Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

מחקר זה נתמכת של גרנט ההפעלה של מכוני הקנדי למחקר בריאות M.L.D., פ. ל העבודה המוצגת כאן נתמכת על ידי פרס ג'ון ר אוונס מנהיג קרן קרן הקנדית לחדשנות ו קרן תואמות מקרן מחקר אונטריו כדי Y.J. פ. ל הוא נתמך על ידי תואר את PhD העברה מלגה של דיקן בית הספר לכימיה של מ' edicine, רפואת שיניים-מאוניברסיטת מערב אונטריו. S.D.G. נתמך על ידי מלגה לתואר שלישי מקנדה ALS.

1. מהדור החדש Htt מתויג Fluorescentlyex1 כתבים עבור ביטוי בשמרים
הערה: סעיף זה השתנה מן הפרוטוקול על ידי ג'יאנג. et al. 16 ו. Albakri et al. 19.
<ol><li>עיצוב תחל כדי להגביר את רצף קידוד של חלבון פלואורסצנטי או ריבית על-ידי ה-PCR. פריימר לפנים צריכה לכלול רצף מנה...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

במאמר זה, מבחני שונים כדי למדוד את המצבור של Httex1 polyQ הרחבות ואת השפעתם על צמיחת שמרים הועסקו כמודל ללמוד כמה שונה פלורסנט חלבונים לשנות זוגם היתוך בהקשר של כתבים פלורסנט . באמצעות ה-GFP משתנה (ymsfGFP) כפקד חיובית, הראינו כי זה מזהה שינויים משמעותיים polyQ רעילות, צבירת בין תגי שונה פלורסנט, מא...

מאז פותחו האפיון הראשוני של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ויקטוריה Aequorea1, לוח צבעים רחב של מקודדים גנטית FPs, ומאפשר תא ביולוגים בו-זמנית לשפה ולעקוב מרובים אירועים/החלבונים חי תאים2,3. FPs נגזרות אורגניזמים מרובים, מן המדוזה אלמוגים, ולכן, הצגת מאפייני biophysical ספציפי המסיטים בהרחבה מעבר ספקטרום פלורסנט המתאימים שלהם. מאפיינים אלה כוללים בהירות, פוטוסטביליטי נטייה oligomerize בין היתר2,4. בחירת monomeric FPs היא היבט חשוב בבחירה של תג מתאים בעת עיצוב כתב פלורסנט, על מנת למזער אינטראקציות בלתי הולם והשינויים של הפונקציה של השותף פיוז'ן, למקסם את היעילות כתב עבור בהתחשב תא הסלולר-4,-5,-6. בעוד ה-GFP, לאורך זמן, התפתח כדי לצמצם את ההשפעה של הוספת תגית פלורסנט של פיוז'ן שותף5,7,8, כמה גרסאות חדשות FP לבצע בהשוואה ל GFP נשאר קשה להעריך.
כמה שיטות קיימות כדי לאפיין את אופן הפעולה של FPs. רובן כוללות בדיקת מאפיינים ביופיזיקלי של FPs שימוש בגישות ביוכימיים, כגון ultracentrifugation, ג'ל סינון פרוטוקולים9,10,11,12. שיטות כאלה יש אזהרה של שימוש FPs מטוהרים בפתרון, מציע תובנה קטנה התנהגותם בתאים ללא פגע. הפיתוח של ההצעות assay מאורגן חלקה רשתית תוך-פלזמית (OSER) הערכה הניתנת לכימות של נטייה FPs' oligomerize חי תאים13 על-ידי בדיקת היכולת של overexpressed FPs כדי לארגן מחדש את רשתית תוך-פלזמית בקוריאנית לתוך OSER דורים14. טכניקה זו בהצלחה לזהות שינויים בין גרסאות monomeric ו- oligomeric של ה-GFP, FPs אחרים. עם זאת, זה מסתמך בעיקר על ביטוי בתאים transiently transfected, כימות וניתוח התמונה פקוקה אלא אם הטכניקה מאומצת כמו איסוף נתונים אוטומטי של ניתוח זרימת העבודה.
על מנת להשלים את הגישות האלה, הקמנו וזמינותו כי מנצל את ההשפעה של פלורסנט תגים על רעילות, צבירה של הרחבות polyQ שמרים15,16. הרחבת רצועת polyQ עם יותר מ 36 חוזר בתוך אקסון הראשון של ג'ין קידוד שהחלבון huntingtin (Htt) מזוהה עם מחלת הנטינגטון17,18. הביטוי של Htt המורחבex1 בתוצאות שמרים ב צבירה חזקה של החלבון Htt misfolded מצמידים פגם חמור צמיחה. מעניין, אלה פנוטיפים חריפה מושפעים את רצפי איגוף רצועת polyQ, כולל FPs15,16. זה היה מיוחד כי מאפיינים שונים של FPs יכול להשפיע באופן שונה רעילות polyQ שמרים. ואכן, בהשוואה ל- FPs כמו GFP, חלבונים ניאון אדום וטפסים מפותחת שלהם הראו מופחתת רעילות, צבירת16. כתב יד זה מספק פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את ההשפעה של הדור הבא של FPs על רעילות polyQ, צבירה של שמרים. Assay זו מאפשרת ניתוח מהיר ולא פוטנציאל גבוה-תוכן של גרסאות FP שיכול לשמש במקביל בעבר מאופיין טכניקות אופטימלית אפיון חדש FPs וניתן להעריך כיצד הם לבצע בהשוואה ל- GFP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

עבור החקירה של לוקליזציה חלבון וסחר באמצעות הדמיה תא חי, החוקרים מסתמכים בדרך כלל על פיוזינג חלבון שלהם לעניין כתב פלורסנט. הרשימה מתפתחת ללא הרף של חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית (FPs) מציג משתמשים עם מספר חלופות כשמדובר עיצוב פיוז'ן פלורסנט. FP כל בעלת תכונות אופטי ו biophysical ספציפיים שיכולים להשפיע על מאפייני הביוכימי, סלולר ופונקציונלי fusions פלורסנט וכתוצאה מכך. למשל, כמה FPs נוטים ליצור oligomers לא ספציפית כי הם רגישים כדי להכשיל על הפונקציה של הזוג פיוז'ן. למרבה הצער, רק כמה שיטות קיימות כדי לבחון את ההשפעה של FPs על ההתנהגות של הכתב פלורסנט. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת את ההערכה המהירה של ההשפעה של FPs באמצעות מבחני רעילות polyglutamine (polyQ) בשמרים ניצני האפייה. חלבונים huntingtin מורחב-PolyQ קשורים עם תחילתה של מחלת הנטינגטון (HD), איפה huntingtin המורחב אגרגטים לתוך oligomers רעילים וגופים הכללה. צבירה של רעילות polyQ הרחבות בשמרים הם תלויים במידה רבה רצפי איגוף באזור polyQ, כולל הנוכחות של תגיות פלורסנט, ובכך מספק פלטפורמה ניסיוני אידיאלי לחקור את ההשפעה של FPs על התנהלות שלהם שותף פיוז'ן.

FPs יש biophysical מאפיינים שונים, כולל שלהם נטייה oligomerize, אשר יכולים להשפיע על ההתנהגות של זוגם היתוך בהקשר של כתבים פלורסנט. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה היכן FPs מרובים יכולים נכרכים להרחבות polyQ רעילים. מאז polyQ רעילות תלויה מאוד רצפי איגוף למתוח את polyQ15, וזמינותו זו מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

מאמר זה מתאר פרוטוקולים כדי להעריך את ההשפעה של חלבונים פלורסנט על צבירה ורעילות של התרחבות misfolded polyglutamine על הערכה מהירה של חלבון פלואורסצנטי uncharacterized לאחרונה בהקשר של עיתונאים פלורסנט.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום החלבונים הפלואורסצנטיים כגון כיצד חלבונים פלואורסצנטיים יכולים להשפיע על שותפי ההיתוך שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הערכה מהירה וקלה להרחבה של ההשפעות של חלבונים פלואורסצנטיים ושותפי ההיתוך שלהם. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה על התנהגות חלבון פלואורסצנטי, זה יכול להיות מיושם גם על תגים מקודדים גנטית אחרים.כמו כן ידגים הליך זה יהיה סוניה די גרגוריו, שהוא סטודנט לתואר שני באוניברסיטה המערבית. כל חלבון פלואורסצנטי שנבדק בשיטה זו משוכפל תחילה לווקטור ביטוי שמרים המקודד גרסה בלתי ניתנת לעיכול גלקטוז של אקסון HTT מתויג על ידי FLAG אחד מחסה או לא רעיל 25Q לחזור או מחלת הנטינגטון הקשורים רעיל 72Q לחזור. שיבוטים נבחרים ומאומתים על ידי רצף ולאחר מכן הופכים לשמרים.כדי להכין תרבות תאים עבור assays שונים, פס שיבוטים שמרים נושאת תג 25Q או 72Q עם חלבון פלואורסצנטי של עניין על צלחת אגר המכילה מבחר שמרים בינוני עם גלוקוז כמקור הפחמן. במקביל, שמרי פס הנושאים שמרים 25Q או 72Q אופטימיזציה סופר-תיקיות מונומרית GFP לשמש שליטה חיובית. דגירה הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים.בחר עד שלוש מושבות בודדות מכל צלחת לחסן חמישה מיליליטר של מדיום מלא סינתטי בתוספת 2% גלוקוז כמקור הפחמן. דגירה התרבויות ב 30 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחרת, להעביר 200 microliters של כל תרבות לילה צינור microcentrifuge וצנטריפוגה כדי גלולה את התאים.לשטוף לפחות שלוש פעמים עם מים מזוקקים סטריליים. חשוב לשטוף היטב את התאים כדי לחסל את כל עקבות הגלוקוז שיכולים לתרום להדחיקת הגיוס של מקדם GAL1. הכן את התאים כפי שהודגם בעבר והשהה אותם מחדש במדיום מלא סינתטי המכיל 2%galactose כמקור הפחמן כדי לגרום לביטוי של היתוך polyQ.כפקד, השהה מחדש את התאים במדיה המכילה גלוקוז. דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס בצינור מסובב לילה. בבוקר שלמחרת, למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר של כל תרבות באמצעות ספקטרופוטומטר.השווה את צפיפות התא לצפיפות אופטית של 600 מתוך 2 ב-100 מיקרוליטרים של מדיום שלם סינטטי בצלחת סטרילית של 96 בארות. הכינו ארבעה דילולים של פי חמישה מכל דגימה על ידי צינורות 20 מיקרוליטרים של המדגם מה באר הקודמת ל-80 מיקרוליטרים של מדיה באר הבאה. השתמש בכלי הצמדת שמרים כדי לזהות את התאים על צלחות סלקטיביות דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים.תדמיין את הלוחות עם התקן תיעוד תמונה. הכן את תרבות התאים לתראה זו ולאחר מכן למדוד את OD600 של כל תרבות באמצעות ספקטרופוטומטר. לדלל את התאים OD600 של 1 ב 300 microliters של מדיה בצלחת 96 באר.הכינו כל דגימה ב-triplicate. הדגירה את הצלחת באינקובטור קורא צלחת עם יכולות רועדות. הגדר את מספר הדגימות, הטמפרטורה ב 30 מעלות צלזיוס, הספיגה ב 600 ננומטר, אורך הניסויים ל 24 שעות, ואת מרווחי המדידה ל 15 דקות.בחר את מצב הרעידות הרציף. כאשר הניסוי נעשה, ליצור את עקומת הצמיחה לכמת את האזור מתחת לעקומה באמצעות תוכנת גרפים מדעית. הדבק את הנתונים בטבלת XY עם שלושה ערכים משוכפלים.עקומת הגדילה תוצג מתחת לתיקיית הגרפים בצד שמאל. לכימות האזור מתחת לעקומה, בחרו לנתח בחלק השמאלי העליון ולחצו על אזור מתחת לעקומה בניתוחי XY. התחל הליך זה על ידי דילול התאים המוכנים פי 10 במדיום הצמיחה.העבר 200 מיקרוליטרים של כל דגימה לתא הדמיה של שמונה בארות. תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב סטנדרטי. התאם את הגדרות הדימות לרכישת תמונה.מאז אגרגטים 72Q הם הרבה יותר בהירים מאשר אות 25Q מפוזר, הוא נדרש לעתים קרובות להשתמש הגדרת רכישה שונה בין plasmids שונים על מנת למנוע רוויה של אות פלואורסצנטי. לעבד את התמונות באמצעות תוכנה מתאימה לעיבוד תמונה. בפרוטוקול זה, כתם נקודה משמש לבחינת רמות ביטוי החלבון.הכינו את המאגר ליצירת ליאזט חלבונים על ידי הוספת ארבעה מיקרומולרים של פלואוריד פנילמתילסולפוניל וקוקטייל מעכב פרוטאז למאגר התיזה. גלולה חמישה מיליליטר של כל תרבות לילה על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את התאים ב 200 microliters של גם גם 800 מיקרוליטרים של חיץ תזה.מערבולת למשך 30 שניות ל-12 סיבובים, הדובדבן שבקצפת בין הסיבובים. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant. השתמש בקנסטרום microfiltration כדי לזהות כמויות שוות של חלבון הכולל על קרום nitrocellulose.הרטיבו מראש את הממברנה עם PBS והרכיבו את המנגנון. חבר אותו למקור ואקום וודא שהברגים מהודקים. לטעון את הדגימות, להפעיל את הוואקום, ולתת לדגום לסנן דרך הממברנה על ידי כוח הכבידה.תנפחו את הממברנה ב-PBS 05%Tween 5% חלב ללא שומן למשך 30 דקות. דגירה הממברנה עם נוגדן אנטי דגל ראשוני בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBS 05%Tween.הדגירה את הממברנה עם נוגדן משני שכותרתו פלואורסצנטי PBS 05%Tween 5% חלב ללא שומן בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBS 05% Tween. לאחר מכן, תמונה הממברנה באמצעות מערכת תיעוד כתם אמינו.שמרים המבטאים או 25Q או 72Q HTT exon אחד התמזגו שמרים אופטימיזציה superfolder מונומרי GFP או שמרים אופטימיזציה תג מונומרי BFP2 היה מתורבת גלוקוז או גלקטוז בינוני לילה או הבחין על צלחות אגר או דגירה עוד יותר במדיה נוזלית. בעוד שמרים 72Q אופטימיזציה superfolder מונומרי GFP גורם פגם צמיחה משמעותי. BFP2 תג מונומרי מותאם שמרים 72Q מציג פנוטיפ צמיחה דומה לעמיתיו 25Q רעילים המציין כי אופי התג הפלואורסצנטי יכול לעכב את התנהגות התפשטות polyQ בתאים.הערכה של צבירה של היתוך polyQ פלואורסצנטי על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי מראה כי 72Q שמרים אופטימיזציה superfolder מונומרי GFP מציג צבירה משמעותית, בעוד שמרים 72Q אופטימיזציה תג מונומרי BFP2 מציג אות ציטופלסמי מפוזר דומה עמיתים 25Q רעילים. מאז רמות הביטוי של היתוך polyQ שונים יכול להשפיע על רעילות, כתמי נקודה בוצעו כדי להעריך את רמות החלבון. תוצאות מדילול פי חמישה של ליsates התא מוצגים.אל תשכח כי טכניקה זו מאפשרת השוואה מהירה של חלבונים לא אופייניים פלואורסצנטי עם גרסאות GFP, אבל זה לא יכול להעריך ישירות אוליגומריזציה. בעקבות הליך זה, אמצעים אחרים, למשל, את הבדיקה כיב בתאי יונקים ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות כגון המצב המונומרי של חלבונים פלואורסצנטיים.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

השוואת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...