите культуру Eumadous в 3 миллилитровый шприц с 20 калибровочных би одной подкожной иглой. Нажмите стебель тщательно, чтобы локализовать зеркальные стволовые ткани. Основание Зеркального Стебля можно отличить переходом от более трудного стебля к более мягкой ткани.Отметь Зеркальный Стебель на стебле с помощью ручки. Ввись 1,5 миллилитров eumadous культуры 1 сантиметр выше Стрелять Зеркало Ствол или Соцветие Зеркало Ствол. Как только растения лабиринта достигнут стадии кисок, нажмите стебель тщательно, чтобы локализовать кись в стебле.Отметте кончик и основание киистой на стебле с помощью ручки. Перенесите культуру Eumadous в 3 миллилитровый шприц с 20 калибровочным би одной подкожной иглой, чтобы ввести в общей сложности 1,5 миллилитров инокулума вокруг кистойки. Чтобы обеспечить равное распределение инокулума, медленно поместите 5 миллилитров на кончике, середине и основании кистой, отмеченных ручкой.Перенесите культуру Eumadous в 3 миллилитровый шприц с 20 калибровочных би одной подкожной иглой. Ввесите иглу прививки в пространство между листьями шелухи как можно глубже, не повреждая ухо, а затем отпустите 1,5 миллилитров инокулума вокруг уха. Затем снимите шприц и иглу и тщательно массируйте початок, чтобы распределить раствор Eumadous поровну.Капля 10 микролитров инокулума на PD уголь овечка пластины. Затем инкубировать при комнатной температуре в течение 2 дней. Hyphae, секретирующий QM Mach1, окружен флуоресцентным и вишневым сигналом.В отличие от этого, несекретные гифы показывают только флуоресцентный сигнал в грибковой цитоплазме. Неправильная локализация кистой или неравное распределение инокулума может привести к неинфекции кистой или лишь частичной инфекции кистой по сравнению с тивым распределением. Соло патогенных троянский конь Progenester штамм SG-200, культурный на PD уголь овсяный, образует белый пух нити на пластине, как показано на.В то время как штамм Eumadous FB1 требует спаривания перед инфекционным образованием нити. После заражения, возможная реакция признаков белка печени троянского коня может быть проанализирована с помощью различных методов, включая оценки заболеваний или микроскопической визуализации. Для многих патогенов, преобразование и секреция хорошо изучены и могут быть изучены аналогичным образом.Таким образом, они позволяют изучать хозяина, которые не подвержены трансформации.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Генетическая Манипуляция растений Возбудитель<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; По изучению Грибковые биологии и растений микробных взаимодействий

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

целевое<em&gt; В Ситу</em&gt; мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy как хирургический подход к местным лекарств в внутренний уши взрослых и новорожденных мышей

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Визуализация микробиоты в кишки клеща в целом гора в Situ гибридизация

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Хромогенные На ситу Гибридизация SS инструмент для ВПЧ связанных головы и шеи диагностики рака

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...