Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Denne undersøgelse understøttes af driftstilskud fra den canadiske institutter for sundhedsforskning til M.L.D. og P.L. Det arbejde, der præsenteres her er understøttet af en John R. Evans leder fond award fra den canadiske Institut for Innovation og en matchende fond fra Ontario forskningsfonden til P.L. Y.J. understøttes af en MSc til ph.d.-overførsel stipendium fra dekanen for den baggrund skole M seneste udgave og tandpleje på The University of Western Ontario. S.D.G. understøttes af et ph.d.-stipendium fra ALS Canada.

1. generation af nye Fluorescently markeret Httex1 journalister for et udtryk i gær
Bemærk: Dette afsnit er blevet ændret fra protokollen af Jiang et al. 16 og torfinn et al. 19.
<ol><li>Design primere til at forstærke sekvensen kodning fluorescerende proteiner eller interesse ved PCR. Den forreste primer bør omfatte en leader sekvens for at bistå begrænsning enzym under fordøjelsen (GATC'EN), efterfulgt af ...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

I denne artikel, forskellige assays til at måle en sammenlægning af Httex1 polyQ udvidelser og deres virkning på gær vækst var ansat som en model til at studere hvordan forskellige fluorescerende proteiner ændrer deres fusion partnere i forbindelse med fluorescerende journalister . Ved hjælp af en normal god landbrugspraksis variant (ymsfGFP) som en positiv kontrol, viste vi at det registrerer betydelige ændringer i polyQ toksicitet og sammenlægning mellem forskellige fluorescerende tags og giver muli...

Da den oprindelige karakterisering af den grønne fluorescerende proteiner (NGL) fra Aequorea victoria1, en bred palet af genetisk kodet FPs er blevet udviklet, så cellen biologer samtidig lokalisere og spore flere cellulære begivenheder/proteiner i levende celler,2,3. FPs er afledt fra flere organismer fra vandmand koral, og derfor, display specifikke biofysiske egenskaber, at aflede udstrakt grad ud over deres respektive fluorescerende spectrum. Disse egenskaber omfatter lysstyrke, fotostabilitet og en tendens til at oligomerize blandt andre2,4. Valg af monomere FPs er et vigtigt aspekt i forbindelse med udvælgelsen af en passende tag, når du udformer en fluorescerende reporter, for at minimere upassende interaktioner og ændringer af fusion Partners funktion og maksimere reporter effektiviteten for en givet cellulære rum4,5,6. Mens normal god landbrugspraksis, over tid, blevet ændret for at minimere effekten af tilføjer den fluorescerende tag til fusion partner5,7,8, hvor nye FP varianter udføre i forhold til normal god landbrugspraksis er stadig vanskeligt at vurdere.
Få metoder eksisterer for at karakterisere opførsel af FPs. De fleste af dem involverer test biofysiske egenskaber af FPs ved hjælp af biokemiske metoder, såsom ultracentrifugering og gel filtrering protokoller9,10,11,12. Disse metoder har hage ved renset FPs i opløsning, tilbyder lidt indsigt i deres adfærd i intakt celler. Udviklingen af den organiserede glatte endoplasmatiske reticulum (OSER) assay tilbyder en kvantificerbar vurdering af FPs' tendens til at oligomerize i levende celler13 ved at teste overexpressed FPs evne til at reorganisere endoplasmatiske reticulum tubuli ind OSER hvirvler14. Denne teknik kan med held registrere ændringer mellem monomere og oligomere varianter af normal god landbrugspraksis og andre FPs. Men det er for det meste afhængig overekspression i forbigående transfekteret celler, og kvantitering og billedanalyse kan være tidskrævende, medmindre teknikken, der er vedtaget som en automatiseret dataindsamling og analyse arbejdsproces.
For at supplere disse tilgange, etableret vi en analyse, der tager fordel af effekten af fluorescerende tags på toksicitet og sammenlægning af polyQ udvidelser i gær15,16. Udbygningen af strækningen polyQ med mere end 36 gentages inden for den første exon gen kodning huntingtinprotein (Htt) er forbundet med Huntington's chorea17,18. Udtryk for udvidede Httex1 i gær resultater i en stærk sammenlægning af fejlfoldede Htt protein koblet til en svær vækst defekt. Interessant, er disse fænotyper stærkt påvirket af de sekvenser, der flankerer polyQ stretch, herunder FPs15,16. Det blev rationaliseret, at de forskellige egenskaber af FPs varierende kan påvirke polyQ toksicitet i gær. Faktisk, i forhold til normal god landbrugspraksis-lignende FPs, rødt fluorescerende proteiner og deres udviklede former har vist en reduceret toksicitet og sammenlægning16. Håndskriftet indeholder en detaljeret protokol for at vurdere effekten af den næste generation af FPs på polyQ toksicitet og sammenlægning i gær. Denne analyse giver mulighed for en hurtig og potentielt high-indhold analyse af FP varianter, der kan bruges sideløbende med tidligere karakteriseret teknikker til optimal karakterisering af nye FPs og kan vurdere, hvordan de udfører i forhold til normal god landbrugspraksis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

Ved undersøgelsen af protein lokalisering og menneskehandel ved hjælp af levende celle imaging, afhængige forskere ofte fusing deres protein af interesse for en fluorescerende reporter. Konstant udvikling listen over genetisk kodet fluorescerende proteiner (FPs) præsenterer brugere med flere alternativer, når det kommer til fluorescerende fusion design. Hver FP har specifikke optisk og Biofysisk egenskaber, der kan påvirke de biokemiske, cellulære og funktionelle egenskaber af de resulterende fluorescerende fusioner. For eksempel, flere FPs har tendens til at danne uspecifik oligomerer, der er modtagelige for hindre på funktionen af fusion partneren. Desværre, kun et par metoder eksisterer for at teste effekten af FPs på opførsel af fluorescerende reporter. Her, beskriver vi en simpel metode, der muliggør hurtig vurdering af virkningen af FPs bruger polyglutamin (polyQ) toksicitet assays i spirende gær Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-udvidet huntingtin protein er forbundet med symptomdebut af Huntington's chorea (HD), hvor den udvidede huntingtin aggregater i giftige oligomerer og inklusion organer. Sammenlægning og toksicitet af polyQ udvidelser i gær er stærkt afhængige af sekvenser flankerende polyQ regionen, herunder tilstedeværelsen af fluorescerende tags, hvilket giver en ideel eksperimentelle platform for at studere effekten af FPs på opførsel af deres fusion partner.

FPs har forskellige biofysiske egenskaber, herunder deres tendens til at oligomerize, der kan påvirke funktionsmåden for deres fusion partnere i forbindelse med fluorescerende journalister. Denne protokol beskriver en simpel metode, hvor flere FPs kan være smeltet til giftige polyQ udvidelser. Da polyQ toksicitet er stærkt afhængige af sekvenser flankerende polyQ stretch15, denne analyse giver mulighed for en hurtig og direkte sammenligning af fluorescerende p...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Denne artikel beskriver protokoller for at vurdere effekten af fluorescerende proteiner på en sammenlægning og toksicitet af fejlfoldede polyglutamin udvidelse til hurtig evaluering af en nyligt uncharacterized fluorescerende proteiner inden for rammerne af fluorescerende journalister.

Effekten af fluorescerende proteiner på Fusion partnere ved hjælp af polyglutamin toksicitet Assays i gær

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for fluorescerende proteiner såsom hvordan fluorescerende proteiner kan påvirke deres fusion partnere. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver en hurtig og let skalerbar vurdering af virkningerne af fluorescerende proteiner og deres fusion partnere. Selv om denne metode kan give indsigt i fluorescerende protein adfærd, det kan også anvendes til andre genetisk kodede tags.Også demonstrere denne procedure vil være Sonja Di Gregorio, der er en kandidatstuderende ved Western University. Hvert fluorescerende protein, der testes ved denne metode, klones først ind i en gærekspressionsvektor, der koder en galakosefremkaldende version af FLAG-mærket HTT exon one huser enten den ikke-giftige 25Q-gentagelse eller den huntingtons sygdom, der er forbundet med giftig 72Q-gentagelse. Kloner udvælges og verificeres ved sekvensering og omdannes efterfølgende til gær.For at forberede cellekulturer til de forskellige analyser, streak gær kloner bærer 25Q eller 72Q tag med en fluorescens protein af interesse på en agar plade, der indeholder gær udvælgelse medium med glukose som kulstofkilde. Samtidig, streak gær bærer 25Q eller 72Q gær optimeret monomerisk superfolder GFP til at tjene som en positiv kontrol. Inkuber pladerne ved 30 grader Celsius i to til tre dage.Vælg op til de tre enkelte kolonier fra hver plade og inokuler fem milliliter syntetisk komplet medium suppleret med 2% glukose som kulstofkilde. Inkuber kulturerne ved 30 grader Celsius natten over. Den følgende dag overføres 200 mikroliter af hver nattens kultur til et mikrocentrifugerør og centrifuge til pellet cellerne.Vask mindst tre gange med sterilt destilleret vand. Det er vigtigt at vaske cellerne godt for at fjerne alle spor af glukose, der kan bidrage til at undertrykke induktion af GAL1 promotor. Forbered cellerne som vist tidligere, og re-suspendere dem i syntetisk komplet medium, der indeholder 2%galactose som kulstofkilde til at fremkalde udtryk for polyQ fusioner.Som en kontrol, re-suspendere cellerne i glukose-holdige medier. Inkuber cellerne ved 30 grader Celsius i et rør rotator natten over. Den følgende morgen måles den optiske tæthed ved 600 nanometer for hver kultur ved hjælp af et spektrofotometer.Udligne celletætheden til en optisk tæthed 600 af 2 ud af 100 mikroliter syntetisk komplet medium i en steril 96-brøndplade. Forbered fire femfoldige fortyndinger af hver prøve ved at pipettere 20 mikroliter af prøven fra det foregående brønd i 80 mikroliter af medier i den næste brønd. Brug en gær pinning værktøj til at spotte cellerne på selektive plader og inkubere ved 30 grader Celsius i to dage.Billede pladerne med en billeddokumentationenhed. Forbered cellekulturerne til denne analyse, og mål derefter OD600 for hver kultur ved hjælp af et spektrofotometer. Cellerne fortyndes til en OD600 på 1 ud af 300 mikroliter af medier i 96-brøndpladen.Forbered hver prøve i tre eksemplarer. Inkuber pladen i en pladelæser inkubator med rysteevner. Sæt antallet af prøver, temperaturen ved 30 grader Celsius, absorbansen ved 600 nanometer, længden af forsøgene til 24 timer, og målingen intervaller til 15 minutter.Vælg den kontinuerlige rystetilstand. Når eksperimentet er gjort, skal du oprette vækstkurven og kvantificere området under kurven ved hjælp af videnskabelig grafsoftware. Indsæt dataene i en XY-tabel med tre replikerede værdier.Vækstkurven vises under grafmappen i venstre side. Hvis du vil kvantificere området under kurven, skal du vælge Analysér øverst til venstre og klikke område under kurve i XY-analyser. Start denne procedure ved at fortynde de forberedte celler 10 gange i vækstmedium.Overfør 200 mikroliter af hver prøve til et otte-brøndbilledkammer. Billede cellerne ved hjælp af en standard wide-field fluorescerende mikroskop. Juster billedindstillingerne for billedopkøb.Da 72Q aggregater er meget lysere end den diffuserede 25Q signal, er det ofte nødvendigt at bruge en anden erhvervelse indstilling mellem de forskellige plasmider for at undgå mætning af fluorescerende signal. Bearbejde billederne ved hjælp af en passende billedbehandlingssoftware. I denne protokol bruges dot blot til at undersøge proteinudfoldelsesniveauer.Forbered bufferen til generering af proteinlysater ved at tilføje fire mikromolar phenylmethylsulfonylfluorid og en proteasehæmmercocktail til lysisbufferen. Pellet fem milliliter af hver natten kultur ved centrifugering. Re-suspendere cellerne i 200 mikroliter af glasperler og 200 mikroliter af lysis buffer.Vortex i 30 sekunder for 12 runder, glasur i mellem runder. Centrifuge på 12, 000 gange G ved fire grader Celsius i 10 minutter og indsamle supernatant. Brug et mikrofiltreringsapparat til at spotte lige store mængder totalprotein på en nitrocellulosemembran.Fordæt membranen med PBS og saml apparatet. Tilslut den til en vakuumkilde, og sørg for, at skruerne er strammet. Læg prøverne, tænd for vakuum, og lad prøven filtrere gennem membranen ved tyngdekraften.Blot membranen i PBS 05%Tween 5% fedtfri mælk i 30 minutter. Inkuber membranen med primær anti-flag antistof ved fire grader Celsius natten over. Den følgende dag vaskes membranen tre gange i 10 minutter hver med PBS 05% Tween.Inkuber membranen med et fluorescerende mærket sekundært antistof i PBS 05% Tween 5% fedtfri mælk ved stuetemperatur i en time. Membranen vaskes tre gange i 10 minutter hver med PBS 05% Tween. Derefter billede membranen ved hjælp af en aminosving dokumentationssystem.Gær udtrykker enten 25Q eller 72Q HTT exon en smeltet til gær optimeret monomerisk superfolder GFP eller gær optimeret monomeriske tag BFP2 blev dyrket i glukose eller galactose medium natten over og enten spottet på agar plader eller inkuberet yderligere i flydende medier. Mens 72Q gær optimeret monomerisk superfolder GFP inducerer en betydelig vækst defekt. 72Q gær optimeret monomeric tag BFP2 viser en vækst fænotype svarende til de ikke-giftige 25Q modstykker angiver, at arten af fluorescerende tag kan hindre polyQ ekspansion adfærd i celler.Vurdering af sammenlægning af fluorescerende polyQ fusioner ved fluorescerende mikroskopi viser, at 72Q gær optimeret monomerisk superfolder GFP viser signifikant aggregering, mens 72Q gær optimeret monomerisk tag BFP2 viser en diffus cytoplasmic signal ligner de ikke-giftige 25Q modstykker. Da ekspressionsniveauer af de forskellige polyQ fusioner kan påvirke toksicitet, dot blots blev udført for at vurdere proteinniveauer. Resultater fra femfoldige fortyndinger af cellerelysater vises.Glem ikke, at denne teknik giver mulighed for hurtig sammenligning af ukarakteriserede og fluorescerende proteiner med GFP varianter, men det kan ikke direkte vurdere oligomerization. Efter denne procedure, andre foranstaltninger, for eksempel, såranalyse i pattedyr celler kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål såsom monomeriske status af fluorescerende proteiner.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Vækstassays til Vurdere polyglutamine Toksicitet i gær

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifikation af Protein Interagerende Partners Brug Tandem Affinitetsrensning

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse af SNARE-medieret membranfusion anvendelse af en enzymatisk Cellefusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Undersøgelse Spredningen og toksicitet af Prion-lignende proteiner Brug af metazoan modelorganismen<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Sammenligning affiniteten af ​​GTPase-bindende proteiner under anvendelse af kompetitive assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...