Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
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Cette étude est soutenue par une subvention de fonctionnement des instituts de recherche en santé à M.L.D. et P.L. Le travail présenté ici est pris en charge par une attribution de fonds Leader John R. Evans de la Fondation canadienne pour l’Innovation et un fonds correspondant provenant du Fonds de recherche de l’Ontario à P.L. Y.J. est supporté par une maîtrise à la bourse de doctorat transfert du doyen de l’École Schulich de M dernière édition et en médecine dentaire à l’Université de Western Ontario. S.D.G. est soutenu par une bourse de doctorat du Canada de l’ALS.

1. génération de nouveau fluorescent tag Httex1 Reporters pour une Expression dans la levure
Remarque : Cette section a été modifiée par le protocole de Jiang et al. 16 et Albakri et al. 19.
<ol><li>Concevoir des amorces pour amplifier la séquence codant pour la protéine fluorescente ou intérêt par PCR. L’apprêt avant devrait inclure une séquence de chef de file pour aider l’enzyme de restriction pen...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

Dans cet article, divers essais pour mesurer l’agrégation des expansions de polyQ Httex1 et leur effet sur la croissance de levure étaient employés comme modèle pour étudier comment les différents fluorescentes protéines modifient leurs partenaires en matière de fusion dans le cadre de reporters fluorescents . En utilisant une variante de la GFP (ymsfGFP) comme témoin positif, nous avons montré qu’il détecte des changements significatifs dans les polyQ toxicité et agrégation entre différentes...

Étant donné que la caractérisation initiale de la protéine fluorescente verte (GFP) de Aequorea victoria1, une large palette de génétiquement encodé IPS ont été développés, permettant aux biologistes cellulaires de localiser et de suivre simultanément plusieurs événements/protéines cellulaires dans la vie des cellules de2,3. FPs proviennent de plusieurs organismes, de méduses, coraux, et par conséquent, Visualisez les propriétés biophysiques spécifiques qui détourner largement au-delà de leur spectre de fluorescence respectif. Ces propriétés incluent luminosité photostabilité et une tendance à oligomerize, entre autres,2,4. Sélection de monomère FPs est un aspect important dans la sélection d’une balise appropriée lorsque vous concevez un journaliste fluorescent, afin de minimiser les interactions inappropriées et altérations de la fonction de la partenaire de fusion et de maximiser l’efficacité de journaliste pour une étant donné le compartiment cellulaire4,5,6. Tandis que GFP a, au fil du temps, a été élaborée pour minimiser l’effet de l’ajout de la balise fluorescente à la fusion partenaire5,7,8, comment les nouvelles variantes FP effectuent par rapport à la GFP reste difficile à évaluer.
Peu de méthodes existe pour caractériser le comportement des FPs. La plupart d'entre eux comportent des essais des propriétés biophysiques des FPs en utilisant des approches biochimiques, tels que l’ultracentrifugation et gel filtration protocoles9,10,11,12. Ces méthodes ont la mise en garde de l’utilisation de FPs purifiée en solution, offrant une vision un peu dans leur comportement dans les cellules intactes. Le développement de l’offre de dosage du réticulum endoplasmique lisse (OSER) organisé une évaluation quantifiable de tendance FPs' à oligomerize la vie des cellules13 en testant la capacité du FPs surexprimée à réorganiser les tubules de réticulum endoplasmique dans OSER verticilles14. Cette technique peut détecter avec succès des changements entre monomères et oligomères variants de la GFP et autres FPs. Toutefois, il s’appuie principalement sur la surexpression dans les cellules transfectées transitoirement, et la quantification et l’analyse de l’image peuvent prendre beaucoup de temps à moins que la technique est adoptée comme une collecte automatisée des données et les flux de travail de l’analyse.
Afin de compléter ces approches, nous avons établi une analyse qui profite de l’effet des étiquettes fluorescentes sur la toxicité et l’agrégation des expansions polyQ dans levure15,16. L’expansion de l’étirement de polyQ avec plus de 36 se répète dans le premier exon du gène codage de que la protéine huntingtine (Htt) est associée à la maladie de Huntington17,18. L’expression d’étendue Httex1 dans les résultats de la levure dans une forte agrégation de la protéine Htt mal repliée, couplée à un défaut de croissance sévère. Fait intéressant, ces phénotypes sont fortement influencées par les séquences flanquant le tronçon de polyQ, y compris les FPs15,16. Il a été rationalisé que les différentes propriétés de FPs peuvent affecter différemment polyQ toxicité chez la levure. En effet, par rapport à GFP-like FPs, protéines fluorescentes rouges et leurs formes évoluées ont montré une toxicité et agrégation réduit16. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé afin d’évaluer l’effet de la prochaine génération de FPs sur la toxicité de polyQ et agrégation dans la levure. Ce dosage permet une analyse rapide et potentiellement forte teneur des variantes FP qui peut être utilisé en parallèle avec caractérisait auparavant techniques pour la caractérisation optimale de nouveau FPs et peut évaluer comment ils effectuent par rapport à la GFP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

Pour l’enquête de localisation des protéines et du trafic à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes, chercheurs comptent souvent sur leur protéine d’intérêt à un journaliste fluorescent de fusion. La liste en constante évolution des protéines fluorescentes génétiquement encodés (FPs) présente aux utilisateurs plusieurs solutions de rechange en matière de conception de fusion fluorescent. Chaque FP possède des propriétés optiques et biophysiques spécifiques qui peuvent affecter les propriétés biochimiques, cellulaires et fonctionnelles les fusions fluorescent qui en résulte. Par exemple, plusieurs FPs tendent à former des oligomères non spécifiques qui sont susceptibles d’entraver la fonction de la partenaire de fusion. Malheureusement, seulement quelques méthodes existent pour tester l’impact des FPs sur le comportement du reporter fluorescent. Nous décrivons ici une méthode simple qui permet une évaluation rapide de l’impact d’images par seconde en utilisant les épreuves de toxicité polyglutamine (polyQ) dans la levure Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-élargi la huntingtine protéines sont associées à l’apparition de la maladie de Huntington (MH), où la huntingtine élargie regroupe en oligomères toxiques et des corps d’inclusion. L’agrégation et la toxicité des expansions de polyQ chez les levures sont fortement tributaires des séquences flanquant la région polyQ, y compris la présence d’étiquettes fluorescentes, fournissant ainsi une plate-forme expérimentale idéale pour étudier l’impact des FPs sur le comportement de leurs partenaire de fusion.

FPs ont différentes propriétés biophysiques, notamment leur tendance à oligomerize, qui peuvent affecter le comportement de leurs partenaires de fusion dans le cadre de reporters fluorescents. Ce protocole décrit une méthode simple, où plusieurs FPs peuvent être fusionnés à l’expansion de la polyQ toxique. PolyQ toxicité étant fortement dépendante des séquences flanquant l' étirement polyQ15, ce test permet de comparer rapidement et directement de ...

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Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Cet article décrit les protocoles afin d’évaluer l’effet des protéines fluorescentes sur l’agrégation et la toxicité de l’expansion de polyglutamine mal repliées pour l’évaluation rapide d’une protéine fluorescente nouvellement indéterminée dans le contexte de reporters fluorescents.

Effet des protéines fluorescentes sur des partenaires de Fusion utilisant les épreuves de toxicité Polyglutamine chez la levure

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des protéines fluorescentes telles que la façon dont les protéines fluorescentes peuvent affecter leurs partenaires de fusion. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une évaluation rapide et facilement évolutive des effets des protéines fluorescentes et de leurs partenaires de fusion. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu du comportement des protéines fluorescentes, elle peut également être appliquée à d’autres étiquettes génétiquement codées.Sonja Di Gregorio, étudiante diplômée de l’Université Western, démontrera également cette procédure. Chaque protéine fluorescente testée par cette méthode est d’abord clonée dans un vecteur d’expression de levure qui code une version inductible de galactose de l’exon HTT marqué FLAG, qui abrite soit la répétition non toxique de 25Q, soit la répétition toxique de 72Q associée à la maladie de Huntington. Les clones sont sélectionnés et vérifiés par séquençage et transformés par la suite en levure.Pour préparer les cultures cellulaires pour les différents analyses, stries les clones de levure portant 25Q ou 72Q tag avec une protéine de fluorescence d’intérêt sur une plaque d’agar contenant milieu de sélection de levure avec du glucose comme source de carbone. Dans le même temps, la levure strie portant 25Q ou 72Q levure optimisé superfolder monomère GFP pour servir de contrôle positif. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.Sélectionnez jusqu’aux trois colonies simples de chaque plaque et inoculer cinq millilitres de milieu synthétique complet complété par 2% de glucose comme source de carbone. Incuber les cultures à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, transférez 200 microlitres de chaque culture nocturne dans un tube de microcentrifugeuse et une centrifugeuse pour pelleter les cellules.Laver au moins trois fois avec de l’eau distillée stérile. Il est important de bien laver les cellules pour éliminer toutes les traces de glucose qui pourraient contribuer à réprimer l’induction du promoteur GAL1. Préparer les cellules comme démontré précédemment et les suspendre à nouveau dans un milieu synthétique complet contenant 2% de galactose comme source de carbone pour induire l’expression de fusions polyQ.Comme un contrôle, re-suspendre les cellules dans les médias contenant du glucose. Incuber les cellules à 30 degrés Celsius dans un rotateur à tube pendant la nuit. Le lendemain matin, mesurez la densité optique à 600 nanomètres de chaque culture à l’aide d’un spectrophotomètre.Égaliser les densités cellulaires à une densité optique de 600 sur 2 sur 100 microlitres de milieu synthétique complet dans une plaque stérile de 96 puits. Préparer quatre dilutions quintuplés de chaque échantillon en pipetant 20 microlitres de l’échantillon du puits précédent en 80 microlitres de médias dans le puits suivant. Utilisez un outil d’épinglant de levure pour repérer les cellules sur des plaques sélectives et incuber à 30 degrés Celsius pendant deux jours.Imagez les plaques avec un dispositif de documentation d’image. Préparez les cultures cellulaires pour cet essai, puis mesurez l’OD600 de chaque culture à l’aide d’un spectrophotomètre. Diluer les cellules à un OD600 de 1 sur 300 microlitres de médias dans la plaque de 96 puits.Préparer chaque échantillon en triplicate. Incuber la plaque dans un incubateur de lecteurs de plaques avec des capacités de secousse. Réglez le nombre d’échantillons, la température à 30 degrés Celsius, l’absorption à 600 nanomètres, la durée des expériences à 24 heures, et les intervalles de mesure à 15 minutes.Sélectionnez le mode de secousse continue. Lorsque l’expérience est terminée, créez la courbe de croissance et quantifiez la zone sous la courbe à l’aide d’un logiciel graphique scientifique. Coller les données dans une table XY avec trois valeurs de répétition.La courbe de croissance sera affichée sous le dossier graphiques sur le côté gauche. Pour quantifier la zone sous la courbe, sélectionnez analyser en haut à gauche et cliquez sur la zone sous courbe dans les analyses XY. Commencez cette procédure en diluant les cellules préparées 10 fois dans le milieu de croissance.Transférer 200 microlitres de chaque échantillon dans une chambre d’imagerie de huit puits. Imagez les cellules à l’aide d’un microscope fluorescent standard à champ large. Ajustez les paramètres d’imagerie pour l’acquisition d’images.Étant donné que les agrégats 72Q sont beaucoup plus lumineux que le signal diffus de 25Q, il est souvent nécessaire d’utiliser un réglage d’acquisition différent entre les différents plasmides afin d’éviter la saturation du signal fluorescent. Traitez les images à l’aide d’un logiciel approprié de traitement d’image. Dans ce protocole, la tache de point est employée pour examiner des niveaux d’expression de protéine.Préparez le tampon pour générer des lysates protéiques en ajoutant quatre micromolaires de fluorure de phényléthylsulfonyl et un cocktail inhibiteur de la protéase au tampon de lyse. Pelleter cinq millilitres de chaque culture nocturne par centrifugation. Suspendre à nouveau les cellules dans 200 microlitres de perles de verre et 200 microlitres de tampon de lyse.Vortex pendant 30 secondes pendant 12 rounds, givrage entre les tours. Centrifugeuse à 12 000 fois G à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes et collecte le supernatant. Utilisez un appareil de microfiltration pour repérer des quantités égales de protéines totales sur une membrane de nitrocellulose.Pré-mouiller la membrane avec PBS et assembler l’appareil. Connectez-le à une source de vide et assurez-vous que les vis sont serrées. Chargez les échantillons, allumez le vide et laissez l’échantillon filtrer à travers la membrane par gravité.Éponger la membrane dans le lait 05%Tween 5% sans gras pendant 30 minutes. Incuber la membrane avec un anticorps anti-drapeau primaire à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, laver la membrane trois fois pendant 10 minutes chacune avec PBS 05%Tween.Incuber la membrane avec un anticorps secondaire étiqueté fluorescent dans le PBS 05%Tween 5% de lait sans gras à température ambiante pendant une heure. Laver la membrane trois fois pendant 10 minutes chacune avec PBS 05%Tween. Par la suite, imagez la membrane à l’aide d’un système de documentation de tache d’aminé.Levure exprimant soit 25Q ou 72Q HTT exon on fusionné à la levure optimisé superfolder monomérique GFP ou levure optimisé tag monmérique BFP2 a été cultivé dans le glucose ou galactose milieu pendant la nuit et soit repéré sur des plaques d’agar ou incubé plus loin dans les médias liquides. Tandis que la levure de 72Q a optimisé le superfolder monomérique GFP induit un défaut significatif de croissance. 72Q levure optimisée étiquette monomère BFP2 affiche un phénotype de croissance similaire aux homologues non toxiques 25Q indiquant que la nature de l’étiquette fluorescente peut entraver le comportement d’expansion du polyQ dans les cellules.L’évaluation de l’agrégation des fusions fluorescentes de polyQ par microscopie fluorescente montre que le superfolder monomérique optimisé de levure 72Q GFP affiche l’agrégation significative, alors que la levure de 72Q a optimisé l’étiquette monomère BFP2 affiche un signal cytoplasmique diffus semblable aux contreparties non toxiques de 25Q. Puisque les niveaux d’expression des diverses fusions de polyQ pourraient affecter la toxicité, des taches de point ont été exécutées pour évaluer des niveaux de protéine. Les résultats des dilutions quintuplentes des lysates cellulaires sont montrés.N’oubliez pas que cette technique permet une comparaison rapide des protéines non caractérisées et fluorescentes avec les variantes GFP, mais elle ne peut pas évaluer directement l’oligomérisation. Après cette procédure, d’autres mesures, par exemple, l’analyse de l’ulcère dans les cellules mammifères peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions telles que l’état monomère des protéines fluorescentes.

Research

JoVE Journal

Biology

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Recherche

Biologie

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