Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Författarna vill tacka Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella och Armin Hildebrand för att tillhandahålla lab utrymme och plant material. Det ursprungliga arbetet på metoden trojansk häst stöddes av en Leopoldina postdoc fellowship och NSF projektet IOS13-39229. Det arbete som presenteras i denna artikel stöddes av SFB924 (projekt A14 och B14) av DFGEN.

1. konstruktion av ett U. maydis trojansk häst
Obs: Se figur 1.
<ol><li>Förstärka en gen av intresse från majs cDNA med gen-specifika primers och en korrekturläsning DNA-polymeras. Klona den primära PCR-produkten och omvandla konstruktionen till E. coli efter plasmid leverantörens instruktioner. Kontrollera den rätta genen av intresse sekvens av Sanger sekvensering före användning för kloning härnäst. <...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

Moderna gröda forskning kräver protokoll för molekylär analys på genetiska och proteinnivåer. Genetiska tillgänglighet via omvandling är inte tillgänglig eller ineffektivt och tidskrävande för de flesta grödor arter såsom majs. Dessutom är pålitliga genetiska verktyg som arrangören reporter system knappa, vilket gör det svårt att studera jordbaserad proteinfunktion spatiotemporal med hög upplösning på distinkt vävnad platser. Apoplastisk proteiner kan studeras genom infiltration av heterolo...

Biotrophic patogenen Ustilago maydis är vilka smittämnen av majs smut sjukdom1. Det infekterar alla antenn delar av majs vilket resulterar i stora tumörer som innehåller melanized, svarta sporer. På global nivå bedöms U. maydis orsaka en årlig förlust på omkring 2% av majs avkastning, medan tumörer är uppskattade som en gastronomisk delikatess i Mexiko. Anläggningen infektion initieras av en appressorium som utsöndrar cellväggen lyseringslösning enzymer för att tränga igenom det första lagret av majs epidermala celler. Från en primär infektion webbplats, U. maydis växer intracellulärt och intercellularly, invaderar en till två cell lager varje dag1,2. Framgångsrik infektion resultat i växten hypertrofi som förvandlar till synliga tumörer vid fem dagar efter infektion1,3,4. Under alla faser för infektion invaginate svampinfektion hyfer växt cytoplasman membranet utan direkt kontakt till värd cytoplasman1,2. Snäva apoplasmic utrymmet mellan de infekterande hyfer och växt plasmamembranet anses vara värd/pathogen interaktiva webbplatsen, kallas zonen biotrophic interaktion. För att övervinna det medfödda immunsystemet växt, utsöndrar U. maydis en rad effektor proteiner in i biotrophic interaktion zon1. Vissa effektorer tas upp av växtceller, medan andra förblir i biotrophic interaktion zon5,6,7,8. En apoplastisk effektor är UmPit2, som interagerar med apoplastisk majs proteaser att förhindra utsläpp av signalering peptid ZmZIP1 från ZmPROZIP av apoplastisk proteas aktivitet9,10.
Under de senaste årtiondena, U. maydis blev inte bara en modell för svamp genetik i växt-patogen interaktion, men också ett värdefullt verktyg i bioteknik på grund av en väl förstått livscykel, enkla genetiska tillgänglighet och heterologa uttryck för utsöndras proteiner11,12,13. Signaler för både konventionella och okonventionella protein sekretion har bestämts så att kontroll av posttranslationell ändringar14. Nyligen, U. maydis var anställd som en trojansk häst-verktyg för att studera små, utsöndras majs proteiner i situ15. Metoden trojansk häst har framgångsrikt använts för att analysera funktionen hos små, utsöndrade proteinet ZmMAC1 som är involverad i anther utveckling. ZmMAC1 inducerar periclinal uppdelningen av pluripotenta celler och cell öde specificering av de nybildade celler15. Med samma metod avslöjades den biologiska funktionen av majs skador-associerade peptiden ZmZIP1. U. maydis utsöndrar majsen ZmZIP1 resulterade i försämrad tumör bildandet10. Således, den trojanska häst tillvägagångssätt representerar en värdefull alternativ rutt till protein i situ studier spatiotemporal med hög upplösning som gör varken kräver generation av stabil majs omvandling linjer eller vävnad infiltration med heterologously uttryckt och renade proteiner. I synnerhet kan trojansk häst strategin utsöndringen av något heterologa protein in i majs apoplast och direkt jämförelse av infekterade kontra icke-infekterade växtceller inom samma vävnaden.
Detta protokoll illustrerar de stora steg för att generera en U. maydis trojansk häst stam för att studera ett protein av intresse. Vidare ingår exakt information om infektion förfaranden av tre olika majs vävnadstyper (vuxna blad, Tofsar och öron) med U. maydis, vilket är en förutsättning för att studera funktionen spatiotemporal infektion progression och protein i dessa vävnader. Inga ytterligare specifikationer är given på majs gen förstärkning och mikroskopiska avbildningstekniker, eftersom dessa steg är mål-specifika och instrument-beroende. Sålunda, detta protokoll riktar sig till erfarna användare av standarden molekylärbiologiska tekniker.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Inspirerad av Homer´s Trojan Häst myt, vi konstruerat majs patogenen Ustilago maydis att leverera utsöndras proteinerna i den majs apoplast möjliggör invivo fenotypiska analys. Denna metod förlitar sig inte på majs omvandling men utnyttjar mikrobiell genetik och sekretoriska funktioner av patogener. Häri, tillåter den inspektion av invivo levereras utsöndrade proteiner med hög spatiotemporal upplösning på olika sorters infektionsställen och vävnader. Trojansk häst strategin kan utnyttjas för att komplettera normalnivå majs förlust-av-funktion fenotyper, för att karakterisera funktionellt protein domäner, att analysera off-target protein effekter, eller att studera onside protein överdosering, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för protein studier i systemet majs gröda. Detta arbete innehåller ett exakt protokoll på hur till generera en trojansk häst stam följt av standardiserade infektion protokoll att tillämpa denna metod på tre olika majs vävnadstyper.

Konstruktioner för U. maydis trojansk häst experiment är klonade in plasmid p123-PUmpit2-SpUmpit2-gen av intresse-mCherry-Ha. Den majs gen av intresse smälts samman till en mCherry fluorescens reporter och en epitop HA-tagg. Uttrycket av proteinet fusion är under kontroll av promotorn U. maydis Umpit2 som aktiveras specifikt under infektion<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Med hjälp av Ustilago maydis som en trojansk häst för i Situ leverans av majs proteiner

Detta arbete beskrivs kloning av en Ustilago maydis trojansk häst stam för jordbaserad leverans av utsöndrade majs proteiner in i tre olika typer av majs vävnader.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Att undersöka processer på genetiska och proteinnivåer är avgörande inom grödans forskning. Vår metod möjliggör inspektion av utsöndrerade labyrint proteiner med högsta rumsliga tidsmässiga upplösning på olika infektion sidor och vävnader. Trojan Horse-metoden utforskar användbara automatiska sekretoriska möjligheter.Det kringgår tidskrävande och utmanande labyrint transformationer, och underlättar detaljerade studier på utsöndrade proteiner inom labyrinten appelplatz. Detaljerad information om korrekt infektion av tillsatta labyrintblad, tofsar och öra. Och visar den framgångsrika studien av infektionsprogression och proteinfunktion i målvävnaden.Demonstrera förfarandet kommer att Isabell Fiedler, en grad student från laboratoriet. Till att börja experimentet, skrapa Eumadous från en pediatrplatta med hjälp av en steril pasteurpipett. Inokulera 5 milliliter av YEPS Light Medium med Eumadous.Odla kulturen vid 28 grader Celsius, med konstant skakning vid 200 rpm i 16 timmar. Nästa dag blanda 900 mikroliter av färska YEPS Ljus med 100 mikroliter av natten kultur. Mät OD-600 med yeps light medium som ett tomrum i spektrofotometeranalysen.Späd över natten kultur med färska YEPS Light Medium till en OD-600 av 2. Låt kulturen växa vid 28 grader Celsius med konstant skakning vid 200 rpm, tills den når mitten log tillväxtfasen, indikeras av en OD-600 av 8 till 1,0. Efter inkubation, skörda cellerna genom att snurra dem på 3000 gånger chi i 10 minuter.Kassera supernatanten. Därefter tvätta cellpilette en gång med 1 odlingsvolym av DDH2O. Snurra cellerna på 3000 tid chi i 10 minuter och kasta supernatanten.Sedan, åter upphäva cellpilette försiktigt i DDH2O, med hjälp av en 20 milliliter glaspipett. Därigenom justera den slutliga OD-600 TILL 3.0 för en trojansk häst analys eller 1,0 för sjukdom betyg. Odla labyrintväxterna till ett stadium av vuxna blad, där minst blad 7 växer inom stjälken.Därefter överför du Eumadous-kulturen till en 3 milliliterspruta med en 20 gauge bi one hypodermic needle. Tryck noga på stjälken för att lokalisera Mirror Stem Tissue. Basen av Mirror Stem kan särskiljas genom en övergång från hårdare stjälk till mjukare vävnad.Märk spegelstammen på stjälken med hjälp av en penna. Injicera 1,5 milliliter av Eumadous kultur 1 centimeter ovanför Shoot Mirror Stem eller Blomställning Spegel Stem. När labyrintplantorna når tofsstadiet trycker du noga på stjälken för att lokalisera tofsen i stjälken.Märk spetsen och tofsens bas på stammen med hjälp av en penna. Överför Eumadouskulturen i en 3 milliliterspruta med en 20 gauge bi one hypodermic needle för att injicera totalt 1,5 milliliter av inokulatet runt tofsen. För att försäkra lika fördelning av inokulat, långsamt placera 5 milliliter vid spetsen, mitten, och basen av tofsen märkt med pennan.Överför den Eumadous kulturen in i en 3 milliliter spruta med 20 mätare bi en hypodermic visare. Injicera inokuleringsnålen i utrymmet mellan skalbladen så djupt som möjligt utan att skada örat och släpp sedan 1,5 milliliter av inokulet runt örat. Därefter tar du bort sprutan och nålen och massera försiktigt cob för att fördela Eumadous-lösningen lika.Släpp 10 mikroliter av inokulat på en PD kol auger platta. Därefter inkubera i rumstemperatur i 2 dagar. Hyphae secreting ZM Mach1 är omgivna av fluorescerande och körsbär signal.Däremot visar nonsecreting hyphae bara fluorescerande signal i svamp cytoplasman. Felaktig tofs lokalisering eller ojämlik fördelning av inokulat kan resultera i icke-infekterade tofs eller endast partiell infektion av tofsen jämfört med jämn fördelning. Den solopatogena trojanska hästen Progenester sil SG-200, odlade på PD kol skruv, bildar vitt ludd glödtrådar på plattan som visas.Medan den Eumadous stammen FB1 kräver parning före infektiös glödtrådsbildning. Efter infektion, kan möjliga svar av tecken den trojanska hästen leverprotein analyseras med hjälp av olika metoder inklusive sjukdom betyg eller mikroskopisk bildbehandling. För många patogener är omvandling och utsöndring väl förstådda och kan utforskas på ett liknande sätt.Därför möjliggör de studiet av värden, som inte är mottagliga för omvandling.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genmanipulation av växtpatogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Att studera Svamp biologi och växt mikrobinteraktioner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Målinriktad<em&gt; In situ</em&gt; mutagenes av Histon Gener i knoppande jäst

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profilering DNA Replication Timing med zebrafiskar som ett In Vivo -modellsystem

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy som en kirurgisk metod att lokala Drug Delivery i Inner örat på vuxna och neonatala möss

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick tarmar av hela-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vävnadsspecifika miRNA uttryck profilering i mus hjärtat sektioner med In Situ -hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Kromogent in situ hybridisering SS ett verktyg för HPV-relaterade huvud och hals cancer diagnos

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...