Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

هذه الدراسة يدعمه منحة تشغيلية من "المعاهد الكندية" "البحوث الصحية" M.L.D. ول الأعمال المعروضة هنا معتمد من قبل على جائزة "جون ر. إيفانز رئيس الصندوق" من "المؤسسة الكندية" للابتكار ومعتمد كتمويل من "صندوق البحوث أونتاريو" إلى Y.J. بدرجة ماجستير لمنحه الدكتوراه نقل من عميد كلية Schulich ل M اديسيني وطب الأسنان في جامعة أونتاريو الغربية. S.D.G. تدعمه "منحة الدكتوراه" من كندا المرض.

1-الجيل الجديد فلوريسسينتلي معلم Httex1 الصحفيين لتعبير في الخميرة
ملاحظة: هذا المقطع تم تعديل من البروتوكول بواسطة جيانغ et al. 16 والبكري وآخرون 19.
<ol><li>تصميم كبسولة تفجير لتضخيم تسلسل ترميز البروتينات الفلورية أو الاهتمام ببكر. التمهي...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

في هذه المقالة، كانوا يعملون فحوصات مختلفة لقياس تجميع Httex1 polyQ التوسعات وأثرها على نمو الخميرة كنموذج لدراسة الفلورسنت كيف مختلف البروتينات تغيير شركائها الانصهار في سياق الصحفيين نيون . استخدام متغير التجارة والنقل (يمسفجفب) كعنصر إيجابي، واظهرنا أن هذا الكشف عن تغييرات كبيرة في po...

حيث تم وضع توصيف الأولية من البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) من فيكتوريا أيقووريا1، لوحة واسعة من FPs وراثيا المرمزة، يسمح علماء الأحياء الخلية تعريب وتتبع في الوقت نفسه متعددة الأحداث/البروتينات الخلوية في معيشة الخلايا2،3. FPs مشتقة من كائنات متعددة، من قنديل البحر للمرجان، ومن ثم عرض الخصائص الفيزيائية الحيوية محددة تحول على نطاق واسع خارج الطيف الفلورسنت كل منها على. وتشمل هذه الخصائص السطوع، فوتوستابيليتي، وميل إلى أوليجوميريزي بين الآخرين2،4. تحديد أحادي FPs جانبا مهما في اختيار علامة مناسبة عند تصميم مراسل فلورسنت، بغية تقليل التفاعلات غير مناسب وتعديلات مهمة الشريك الانصهار وتعظيم كفاءة مراسل ونظرا لحجرة الخلوية4،،من56. في حين قد تطور التجارة والنقل، على مر الزمن، لتقليل تأثير إضافة علامة مضيئة للانصهار شريك5،،من78، كيفية أداء المتغيرات FP الجديدة بالمقارنة مع التجارة والنقل لا يزال من الصعب تقييم.
توجد أساليب عدة لوصف سلوك FPs. معظمها تتضمن اختبار الخصائص الفيزيائية الأحيائية إطارا في الثانية باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية، مثل تنبيذ فائق وهلام الترشيح البروتوكولات9،10،،من1112. مثل هذه الأساليب والتحذير من استخدام FPs المنقاة في الحل، توفر القليل من التبصر في سلوكهم في خلايا سليمة. تطوير عروض المقايسة هيولى السلس المنظم (عسر) بتقييم قابلة للقياس الكمي للميل في الثانية إلى أوليجوميريزي في المعيشة الخلايا13 عن طريق اختبار قدرة overexpressed في الثانية لإعادة تنظيم الأنابيب هيولى في عسر جدلات14. هذا الأسلوب بنجاح الكشف عن التغييرات بين المتغيرات موحودي وأوليجوميريك للتجارة والنقل وغيرها في الثانية. ومع ذلك، يعتمد معظمها على أوفيريكسبريسيون في خلايا transfected عابر، وكوانتيتاتيون، وتحليل الصور يمكن أن يستغرق وقتاً طويلاً ما لم يتم اعتماد التقنية كجمع البيانات آليا وتحليل سير العمل.
من أجل استكمال هذه النهج، أنشأنا فحص أن يستفيد من تأثير العلامات الفلورية في سمية والتجميع للتوسعات polyQ في الخميرة15،16. ويكرر التوسع في امتداد polyQ مع أكثر من 36 داخل إكسون أول من ترميز الجينات البروتين هونتينجتين (Htt) يرتبط بمرض هنتنغتون17،18. التعبير عن توسيع Httex1 في نتائج الخميرة في تجميعاً قوية من البروتين Htt تجمعات بالإضافة إلى خلل نمو حاد. من المثير للاهتمام، تتأثر بشدة هذه تعمل تسلسل المرافقة على امتداد polyQ، بما في ذلك15،في الثانية16. أنه تم ترشيد أن خصائص مختلفة من FPs خلطات يمكن أن تؤثر على polyQ سمية في الخميرة. وفي الواقع، بالمقارنة مع قوة حماية المنشآت مثل التجارة والنقل، بروتينات الفلورسنت الأحمر وأشكالها تطورت أظهرت انخفاض السمية والتراكم16. وتوفر هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة لتقييم الأثر للجيل القادم من قوة حماية المنشآت في polyQ السمية والتراكم في الخميرة. يسمح هذا الفحص لتحليل السريع ويحتمل أن تكون عالية المحتوى FP المتغيرات التي يمكن استخدامها بالتوازي مع سبق تتميز تقنيات لتوصيف الأمثل من جديد في الثانية ويمكن تقييم كيف تؤدي مقارنة بالتجارة والنقل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

للتحقيق في التعريب البروتين والاتجار باستخدام imaging خلية حية، الباحثين غالباً ما تعتمد على الصمامات على بروتين الفائدة لمراسل فلورسنت. المتطورة باستمرار قائمة البروتينات الفلورية المشفرة جينياً (FPs) يوفر للمستخدمين مع عدة بدائل عندما يتعلق الأمر بتصميم الفلورسنت الانصهار. وقد كل FP الخصائص البصرية والفيزيائية الحيوية التي يمكن أن تؤثر في الخصائص البيوكيميائية والخلوية، والوظيفية للانشطار الفلورسنت الناتجة عن ذلك. على سبيل المثال، تميل FPs عدة شكل غير محدد ليغومرات التي عرضه لإعاقة وظيفة الشريك الانصهار. لسوء الحظ، توجد سوى عدد قليل من الطرق لاختبار تأثير FPs على سلوك المراسل الفلورسنت. هنا، يمكننا وصف أسلوب بسيط يتيح للتقييم السريع لتأثير إطارا في الثانية باستخدام فحوصات السمية بوليجلوتاميني (polyQ) في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. البروتينات هونتينجتين PolyQ--الموسع ترتبط بظهور مرض هنتنغتون (HD)، حيث تجمع هونتينجتين الموسعة ليغومرات السامة وإدراج الهيئات. التجميع وسمية polyQ التوسعات في الخميرة تعتمد اعتماداً كبيرا على تسلسلات المرافقة منطقة polyQ، بما في ذلك وجود العلامات الفلورسنت، مما يوفر منصة تجريبية مثالية لدراسة تأثير FPs على السلوك بهم شريك الانصهار.

وقد fPs مختلفة الخصائص الفيزيائية، بما في ذلك ميلها إلى أوليجوميريزي، التي يمكن أن تؤثر على سلوك شركائها الانصهار في سياق الصحفيين الفلورسنت. ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة حيث FPs متعددة يمكن أن تنصهر فيها للتوسعات polyQ السامة. نظراً لسمية polyQ تعتمد اعتماداً كبيرا على تسلس...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

توضح هذه المقالة بروتوكولات لتقييم تأثير البروتينات الفلورية في تجميع والسمية لتوسيع polyglutamine تجمعات للتقييم السريع لبروتين فلوري أونتشاراكتيريزيد حديثا في السياق الصحفيين الفلورسنت.

تأثير البروتينات الفلورية على الشركاء الانصهار باستخدام فحوصات السمية Polyglutamine في الخميرة

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البروتينات الفلورية مثل كيف يمكن أن تؤثر البروتينات الفلورية على شركائها في الاندماج. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر تقييمًا سريعًا وسهلًا لتدرج آثار البروتينات الفلورية وشركائها في الاندماج. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في سلوك البروتين الفلورسنت، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على العلامات المشفرة وراثيا أخرى.كما ستثبت هذه العملية سونجا دي غريغوريو، وهي طالبة دراسات عليا في جامعة ويسترن. يتم استنساخ كل البروتين الفلورسنت التي يتم اختبارها من قبل هذه الطريقة لأول مرة في متجه تعبير الخميرة التي ترميز نسخة غير قابلة للدمج من HTT FLAG الموسومة 1 خارج واحد إيواء إما تكرار 25Q غير سامة أو مرض هنتنغتون المرتبطة السامة 72Q تكرار. يتم اختيار المستنسخات والتحقق منها عن طريق التسلسل ثم تتحول بعد ذلك إلى خميرة.لإعداد الثقافات الخلية لمختلف المقايسات، المتتالية استنساخ الخميرة تحمل 25Q أو 72Q العلامة مع بروتين fluorescence من الفائدة على لوحة أجار التي تحتوي على الخميرة اختيار المتوسطة مع الجلوكوز كمصدر للكربون. في الوقت نفسه، خميرة متتالية تحمل 25Q أو 72Q الخميرة الأمثل أحادية مزدوجة GFP لتكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي. احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.حدد ما يصل إلى المستعمرات الثلاث واحدة من كل لوحة وتطعيم خمسة ملليلتر من المتوسطة الاصطناعية كاملة تكملها مع 2٪ الجلوكوز كمصدر للكربون. احتضان الثقافات في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. وفي اليوم التالي، نقل 200 ميكرولترات من كل ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي إلى خلايا بيليه.اغسلي على الأقل ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم. من المهم غسل الخلايا بشكل جيد للقضاء على جميع آثار الجلوكوز التي يمكن أن تسهم في قمع تحريض المروج GAL1. إعداد الخلايا كما هو موضح سابقا وإعادة تعليقها في المتوسطة الاصطناعية كاملة تحتوي على 2٪ galactose كمصدر للكربون للحث على التعبير عن الانصهار polyQ.كتحكم، إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلوكوز. احتضان الخلايا في 30 درجة مئوية في أنبوب الدوار بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر من كل ثقافة باستخدام مقياس الطيف.معادلة كثافات الخلايا إلى كثافة بصرية 600 من 2 في 100 ميكرولترات من المتوسطة الاصطناعية كاملة في لوحة 96-well معقمة. إعداد أربعة خمسة أضعاف التخفيفات من كل عينة عن طريق الأنابيب 20 ميكرولترات من العينة من البئر السابق إلى 80 ميكرولترات من وسائل الإعلام في البئر المقبل. استخدام أداة تثبيت الخميرة لبقعة الخلايا على لوحات انتقائية واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة يومين.صورة اللوحات بجهاز وثائق الصورة. إعداد الثقافات الخلية لهذا الفحص ومن ثم قياس OD600 من كل ثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تمييع الخلايا إلى OD600 من 1 في 300 ميكرولترات من وسائل الإعلام في لوحة 96-جيدا.إعداد كل عينة في ثلاث ية. احتضان لوحة في حاضنة قارئ لوحة مع قدرات اهتزاز. تعيين عدد العينات، ودرجة الحرارة في 30 درجة مئوية، وامتصاص في 600 نانومتر، وطول التجارب إلى 24 ساعة، وفواصل القياس إلى 15 دقيقة.حدد وضع الاهتزاز المستمر. عندما يتم إجراء التجربة، إنشاء منحنى النمو وقياس المساحة تحت المنحنى باستخدام برنامج الرسوم البيانية العلمية. لصق البيانات في جدول س ص مع ثلاثة قيم النسخ المتماثل.سيتم عرض منحنى النمو تحت مجلد الرسوم البيانية في الجانب الأيسر. لتحديد المساحة تحت المنحنى، حدد التحليل في أعلى اليسار وانقر فوق المساحة تحت المنحنى في تحليلات XY. بدء هذا الإجراء عن طريق تخفيف الخلايا المعدة 10 أضعاف في متوسط النمو.نقل 200 ميكرولترات من كل عينة إلى غرفة التصوير ثمانية بئر. صورة الخلايا باستخدام مجهر فلوري واسع المجال القياسي. اضبط إعدادات التصوير للحصول على الصور.منذ مجاميع 72Q هي أكثر إشراقا بكثير من إشارة 25Q المنتشرة، وغالبا ما يطلب من استخدام إعداد اقتناء مختلفة بين البلازميدات المختلفة من أجل تجنب تشبع إشارة الفلورسنت. معالجة الصور باستخدام برنامج مناسب لمعالجة الصور. في هذا البروتوكول، يتم استخدام لطخة نقطة لفحص مستويات التعبير البروتين.إعداد العازلة لتوليد البروتين lysates عن طريق إضافة أربعة ميكرومولار من فلوريد الفينيل ثنائي الفينيل ميثيل والزميل وكوكتيل مثبطات البروتياز إلى العازلة التحلل. بيليه خمسة ملليلترات من كل ثقافة بين عشية وضحاها عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولترات من الخرز الزجاجي و 200 ميكرولترات من عازلة التحلل.دوامة لمدة 30 ثانية لمدة 12 جولة، الجليد في ما بين الجولات. جهاز طرد مركزي في 12،000 مرات G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق وجمع فائقة. استخدام جهاز الترشيح الدقيق لاكتشاف كميات متساوية من البروتين الكلي على غشاء نيتروسيلولوز.قبل الرطب الغشاء مع برنامج تلفزيوني وتجميع الجهاز. قم بتوصيله بمصدر فراغ وتأكد من شد البراغي. تحميل العينات، بدوره على الفراغ، والسماح للعينة مرشح من خلال الغشاء عن طريق الجاذبية.لطخة الغشاء في برنامج تلفزيوني 05٪ توين 5٪ الحليب خالية من الدهون لمدة 30 دقيقة. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة المضادة الرئيسية المضادة العلم في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني 05٪ توين.احتضان الغشاء مع جسم مضاد الثانوي المسمى الفلورسنت في PBS 05٪ توين 5٪ حليب حر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. غسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني 05٪ توين. في وقت لاحق، صورة الغشاء باستخدام نظام وثائق لطخة أمينية.الخميرة التي تعبر إما 25Q أو 72Q HTT إكسون واحد تنصهر إلى الخميرة الأمثل أحادية الحروف superfolder GFP أو الخميرة الأمثل علامة أحادية االمأة BFP2 كان مثقفا في الجلوكوز أو galactose المتوسطة بين عشية وضحاها وإما رصدت على لوحات أجار أو احتضان مزيد في وسائل الإعلام السائلة. في حين أن 72Q الخميرة الأمثل أحادية مزدوجة superfolder GFP يؤدي إلى خلل كبير في النمو. 72Q الخميرة الأمثل علامة أحادية الأحرف BFP2 يعرض نمط ظاهري النمو مماثلة لنظراء 25Q غير سامة تشير إلى أن طبيعة علامة الفلورسنت يمكن أن تعوق سلوك التوسع polyQ في الخلايا.تقييم تجميع الفلورسنت polyQ الاندماج عن طريق المجهر الفلورسنت يظهر أن 72Q الخميرة الأمثل أحادية هجمير GFP يعرض تجميع كبير، في حين 72Q الخميرة الأمثل علامة أحادية 2 BFP2 يعرض إشارة cytoplasmic منتشر مماثلة لنظراء 25Q غير سامة. منذ مستويات التعبير من الاندماجات بوليك المختلفة يمكن أن تؤثر على السمية، تم تنفيذ بقع نقطة لتقييم مستويات البروتين. تظهر النتائج من خمسة أضعاف التخفيف من الخلايا lysates.لا ننسى أن هذه التقنية تسمح للمقارنة السريعة بين البروتينات غير المعهودة والفلورية مع المتغيرات GFP، ولكن لا يمكن تقييم اغراء مباشرة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تدابير أخرى ، على سبيل المثال ، مقايسة القرحة في خلايا الثدييات للإجابة على أسئلة إضافية مثل حالة البروتينات الفلورية أحادية اللون.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

المناعية على أقسام البارافين للبشرة باستخدام الماوس أجسام نيون

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

التعبير عن البروتينات المؤتلف في الخميرة Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

متجانسة الكشف السريع عن طريق فحوصات البيولوجي المغناطيسي نظام Biosensing التحوير

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

نمو فحوصات لتقييم السمية في الخميرة Polyglutamine

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي<em&gt; C. ايليجانس</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

مقارنة الانجذاب من البروتينات ملزم GTPase باستخدام فحوصات المنافسة

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...