Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Deze studie wordt ondersteund door een subsidie voor huishoudelijke uitgaven van de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek naar M.L.D. en P.L. Het werk hier gepresenteerd wordt ondersteund door een John R. Evans leider Fund award van de Canadese Stichting voor innovatie en een bijpassende Fonds van het onderzoeksfonds Ontario P.L. Y.J. wordt ondersteund door een MSc naar PhD scholarship van de overdracht van de decaan van de School van de Schulich van M edicine en tandheelkunde aan de University of Western Ontario. S.D.G. wordt ondersteund door een PhD Scholarship uit ALS Canada.

1. generatie van nieuwe Fluorescently Tagged Httex1 verslaggevers voor een expressie in gist
Opmerking: Deze sectie is gewijzigd van het protocol door Jiang et al. 16 en Albakri et al. 19.
<ol><li>Inleidingen te versterken van de codering van de fluorescente proteïne of belang door PCR reeks ontwerpen. De voorwaartse primer moet bevatten een reeks leider ter ondersteuning van het beperkingsenzym tijdens de spijsver...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

In dit artikel verschillende testen om te meten de aggregatie van Httex1 polyQ uitbreidingen en hun effect op de groei van de gist werkten als een model om te bestuderen hoe de verschillende TL eiwitten veranderen hun fusie-partners in het kader van fluorescerende verslaggevers . Met behulp van een GFP-variant (ymsfGFP) als positieve controle, toonden we dat dit belangrijke veranderingen in polyQ toxiciteit en aggregatie tussen verschillende TL tags detecteert en zorgt voor een directe en snelle vergelijking v...

Aangezien de eerste karakterisering van de groen fluorescente proteïne (GFP) van Aequorea victoria1, een breed palet van genetisch gecodeerde FPs zijn ontwikkeld, waardoor cel biologen tegelijkertijd lokaliseren en bijhouden meerdere cellulaire gebeurtenissen/eiwitten in levende cellen2,3. FPs zijn afgeleid van meerdere organismen, uit kwallen koraal, en derhalve specifieke biofysische beeldschermeigenschappen die uitgebreid buiten hun respectieve fluorescerende spectrum afleiden. Deze eigenschappen omvatten helderheid, fotostabiliteit en een neiging tot oligomerize onder andere2,4. Het selecteren van monomeer FPs is een belangrijk aspect bij de keuze van een geschikte label tijdens het ontwerpen van een fluorescerende verslaggever, om ongepaste interacties en wijzigingen van de functie van de partner van de fusie te minimaliseren en maximaliseren van de efficiëntie van de verslaggever voor een cellulaire compartiment4,5,6gegeven. Terwijl GFP, na verloop van tijd is geëvolueerd om te minimaliseren van het effect van de fluorescerende tag toe te voegen aan de fusie partner5,7,8, hoe nieuwe FP varianten ten opzichte van presteren GFP blijft moeilijk in te schatten.
Er bestaan enkele methoden karakteriseren van het gedrag van de FOD. De meeste van hen betrekken biofysische eigenschappen van FPs met behulp van biochemische benaderingen, zoals ultracentrifugatie testen en gel filtratie protocollen9,10,11,12. Dergelijke methoden hebben de valkuil van het gebruik van gezuiverde FPs in oplossing, het aanbieden van weinig inzicht in hun gedrag in onbeschadigde cellen. De ontwikkeling van de georganiseerde Glad endoplasmatisch reticulum (OSER) assay aanbiedingen een kwantificeerbare beoordelingvan FPs neiging tot oligomerize in levende cellen13 door het controleren van de mogelijkheid van overexpressie bps te reorganiseren endoplasmatisch reticulum tubuli in OSER slierten14. Deze techniek kan met succes detecteren veranderingen tussen het monomeer en oligomere varianten van GFP en andere FPs. Echter het berust meestal op overexpressie in Transient transfected cellen, en de kwantificatie en beeldanalyse tijdrovend kunnen zijn tenzij de techniek wordt aangenomen als een automatische gegevensverzameling en analyse workflow.
Ter aanvulling van deze benaderingen, opgericht wij een bepaling die van het effect van fluorescerende tags op de toxiciteit en aggregatie van polyQ uitbreidingen in gist15,16 profiteert. De uitbreiding van het polyQ traject met meer dan 36 herhaalt binnen de eerste exon de gene codering van dat het eiwit huntingtin (Htt) is geassocieerd met de ziekte van Huntington17,18. De expressie van uitgebreide Httex1 gist resulteert in een sterke aggregatie van het misfolded Htt-eiwit dat is gekoppeld aan een ernstige groei defect. Interessant is dat zijn deze fenotypen sterk beïnvloed door de het polyQ traject, met inbegrip van FPs15,16flankerende sequenties. Het werd gerationaliseerd dat de verschillende eigenschappen van FPs differentieel polyQ toxiciteit in gist kunnen beïnvloeden. Inderdaad, in vergelijking met GFP-achtige FPs, rode fluorescerende eiwitten en hun geëvolueerd vormen hebben aangetoond een verminderde toxiciteit en aggregatie16. Dit manuscript verstrekt een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van het effect van de volgende generatie van FPs op polyQ toxiciteit en aggregatie in gist. Deze bepaling staat voor een snelle en potentieel hoge-content analyse van FP-varianten die kunnen worden gebruikt in parallel met eerder gekenmerkt technieken voor de optimale karakterisering van nieuwe FPs en kan beoordelen hoe ze presteren ten opzichte van GFP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

Voor het onderzoek van eiwitten lokalisatie en handel met behulp van levende cellen imaging, afhankelijk onderzoekers vaak van hun proteïne van belang aan een fluorescerende verslaggever smelten. De voortdurend evoluerende lijst van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen (FPs) presenteert gebruikers met verschillende alternatieven als het gaat om TL fusion ontwerp. Elke FP heeft specifieke eigenschappen voor optische en biofysische die de biochemische, cellulaire en functionele eigenschappen van de resulterende fluorescentie fusies beïnvloeden kunnen. Bijvoorbeeld, de verschillende FOD neiging om vormen van niet-specifieke oligomeren die vatbaar zijn voor het belemmeren van de functie van de fusion-partner. Helaas, slechts een paar methoden bestaan om te testen van het effect van FPs op het gedrag van de fluorescerende verslaggever. Hier beschrijven we een eenvoudige methode waarmee de snelle beoordeling van de gevolgen van FPs met behulp van polyglutamine (polyQ) toxiciteit testen in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-uitgebreid huntingtin eiwitten zijn gekoppeld aan het begin van de ziekte van Huntington (HD), waar de uitgebreide huntingtin aggregaten in giftige oligomeren en integratie-organen. De aggregatie en toxiciteit van polyQ uitbreidingen in gist zijn sterk afhankelijk van de opeenvolgingen flankerend de polyQ regio, waaronder de aanwezigheid van fluorescerende labels, waardoor het een ideale experimenteel platform om te bestuderen van de impact van FPs op het gedrag van hun fusie partner.

FPs hebben verschillende biofysische eigenschappen, met inbegrip van hun neiging om te oligomerize, die kunnen invloed hebben op het gedrag van hun fusie-partners in het kader van fluorescerende verslaggevers. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode waar meerdere FPs aan giftige polyQ uitbreidingen kan worden gesmolten. Aangezien polyQ toxiciteit sterk afhankelijk van de opeenvolgingen flankerend de polyQ stretch15 is, toestaat deze bepaling dat een snelle e...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Dit artikel beschrijft protocollen voor de beoordeling van het effect van fluorescente proteïnen op de aggregatie en toxiciteit van de expansie van de misfolded polyglutamine voor de snelle evaluatie van een nieuw genfunctieonderzoek TL proteïne in het kader van fluorescerende verslaggevers.

Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van fluorescerende eiwitten, zoals hoe fluorescerende eiwitten hun fusiepartners kunnen beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle en gemakkelijk schaalbare beoordeling biedt van de effecten van de fluorescerende eiwitten en hun fusiepartners. Hoewel deze methode inzicht kan geven in fluorescerend eiwitgedrag, kan het ook worden toegepast op andere genetisch gecodeerde tags.Ook het aantonen van deze procedure zal Sonja Di Gregorio, die een afgestudeerde student aan de Western University. Elk fluorescerend eiwit dat door deze methode wordt getest, wordt eerst gekloond tot een gistexpressievector die codeert voor een galactose inducose inducerende versie van FLAG-tagged HTT exon een die ofwel de niet-toxische 25Q-herhaling herbergt of de ziekte van Huntington geassocieerde giftige 72Q herhaal. Klonen worden geselecteerd en geverifieerd door sequencing en vervolgens omgezet in gist.Ter voorbereiding van celculturen voor de verschillende tests, streep de gist klonen die 25Q of 72Q tag met een fluorescentie eiwit van belang op een agar plaat met gist selectie medium met glucose als de koolstofbron. Tegelijkertijd, streep gist die 25Q of 72Q gist geoptimaliseerd monomerische superfolder GFP om te dienen als een positieve controle. Broed de platen twee tot drie dagen op 30 graden Celsius.Selecteer tot de drie enkele kolonies uit elke plaat en inenting vijf milliliter synthetisch compleet medium aangevuld met 2%-glucose als koolstofbron. Broed de culturen op 30 graden Celsius 's nachts. Breng de volgende dag 200 microliter van elke nachtcultuur over naar een microcentrifugebuis en centrifuge om de cellen te pelleteren.Was ten minste drie keer met steriel gedestilleerd water. Het is belangrijk om de cellen goed te wassen om alle sporen van glucose te elimineren die kunnen bijdragen aan het onderdrukken van de inductie van de GAL1 promotor. Bereid de cellen zoals eerder aangetoond en opnieuw op te schorten in synthetische volledige medium met 2% galactose als de koolstofbron om de expressie van polyQ fusies induceren.Als een controle, opnieuw opschorten van de cellen in glucose-bevattende media. Incubeer de cellen op 30 graden Celsius in een buis rotator 's nachts. Meet de volgende ochtend de optische dichtheid op 600 nanometer van elke cultuur met behulp van een spectrofotometer.Egaliseren van de celdichtheden aan een optische dichtheid 600 van 2 in 100 microliter van synthetisch compleet medium in een steriele 96-put plaat. Bereid vier vijfvoudige verdunningen van elk monster door pipet 20 microliter van het monster uit de vorige put in 80 microliter van de media in de volgende put. Gebruik een gist pinning tool om de cellen ter plaatse op selectieve platen en uitbroeden op 30 graden Celsius gedurende twee dagen.Beeld de platen met een beelddocumentatieapparaat. Bereid de celculturen voor op deze test en meet vervolgens de OD600 van elke cultuur met behulp van een spectrofotometer. Verdun de cellen tot een OD600 van 1 op 300 microliter media in de 96-put plaat.Bereid elk monster in drievoud. Incubeer de plaat in een plaatlezer incubator met schudden mogelijkheden. Stel het aantal monsters, de temperatuur op 30 graden Celsius, de absorptie op 600 nanometer, de lengte van de experimenten op 24 uur, en de meetintervallen op 15 minuten.Selecteer de continue schudmodus. Wanneer het experiment wordt uitgevoerd, maakt u de groeicurve en kwantificeert u het gebied onder de curve met behulp van wetenschappelijke grafische software. Plak de gegevens in een XY-tabel met drie repliceerwaarden.De groeicurve wordt weergegeven onder de grafiekenmap aan de linkerkant. Als u het gebied onder de curve wilt kwantificeren, selecteert u linksboven analyseren en klikt u op het gebied onder curve in XY-analyses. Begin deze procedure door het verdunnen van de bereide cellen 10-voudig in groeimedium.Breng 200 microliter van elk monster over naar een acht-well beeldkamer. Beeld de cellen met behulp van een standaard breedveld fluorescerende microscoop. Pas de beeldinstellingen aan voor het verwerven van afbeeldingen.Aangezien de 72Q aggregaten veel helderder zijn dan het diffuus 25Q-signaal, is het vaak nodig om een andere acquisitie-instelling tussen de verschillende plasmiden te gebruiken om verzadiging van het fluorescerende signaal te voorkomen. Verwerk de afbeeldingen met behulp van een geschikte beeldverwerkingssoftware. In dit protocol wordt dot blot gebruikt om eiwitexpressieniveaus te onderzoeken.Bereid de buffer voor het genereren van eiwitlysaten door vier micromolar fenylmethylsulfonylfluoride en een proteaseremmercocktail toe te voegen aan de lysebuffer. Pellet vijf milliliter van elke nachtelijke cultuur door centrifugatie. Schort de cellen opnieuw op in 200 microliter glazen kralen en 200 microliter lysebuffers.Vortex gedurende 30 seconden gedurende 12 ronden, kers tussen de rondes. Centrifuge op 12.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten en verzamel de supernatant. Gebruik een microfiltratieapparaat om gelijke hoeveelheden totaal eiwit op een nitrocellulosemembraan te herkennen.Maak het membraan voor met PBS en monteer het apparaat. Sluit het aan op een vacuümbron en zorg ervoor dat de schroeven worden aangedraaid. Laad de monsters, zet het vacuüm aan en laat het monster door het membraan filteren door de zwaartekracht.Dep het membraan in PBS 05%Tween 5%vetvrije melk gedurende 30 minuten. Incubeer het membraan met primaire anti-vlag antilichaam op vier graden Celsius 's nachts. Op de volgende dag, was het membraan drie keer gedurende 10 minuten elk met PBS 05%Tween.Incubeer het membraan met een fluorescerend gelabeld secundair antilichaam in PBS 05%Tween 5%vetvrije melk bij kamertemperatuur gedurende een uur. Was het membraan drie keer gedurende 10 minuten elk met PBS 05%Tween. Vervolgens, beeld het membraan met behulp van een amino blot documentatiesysteem.Gist uitdrukken van ofwel 25Q of 72Q HTT exon een gesmolten tot gist geoptimaliseerde monomeerne superfolder GFP of gist geoptimaliseerde monomeere tag BFP2 werd gekweekt in glucose of galactose medium 's nachts en ofwel gespot op agar platen of verder geïncubeerd in vloeibare media. Terwijl 72Q gist geoptimaliseerde monomerische superfolder GFP induceert een aanzienlijke groei defect. 72Q gist geoptimaliseerde monomerieke tag BFP2 toont een groei fenotype vergelijkbaar met de niet-toxische 25Q tegenhangers aangeeft dat de aard van de fluorescerende tag kan belemmeren polyQ expansie gedrag in cellen.Beoordeling van de aggregatie van de fluorescerende polyQ fusies door fluorescerende microscopie toont aan dat 72Q gist geoptimaliseerde monomerische superfolder GFP significante aggregatie weergeeft, terwijl 72Q gist geoptimaliseerde monomerische tag BFP2 een diffuus cytoplasmatisch signaal toont dat vergelijkbaar is met de niet-giftige 25Q tegenhangers. Aangezien expressieniveaus van de verschillende polyQ-fusies de toxiciteit konden beïnvloeden, werden dot-vlekken uitgevoerd om eiwitniveaus te beoordelen. Resultaten van verdunningen van de cellysaten worden weergegeven.Vergeet niet dat deze techniek zorgt voor een snelle vergelijking van ongekarakteriseerde en fluorescerende eiwitten met de GFP-varianten, maar het kan oligomerisatie niet direct beoordelen. Na deze procedure kunnen andere maatregelen, bijvoorbeeld, de zweertest in zoogdiercellen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de monomeerende status van de fluorescerende eiwitten.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Immunohistochemie op paraffine secties van Mouse Opperhuid gebruik van fluorescerende antilichamen

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetische studies van het menselijk DNA Repair eiwitten met behulp van gist als een model-systeem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expressie van recombinante eiwitten in het methylotrofe gist Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Homogene snelle detectie van biologische testen met behulp van Magnetic Modulation biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Groei Testen om de polyglutamine toxiciteit in gist beoordelen

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Het vergelijken van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp competitiebepalingen

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...