Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
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इस अध्ययन M.L.D. और P.L. के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों से एक ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित है काम यहां प्रस्तुत एक जॉन आर इवांस नेता निधि पुरस्कार कनाडा की नींव से नवाचार के लिए और ओंटारियो अनुसंधान कोष से एक मिलान कोष से P.L. Y.J. के लिए एक एमएससी द्वारा समर्थित है एम के Schulich स्कूल के डीन से पीएचडी स्थानांतरण छात्रवृत्ति के लिए समर्थन किया है edicine और दंत चिकित्सा के पश्चिमी ओंटारियो विश्वविद्यालय में । S.D.G. ALS कनाडा से पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है ।

1. खमीर में एक अभिव्यक्ति के लिए नई फ्लोरोसेंट टैग Httex1 पत्रकारों की पीढ़ी
नोट: यह खंड जियांग एट अल द्वारा प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है । 16 और Albakri एट अल. 19. शी.
<ol><li>डि?...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. 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B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

इस अनुच्छेद में, विभिंन परख Httex1 polyQ विस्तार और खमीर विकास पर उनके प्रभाव के एकत्रीकरण को मापने के लिए एक मॉडल के रूप में कार्यरत थे अध्ययन कैसे अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्लोरोसेंट पत्रकारों के संदर्भ ?...

के बाद से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रारंभिक लक्षण वर्णन (GFP) विक्टोरिया Aequorea1, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग एफपीएस की एक विस्तृत पैलेट विकसित किया गया है, की अनुमति सेल जीव एक साथ स्थानीयकरण और ट्रैक एकाधिक सेलुलर घटनाओं में जीवित कोशिकाओं2,3। एफपीएस कई जीवों से प्राप्त कर रहे हैं, जेलिफ़िश से कोरल करने के लिए, और इसलिए, प्रदर्शन विशिष्ट भौतिक गुण है कि उनके संबंधित फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम से परे बड़े पैमाने पर डायवर्ट । इन गुणों में चमक, photostability, और अंय2,4के बीच oligomerize करने की प्रवृत्ति शामिल है । monomeric एफपीएस का चयन एक उपयुक्त टैग के चयन में एक महत्वपूर्ण पहलू है जब एक फ्लोरोसेंट संवाददाता डिजाइनिंग, में आदेश अनुचित बातचीत और फ्यूजन साथी समारोह के परिवर्तन को कम करने और एक के लिए रिपोर्टर दक्षता को अधिकतम करने के लिए सेलुलर कम्पार्टमेंट4,5,6दिया । जबकि GFP है, समय के साथ, फ्यूजन साथी के लिए फ्लोरोसेंट टैग जोड़ने के प्रभाव को कम करने के लिए विकसित किया गया है5,7,8, कैसे नए FP वेरिएंट GFP की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल रहता है ।
कुछ तरीकों को एफपीएस के व्यवहार की विशेषताएं मौजूद हैं । उनमें से ज्यादातर ऐसे ultracentrifugation और जेल निस्पंदन प्रोटोकॉल9,10,11,12के रूप में जैव रासायनिक दृष्टिकोण, का उपयोग कर एफपीएस के भौतिक गुणों का परीक्षण शामिल है । इस तरह के तरीकों समाधान में शुद्ध एफपीएस का उपयोग कर की चेतावनी है, बरकरार कोशिकाओं में उनके व्यवहार में थोड़ा अंतर्दृष्टि की पेशकश की । संगठित चिकनी endoplasmic जालिका (OSER) परख के विकास oligomerize endoplasmic जालिका में पुनर्गठित एफपीएस की क्षमता का परीक्षण करके13 कोशिकाओं में रहने वाले नलिकाओं के लिए एफपीएस प्रवृत्ति का quantifiable आकलन प्रदान करता है OSER whorls14. इस तकनीक को सफलतापूर्वक GFP और अंय एफपीएस के monomeric और oligomeric वेरिएंट के बीच परिवर्तन का पता लगा सकते हैं । हालांकि, यह क्षणिक transfected कोशिकाओं में व्यक्त पर ज्यादातर निर्भर करता है, और quantitation और छवि विश्लेषण समय लेने वाली हो सकता है जब तक कि तकनीक एक स्वचालित डेटा संग्रह और विश्लेषण कार्यप्रवाह के रूप में अपनाया है ।
आदेश में इन दृष्टिकोण पूरक करने के लिए, हम एक परख है कि विषाक्तता और खमीर में polyQ विस्तार के एकत्रीकरण पर फ्लोरोसेंट टैग के प्रभाव का लाभ लेता है की स्थापना की15,16। huntingtin प्रोटीन (Htt) Huntington रोग17,18के साथ जुड़ा हुआ है जीन एंकोडिंग के पहले एक्सॉन के भीतर अधिक से अधिक ३६ दोहराता के साथ polyQ खिंचाव के विस्तार । विस्तृत Httex1 के एक मजबूत एकत्रीकरण में खमीर परिणामों में Htt की अभिव्यक्ति एक गंभीर वृद्धि दोष के लिए युग्मित प्रोटीन । दिलचस्प है, इन phenotypes जोरदार polyQ खिंचाव, एफपीएस15सहित,16के पार्श्व अनुक्रम से प्रभावित हैं । यह तर्क दिया था कि एफपीएस के विभिंन गुणों को विभेदक खमीर में polyQ विषाक्तता को प्रभावित कर सकते हैं । वास्तव में, GFP की तुलना में एफपीएस की तरह, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन और उनके विकसित रूपों एक कम विषाक्तता और एकत्रीकरण16दिखाया गया है । यह पांडुलिपि खमीर में polyQ विषाक्तता और एकत्रीकरण पर एफपीएस की अगली पीढ़ी के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है । इस परख के लिए अनुमति देता है एक तेजी से और संभवतः उच्च FP संस्करण है कि समानांतर में नए एफपीएस के इष्टतम लक्षण वर्णन के लिए तकनीक के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है की सामग्री का विश्लेषण और आकलन कर सकते है कि वे कैसे GFP की तुलना में प्रदर्शन ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

प्रोटीन स्थानीयकरण और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग तस्करी की जांच के लिए, शोधकर्ताओं अक्सर एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए ब्याज की अपने प्रोटीन से इनकार करने पर भरोसा करते हैं । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की लगातार विकसित सूची (एफपीएस) यह फ्लोरोसेंट फ्यूजन डिजाइन करने के लिए आता है जब कई विकल्प के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रस्तुत करता है । प्रत्येक FP विशिष्ट ऑप्टिकल और भौतिक गुण है कि जैव रासायनिक, सेलुलर, और जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट फ्यूजन के कार्यात्मक गुणों को प्रभावित कर सकते है । उदाहरण के लिए, कई एफपीएस के लिए विशिष्ट oligomers कि फ्यूजन साथी के समारोह पर बाधा संभावना है फार्म के लिए करते हैं । दुर्भाग्य से, केवल कुछ तरीकों फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के व्यवहार पर एफपीएस के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए मौजूद हैं । यहां, हम एक सरल तरीका है कि polyglutamine (polyQ) नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiaeमें विषाक्तता परख का उपयोग एफपीएस के प्रभाव का तेजी से मूल्यांकन में सक्षम बनाता है वर्णन । PolyQ-विस्तारित huntingtin प्रोटीन Huntington की बीमारी (एचडी) की शुरुआत के साथ जुड़े होते हैं, जहां विषैले oligomers और समावेशी निकायों में विस्तारित huntingtin समुच्चय होता है । एकत्रीकरण और खमीर में polyQ विस्तार की विषाक्तता अत्यधिक फ्लोरोसेंट टैग की उपस्थिति सहित polyQ क्षेत्र, पार्श्व अनुक्रम पर निर्भर कर रहे हैं, इस प्रकार एक आदर्श प्रयोगात्मक मंच प्रदान करने के व्यवहार पर एफपीएस के प्रभाव का अध्ययन फ्यूजन साथी ।

एफपीएस विभिंन भौतिक गुण है, oligomerize करने के लिए अपनी प्रवृत्ति सहित, कि फ्लोरोसेंट पत्रकारों के संदर्भ में उनके संलयन भागीदारों के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल एक सरल तरीका ?...

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Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

यह लेख प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एकत्रीकरण और polyglutamine विस्तार की विषाक्तता पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रभाव का आकलन करने के लिए फ्लोरोसेंट पत्रकारों के संदर्भ में एक नए पात्र फ्लोरोसेंट प्रोटीन के तेजी से मूल्यांकन के लिए ।

फ्यूजन भागीदारों पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रभाव खमीर में Polyglutamine विषाक्तता परख का उपयोग

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

यह विधि फ्लोरोसेंट प्रोटीन के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है जैसे कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन उनके संलयन भागीदारों को कैसे प्रभावित कर सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन और उनके फ्यूजन पार्टनर्स के प्रभावों का तेजी से और आसानी से स्केलेबल आकलन प्रदान करता है। हालांकि यह विधि फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, इसे अन्य आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड टैग पर भी लागू किया जा सकता है।इसके अलावा इस प्रक्रिया का प्रदर्शन सोनिया Di ग्रेगोरियो, जो पश्चिमी विश्वविद्यालय में स्नातक छात्र है होगा । प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जो इस विधि द्वारा परीक्षण किया जाता है, को पहले खमीर अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया जाता है जो फ्लैग-टैग एचटीटी एक्सोन के एक गैलेक्टोज उत्पीड्य संस्करण को एन्कोड करता है या तो गैर-विषाक्त 25Q दोहराने या हंटिंगटन रोग से जुड़े विषाक्त 72Q दोहराने। क्लोन का चयन और अनुक्रमण द्वारा सत्यापित कर रहे हैं और बाद में खमीर में तब्दील हो।विभिन्न परख के लिए सेल संस्कृतियों को तैयार करने के लिए, कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज के साथ खमीर चयन माध्यम युक्त एक आगर प्लेट पर ब्याज की एक फ्लोरेसेंस प्रोटीन के साथ 25Q या 72Q टैग ले जाने वाले खमीर क्लोन लकीर । एक ही समय में, लकीर खमीर 25Q या 72Q खमीर ले जाने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए मोनोमेरिक सुपरफोल्ड GFP अनुकूलित । दो से तीन दिन तक प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।प्रत्येक प्लेट से तीन एकल कालोनियों तक का चयन करें और कार्बन स्रोत के रूप में 2% ग्लूकोज के साथ पूरक सिंथेटिक पूर्ण माध्यम के पांच मिलीलीटर टीका लगाते हैं। रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें । अगले दिन, कोशिकाओं को गोली मारने के लिए प्रत्येक रात की संस्कृति के 200 माइक्रोलीटर को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब और सेंट्रलाइज में स्थानांतरित करें।बाँझ आसुत पानी से कम से कम तीन बार धोएं। कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोने के लिए ग्लूकोज के सभी निशान है कि GAL1 प्रमोटर के प्रेरण दमन में योगदान कर सकता है खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण है । कोशिकाओं को पहले प्रदर्शित किया गया है और पॉलीक्यू फ्यूजन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए कार्बन स्रोत के रूप में 2% गैलेक्टोज युक्त सिंथेटिक पूर्ण माध्यम में फिर से निलंबित करें।एक नियंत्रण के रूप में, ग्लूकोज युक्त मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। रात भर एक ट्यूब रोटेटर में 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। अगले सुबह, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक संस्कृति के 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें।एक बाँझ 96-अच्छी तरह से प्लेट में सिंथेटिक पूर्ण माध्यम के 100 माइक्रोलीटर में 2 में 2 के एक ऑप्टिकल घनत्व 600 के लिए सेल घनत्व बराबर। अगले कुएं में मीडिया के 80 माइक्रोलीटर में पिछले कुएं से नमूने के 20 माइक्रोलीटर को पाइप करके प्रत्येक नमूने के चार पांच गुना कमजोर पड़ने की तैयारी करें। कोशिकाओं को चयनात्मक प्लेटों पर हाजिर करने और दो दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने के लिए खमीर पिनिंग टूल का उपयोग करें।एक छवि प्रलेखन डिवाइस के साथ प्लेटों छवि। इस परख के लिए सेल संस्कृतियों को तैयार करें और फिर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्रत्येक संस्कृति के OD600 को मापें। ९६-अच्छी थाली में मीडिया के ३०० माइक्रोलीटर में 1 के एक OD600 के लिए कोशिकाओं को पतला ।प्रत्येक नमूना को ट्रिपलीकेट में तैयार करें। मिलाते हुए क्षमताओं के साथ एक प्लेट रीडर इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें। नमूनों की संख्या निर्धारित करें, तापमान 30 डिग्री सेल्सियस पर, 600 नैनोमीटर पर अवशोषित, प्रयोगों की लंबाई 24 घंटे तक, और माप अंतराल 15 मिनट तक।निरंतर झटकों मोड का चयन करें। जब प्रयोग किया जाता है, तो विकास वक्र बनाएं और वैज्ञानिक रेखांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वक्र के तहत क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करें। डेटा को तीन दोहराने वाले मूल्यों के साथ एक XY तालिका में चिपकाएं।ग्रोथ कर्व को लेफ्ट साइड में ग्राफ फोल्डर के नीचे दिखाया जाएगा । वक्र के तहत क्षेत्र की मात्रा निर्धारित करने के लिए, XY विश्लेषण में वक्र के तहत शीर्ष बाईं ओर विश्लेषण और क्लिक क्षेत्र का चयन करें। विकास माध्यम में तैयार कोशिकाओं को 10 गुना पतला करके इस प्रक्रिया को शुरू करें।प्रत्येक नमूने के 200 माइक्रोलीटर को आठ-वेल इमेजिंग कक्ष में स्थानांतरित करें। एक मानक चौड़े क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कोशिकाओं छवि। इमेज अर्जन अधिग्रहण के लिए इमेजिंग सेटिंग्स को समायोजित करें।चूंकि 72Q समुच्चय डिस्टर्ब 25Q सिग्नल की तुलना में बहुत उज्जवल हैं, इसलिए फ्लोरोसेंट सिग्नल के संतृप्ति से बचने के लिए अक्सर विभिन्न प्लाज्मिड के बीच एक अलग अधिग्रहण सेटिंग का उपयोग करना आवश्यक होता है। एक उपयुक्त छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को संसाधित करें। इस प्रोटोकॉल में प्रोटीन एक्सप्रेशन लेवल की जांच के लिए डॉट ब्लॉट का इस्तेमाल किया जाता है।फिनाइलमिथाइलसुल्फोनिल फ्लोराइड के चार माइक्रोमोलर और लाइसिस बफर में प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल जोड़कर प्रोटीन लाइसेट्स पैदा करने के लिए बफर तैयार करें। प्रत्येक रातोंरात संस्कृति के पांच मिलीलीटर को अपकेंद्री द्वारा गोली मारें। कांच के मोतियों के 200 माइक्रोलीटर और लाइसिस बफर के 200 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।12 राउंड के लिए 30 सेकंड के लिए भंवर, राउंड के बीच में आइसिंग । 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 12, 000 बार जी पर सेंट्रलाइज और सुपरनैंट इकट्ठा करें। नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर कुल प्रोटीन की बराबर मात्रा को हाजिर करने के लिए एक माइक्रोफिल्ट्रेशन उपकरण का उपयोग करें।पीबीएस के साथ झिल्ली को प्री-गीला करें और उपकरण को इकट्ठा करें। इसे वैक्यूम स्रोत से कनेक्ट करें और सुनिश्चित करें कि शिकंजा कस दिया गया है। नमूनों को लोड करें, वैक्यूम चालू करें, और गुरुत्वाकर्षण द्वारा झिल्ली के माध्यम से नमूना फ़िल्टर करें।पीबीएस में झिल्ली को दाग 05% ट्वीन 5% वसा मुक्त दूध 30 मिनट के लिए। रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक विरोधी ध्वज एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, पीबीएस 05% ट्वीन के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए झिल्ली को तीन बार धोएं।पीबीएस 05% ट्वीन 5% फैट फ्री दूध में फ्लोरोसेंटी लेबल वाले फ्लोरोसेंटी लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस 05% ट्वीन के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए झिल्ली को तीन बार धोएं। इसके बाद, अमीनो ब्लॉट प्रलेखन प्रणाली का उपयोग करके झिल्ली को छवि करें।खमीर या तो 25Q या 72Q HTT exon एक खमीर अनुकूलित मोनोमेरिक सुपरफोल्डर GFP या खमीर अनुकूलित मोनोमेरिक टैग BFP2 के लिए जुड़े ग्लूकोज या galactose माध्यम में रात भर सुसंस्कृत किया गया था और या तो आगर प्लेटों पर देखा या तरल मीडिया में आगे इनक्यूबेटेड । जबकि 72Q खमीर अनुकूलित मोनोमेरिक सुपरफोल्डर जीएफपी एक महत्वपूर्ण विकास दोष लाती है। 72Q खमीर अनुकूलित मोनोमेरिक टैग बीएफपी 2 गैर-विषाक्त 25Q समकक्षों के समान विकास फेनोटाइप प्रदर्शित करता है जो यह दर्शाता है कि फ्लोरोसेंट टैग की प्रकृति कोशिकाओं में पॉलीक्यू विस्तार व्यवहार में बाधा डाल सकती है।फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंट पॉलीक्यू फ्यूजन के एकत्रीकरण के आकलन से पता चलता है कि 72Q खमीर अनुकूलित मोनोमेरिक सुपरफोल्डर जीएफपी महत्वपूर्ण एकत्रीकरण प्रदर्शित करता है, जबकि 72Q खमीर अनुकूलित मोनोमेरिक टैग बीएफपी2 गैर-विषाक्त 25Q समकक्षों के समान एक डिफ्यूज्ड साइटोप्लाज्मिक सिग्नल प्रदर्शित करता है। चूंकि विभिन्न पॉलीक्यू फ्यूजन का अभिव्यक्ति स्तर विषाक्तता को प्रभावित कर सकता है, इसलिए प्रोटीन के स्तर का आकलन करने के लिए डॉट ब्लॉट किए गए थे। सेल के पांच गुना कमजोर पड़ने के परिणाम दिखाए जाते हैं।यह न भूलें कि यह तकनीक जीएफपी वेरिएंट के साथ अस्वाभाविक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तेजी से तुलना करने की अनुमति देती है, लेकिन यह सीधे अल्पाधिकार का आकलन नहीं कर सकती है। इस प्रक्रिया के बाद, अन्य उपायों, उदाहरण के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं में अल्सर परख फ्लोरोसेंट प्रोटीन की मोनोमेरिक स्थिति जैसे अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

माउस epidermis के आयल धारा पर immunohistochemistry प्रतिदीप्त एंटीबॉडी का उपयोग

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

मानव डीएनए की मरम्मत प्रोटीन के आनुवंशिक अध्ययन एक मॉडल प्रणाली के रूप में खमीर का उपयोग

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

पुनः संयोजक प्रोटीन के Methylotrophic खमीर में अभिव्यक्ति Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

COS-7 के फ्लोरोसेंट लेबलिंग लाइव सेल इमेजिंग के लिए तस्वीर टैग फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

जैविक चुंबकीय मॉडुलन biosensing प्रणाली का उपयोग Assays रैपिड सजातीय जांच

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

खमीर में वृद्धि Assays पॉलीग्लुटामाइन विषाक्तता आकलन करने के लिए

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

प्रोटीन बातचीत मिलकर आत्मीयता शोधन का उपयोग पार्टनर्स की पहचान

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन के विश्लेषण से एक enzymatic सेल फ्यूजन परख का उपयोग

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Metazoan मॉडल जीव का प्रयोग फैल और विषाक्तता prion-तरह प्रोटीन की जांच कर<em&gt; सी। एलिगेंस</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

प्रतियोगिता assays का उपयोग GTPase बंधनकारी प्रोटीन की आत्मीयता की तुलना

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...