Name: using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Yazarlar Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella ve Armin Hildebrand laboratuvar alanı ve bitki malzeme sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Truva atı yöntemi özgün çalışmalarına Leopoldina postdoc Bursu ve NSF proje IOS13-39229 tarafından desteklenmiştir. Bu makalede sunulan iş DFG (A14 ve B14 projeler) SFB924 tarafından desteklenmiştir.

1. bir U. maydis Truva atı inşaatı
Not: Bkz: Şekil 1.
<ol><li>Bir gen Mısır cDNA gene özgü astar ve proofreading bir DNA polimeraz kullanarak dan ilgi yükseltmek. Birincil PCR ürünü klon ve plazmid satıcının talimatları. E. coli inşa dönüştürmek Faiz sırası Sanger sıralama sonraki klonlama adımlar için kullanmadan önce tarafından doğru gen doğrulayın. Not: PCR özellik...

<ol>
	<li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li><li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+tumour:+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves.">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+a+maize+plant:+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis.">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li><li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep1,+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.,+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells.">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).</li><li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors.">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li><li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector.">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize.">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355 (2014).</li><li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2.">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).</li><li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize.">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li><li>Ju&#225;rez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut+('Huitlacoche')+as+a+new+platform+for+oral+vaccines.">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535 (2015).</li><li>Sarkari, P., Feldbr&#252;gge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenb&#246;ck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).</li><li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse.">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+(Zea+mays)+anther+cell+behavior+in+situ.">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li><li>B&#246;sch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions.">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines.">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li><li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule.">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li><li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies.">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34 (2015).</li><li>Holliday, R., King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).</li><li>Doehlemann, G., Reissmann, S., A&#223;mann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation.">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li><li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis.">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li><li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1.">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li></ol>

Modern ürün araştırma genetik moleküler analiz ve protein düzeyleri için protokoller talep ediyor. Genetik erişilebilirlik ile dönüşüm kullanılabilir veya verimsiz ve Mısır gibi birçok bitki türünün zaman alıcı değil. Ayrıca, güvenilir genetik organizatörü muhabir sistemleri gibi farklı doku siteleri kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlükte yerinde protein işleviyle çalışmaya zor kılan kıt, araçlardır. Apoplastic protein heterologously ifade ve saf protein infiltrasyo...

Biotrophic patojen Ustilago maydis Mısır kurum hastalığı1hastalığının olduğunu. Mısır melanized, siyah sporları içeren büyük tümör içinde kaynaklanan tüm hava parçaları bozar. Küresel düzeyde, U. maydis tümörü Meksika'da lezzetin bir incelik olarak takdir edilmektedir iken Mısır verimi, yaklaşık % 2 yıllık bir kaybına neden tahmin edilmektedir. Bitki enfeksiyon Mısır epidermal hücrelerin ilk tabakası nüfuz hücre duvarı lysing enzimler salgılar bir appressorium tarafından başlatılır. Bir birincil enfeksiyon sitesinden bir-iki hücreyi istila katmanlar her gün1,2, intracellularly ve intercellularly U. maydis yetişir. Beş gün üzerine görünür tümör dönüşüyor bitki hipertrofisi sonuçlarında başarılı enfeksiyon enfeksiyon1,3,4posta. Bütün enfeksiyon aşamaları sırasında mantar hif bitki sitoplazma membran ana makine sitoplazma1,2için doğrudan herhangi bir temas olmadan invaginate. Bitki plazma zarı arasındaki bulaşmasını hif sıkı apoplasmic alanı biotrophic etkileşim bölgesi adı verilen ana bilgisayar/patojen interaktif sitesi olarak kabul edilir. Bitki doğuştan gelen bağışıklık sistemi üstesinden gelmek için U. maydis bir dizi efektör proteinlerin biotrophic etkileşim bölgesi1salgılar. Diğerleri biotrophic etkileşim bölgesi5,6,7,8' kalır bazı effectors bitki hücreleri tarafından alınır. Bir apoplastic efektör UmPit2, sinyal peptid ZmZIP1 apoplastic proteaz aktivitesi9,tarafından ZmPROZIP üzerinden10sürümü önlemek için apoplastic Mısır proteaz ile etkileşim olduğunu.
Son on yıl boyunca U. maydis mantar genetik bitki patojeni etkileşim içinde aynı zamanda iyi anlaşılmış bir yaşam döngüsü, kolay genetik erişilebilirlik nedeniyle biyoteknoloji değerli bir araç için sadece bir model oldu değil ve kapaklı ifade salgılanan proteinler11,12,13. Her iki geleneksel ve sıradışı protein salgılanması için sinyalleri ardından değişiklikler14kontrol sağlayan tespit edilmiştir. Son zamanlarda, küçük, çalışmaya bir Truva atı araç salgılanan gibi Mısır proteinler in situ15 U. maydis istihdam edildi. Truva atı yaklaşım şekilde küçük, salgılanan protein anter geliştirmede söz konusu ZmMAC1 işlev analiz etmek için kullanıldı. ZmMAC1 pluripotent hücreler ve yeni kurulan hücreleri15hücre kader tayini periclinal bölümü neden olmaktadır. Aynı yöntemle Mısır hasar ilişkili peptid ZmZIP1 biyolojik fonksiyonu ortaya çıktı. ZmZIP1 sonuçlandı Mısır salgılayan U. maydis tümör oluşumu10Engelli. Böylece, Truva atı yaklaşım temsil in situ çalışmalar ne yapar kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlüklü protein için değerli bir alternatif yol istemek istikrarlı Mısır dönüştürme satırları ne de doku infiltrasyonu ile nesil heterologously ifade ve saf protein. Özellikle, Truva atı strateji Mısır apoplast kapaklı herhangi bir protein salgılanması ve aynı doku içindeki sigara enfekte bitki hücreleri enfekte karşı doğrudan karşılaştırma sağlar.
Bu iletişim kuralı bir protein ilgi çalışmaya bir U. maydis Truva atı gerginlik getirici için başlıca adımları göstermektedir. Hangi kronolojik zamanmekansal enfeksiyon ilerleme ve protein işlevi eğitim için bir önkoşuldur U. maydisile daha fazla üç farklı Mısır doku türü (yetişkin yapraklar, püsküllü ve kulakları) enfeksiyon yordamları hakkında kesin bilgiler içerir Bu hedef dokulara. Daha fazla hiçbir belirtim Mısır gene amplifikasyon üzerinde verilen ve mikroskobik adımları hedef özgü ve enstrüman bağımlı olduğundan teknikleri, görüntüleme. Böylece, bu iletişim kuralı standart moleküler biyoloji teknikleri deneyimli kullanıcılara yöneliktir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:307px;">2 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td style="width:89px;">4606027V</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23G x 1 1/4 hypodermic needle</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun</td>
			<td>4657640</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>211677</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">cDNA from maize</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">from maize tissue expressing the gene of interrest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">05105</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cuvette (10 x 4 x 45 mm)</td>
			<td style="width:119px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:89px;">67742</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator-shaker set to 28 &#176;C, 200 rpm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Light microscope with 400-fold magnification</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nco I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0193</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;">p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">please contact the corresponding author&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pasteur pipet (glass, long tip)</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">pCR-Blunt-II-TOPO</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K280002</td>
			<td style="width:311px;">can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potato Dextrose Agar&#160;</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:89px;">90000-745</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:307px;">Sharpie pen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:89px;"></td>
			<td style="width:311px;">use locally available equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Ssp I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0132</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">S0389</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">M0202</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:89px;">TRIS-RO</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xba I</td>
			<td style="width:119px;">NEB</td>
			<td style="width:89px;">R0145</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td>212750</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ustilago maydis as a trojan horse for in situ delivery of maize proteins

Homer´s Truva atı mit esinlenerek, Mısır patojen Ustilago maydis salgılanan proteinler içinde vivo fenotipik analiz izin Mısır apoplast sunmak için tasarlanmış. Bu yöntem Mısır dönüşüm üzerinde dayanmaz Ancak mikrobiyal genetik ve patojenlerin salgı yetenekleri olağanüstü başarı. Burada, içinde vivo incelenmesi salgılanan proteinler kronolojik zamanmekansal çözünürlükte yüksek enfeksiyon siteleri ve doku çeşitleri ile teslim sağlar. Truva atı strateji-ebilmek var olmak kullanmak geçici işlevsel olarak protein etki alanları, hedef protein etkilerini incelemek veya ofsayt protein overdosage, güçlü bir araç yapmak için çalışmaya karakterize etmek için Mısır işlev kaybı fenotipleri tamamlayacak protein çalışmaları Mısır ürün sistem. Bu eser üç farklı Mısır doku türü için bu yöntemi uygulamak için standart enfeksiyon protokolleri takip bir Truva atı yük oluşturmak nasıl kesin bir iletişim kuralını içerir.

U. maydis Truva atı deneyler için yapıları plazmid p123-PUmpit2-SpUmpit2-faiz-mCherry gene-Haklonlanır. Mısır gen ilgi mCherry floresan muhabir ve bir epitope HAerimiş-etiket. Özellikle enfeksiyon21sırasında aktif U. maydis Umpit2 Düzenleyicinin kontrolü altında füzyon protein ifadesidir. Biotrophic etkileşim bölgesi...

Watch this Scientific Journal Video about Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins at JoVE.com

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Bu eser için üç farklı Mısır dokuların içine salgılanan Mısır proteinlerin teslim yerinde bir Ustilago maydis Truva atı zor klonlama açıklar.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Genetik ve protein düzeyleri ile ilgili süreçlerin araştırılması mahsul araştırmalarında çok önemlidir. Yaklaşımımız, farklı enfeksiyon yan larında ve dokularda en yüksek mekansal zamansal çözünürlüğe sahip salgılanan labirent proteinlerinin incelenmesini sağlar. Truva Atı Yöntemi yararlı automatous salgı yetenekleri araştırıyor.Zaman alıcı ve zorlu labirent dönüşümlerini atlatır ve labirent appelplatz içinde salgılanan proteinler üzerinde ayrıntılı çalışmalar kolaylaştırır. Eklenen labirent yapraklar, püsküller ve kulak uygun enfeksiyon hakkında ayrıntılı bilgi. Ve hedef dokuda enfeksiyon ilerlemesi ve protein fonksiyonu başarılı çalışma gösterir.Prosedürü gösteren Isabell Fiedler, laboratuvardan yüksek lisans öğrencisi olacak. Deneye başlamak için, steril bir pasteur pipetkullanarak bir pediatr plakaeumadous çizik. Eumadous ile YEPS Hafif Orta 5 mililitre aşılamak.16 saat boyunca 200 rpm sürekli sallayarak, 28 santigrat derece kültür büyümek. Ertesi gün 900 mikrolitre taze YEPS Işığı ile 100 mikrolitrelik bir gecede karıştırın. OD-600'ü YEPS Light Medium kullanarak spektrofotometre analizinde boş olarak ölçün.Taze YEPS Light Medium ile gece kültürünü 2 od-600'e seyreltin. Kültür 200 rpm sürekli sallayarak 28 derece santigrat büyümeye izin, orta günlük büyüme aşamasına ulaşana kadar, 8-1.0 bir OD-600 ile gösterilir. Kuluçkadan sonra hücreleri 3000 kez 10 dakika döndürerek hasat edin.Supernatant atın. Daha sonra hücre piletini 1 kültür hacmi dDH2O ile bir kez yıkayın. Hücreleri 3000 zaman chi'de 10 dakika döndürün ve süpernatant'ı atın.Daha sonra, 20 mililitrelik cam pipet kullanarak Hücre lisi DDH2O'da dikkatlice askıya alın. Böylelikle son OD-600 TO 3.0 bir Truva Atı tahlil veya hastalık derecelendirme için 1.0 ayarlama. En az yaprak 7 sap içinde yetişir yetişkin yapraklar, bir aşamaya labirent bitkileri yetiştirmek.Sonra, 20 gauge bi bir hipodermik iğne ile 3 mililitrelik şırınga içine Eumadous kültürü aktarın. Ayna Kök Dokusunu yerelleştirmek için sapı dikkatlice bastırın. Ayna Sapı tabanı daha sert saptan daha yumuşak dokuya geçişle ayırt edilebilir.Ayna Sapını kalem kullanarak sapına işaretleyin. Shoot Mirror Stem veya Çiçeklenme Ayna Sapı üzerinde 1,5 mililitre Eumadous kültürü enjekte edin. Labirent bitkileri püskül aşamasına ulaştıktan sonra, sapı sapı lokalize etmek için dikkatle tuşuna basın.Ucunu ve püskültabanını bir kalem kullanarak sapına işaretleyin. Püskül etrafında inokül toplam 1.5 mililitre enjekte etmek için 20 gauge bi bir hipodermik iğne ile 3 mililitreşlik şırınga içine Eumadous kültürü aktarın. Inoküleşit dağılımını sağlamak için, yavaş yavaş ucu, orta ve püskül tabanı kalem ile işaretlenmiş 5 mililitre yerleştirin.Eumadous kültürünü 20 gauge bi one hipodermik iğneile 3 mililitrelik şırıngaya aktarın. Kulak yaralanması olmadan mümkün olduğunca derin kabuk yaprakları arasındaki boşluğa aşılama iğne enjekte, sonra kulak etrafında inokül 1.5 mililitre bırakın. Daha sonra, şırınga ve iğne çıkarın ve dikkatle eşit Eumadous çözüm dağıtmak için cob masaj.PD kömür burgu plaka üzerinde inoculum 10 mikrolitre bırakın. Daha sonra 2 gün oda sıcaklığında kuluçkaya yat. ZM Mach1 salgılayan hyphae floresan ve kiraz sinyali ile çevrilidir.Buna karşılık, nonsecreting hyphae sadece mantar sitoplazmasında floresan sinyal gösterir. Inokülün yanlış püskül lokalizasyonu veya eşit olmayan dağılımı, püskülün eşit dağılıma göre enfekte olmayan püskül veya sadece kısmi enfeksiyonuna neden olabilir. Pd kömür burgu kültürlü solo patojenik Truva Atı Progenester suşu SG-200, gösterildiği gibi plaka üzerinde beyaz kabarık filamentler oluşturur.Eumadous suşu FB1 bulaşıcı filament oluşumundan önce miyon gerektirir iken. Enfeksiyon dan sonra, Truva Atı karaciğer proteini olası yanıt hastalık derecelendirme veya mikroskobik görüntüleme de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak analiz edilebilir. Birçok patojen için dönüşüm ve salgı iyi anlaşılmıştır ve benzer bir şekilde araştırılabilir.Bu nedenle, dönüşüme açık olmayan ev sahibinin çalışmasını sağlarlar.

Research

JoVE Journal

Genetics

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy yerel ilaç dağıtım yetişkin ve Neonatal farelerin iç kulaklarına bir cerrahi yaklaşım olarak

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Kromojenik In situ hybridization HPV Ile Ilgili baş ve boyun kanseri tanısı için bir araç ss

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...