Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
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Questo studio è supportato da una sovvenzione di funzionamento da istituti canadesi per ricerca di salute M.L.D e P.L. Il lavoro qui presentato è supportato da un John R. Evans Leader Fund award della Fondazione canadese per l'innovazione e un corrispondente fondo del fondo di ricerca di Ontario per P.L. Y.J. è supportato da un master alla borsa di studio di dottorato trasferimento dal preside della scuola Schulich di M edicine e odontoiatria presso l'Università del Western Ontario. S è supportato da una borsa di studio di dottorato di ricerca in Canada ALS.

1. generazione di nuovo fluorescente Tagged Httex1 reporter per un'espressione in lievito
Nota: Questa sezione è stata modificata dal protocollo di Jiang et al. 16 e Albakri et al. 19.
<ol><li>Disegnare primers per amplificare la sequenza che codifica la proteina fluorescente o interesse mediante PCR. Il primer forward dovrebbe includere una sequenza leader per assistere l'enzima di restrizione durante la digestion...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

In questo articolo, vari metodi per misurare l'aggregazione di Httex1 polyQ espansioni e loro effetto sulla crescita del lievito sono stati impiegati come un modello per studiare come i diversi fluorescente proteine alterano i loro soci di fusione nel contesto del reporter fluorescenti . Usando una variante GFP (ymsfGFP) come controllo positivo, abbiamo mostrato che questo rileva cambiamenti significativi nella tossicità di poliQ e aggregazione tra i diversi tag fluorescente e consente un confronto diretto e ...

Poiché la caratterizzazione iniziale della proteina fluorescente verde (GFP) da Aequorea victoria1, un'ampia tavolozza di FPs codificato geneticamente sono stati sviluppati, permettendo i biologi delle cellule localizzare e monitorare contemporaneamente più eventi/proteine cellulari in vita cellule2,3. FPs sono derivati da organismi multipli, da meduse di corallo e pertanto, visualizzazione specifiche proprietà biofisiche che deviare ampiamente di là di loro rispettivo spettro fluorescente. Queste proprietà includono luminosità, fotostabilità e una tendenza a oligomerizzazione tra gli altri2,4. Selezionando monomerico FPs è un aspetto importante nella selezione di un tag adatto quando si progetta un reporter fluorescente, per minimizzare interazioni inappropriati e alterazioni della funzione del partner di fusione e massimizzare l'efficienza di reporter per un dato il compartimento cellulare4,5,6. Mentre GFP è, nel tempo, stato evoluto per ridurre al minimo l'effetto di aggiungere il tag fluorescente per la fusion partner5,7,8, come nuove varianti di FP eseguire rispetto a GFP rimane difficile da valutare.
Esistono alcuni metodi per caratterizzare il comportamento di FPs. La maggior parte di essi coinvolgono test proprietà biofisiche di FPs utilizzando approcci biochimici, quali ultracentrifugazione e gel filtrazione protocolli9,10,11,12. Tali metodi hanno l'avvertenza di utilizzare purificata FPs in soluzione, offrendo una visione poco sul loro comportamento in cellule intatte. Lo sviluppo delle offerte saggio organizzato reticolo endoplasmatico liscio (OSER) una valutazione quantificabile di tendenza FPs' a oligomerizzazione in vita cellule13 testando la capacità di riorganizzare i tubuli di reticolo endoplasmatico in FPs iperespresso OSER verticilli14. Questa tecnica è in grado di rilevare correttamente le modifiche tra le varianti monomerici e oligomerici di GFP e altri FPs. Tuttavia, esso si basa principalmente sulla sovraespressione in cellule trasfettate transitoriamente e la quantificazione e l'analisi di immagine può richiedere molto tempo, a meno che la tecnica viene adottata come una raccolta automatizzata dei dati e del flusso di lavoro di analisi.
Al fine di integrare questi approcci, abbiamo stabilito un'analisi che sfrutta l'effetto fluorescente tag sulla tossicità e aggregazione di poliQ espansioni in lievito15,16. L'espansione del tratto poliQ con più di 36 ripetizioni all'interno il primo essone del gene codificante che la proteina huntingtina (Htt) è associata con la malattia di Huntington17,18. L'espressione di espanso Httex1 nei risultati di lievito in una forte aggregazione delle proteine misfolded Htt accoppiata ad un difetto di sviluppo severo. Interessante, questi fenotipi sono fortemente influenzati dalle sequenze fiancheggianti il tratto poliQ, tra cui FPs15,16. Esso è stato razionalizzato che le diverse proprietà di FPs differenzialmente possono influenzare la tossicità polyQ in lievito. Infatti, rispetto alla GFP-come FPs, proteine fluorescenti rosse e le loro forme evolute hanno mostrato una ridotta tossicità e aggregazione16. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare l'effetto della prossima generazione di FPs sulla tossicità di poliQ e aggregazione in lievito. Questo test consente un'analisi rapida e potenzialmente ad alto contenuto di varianti FP che può essere utilizzato in parallelo con precedentemente caratterizzato tecniche per la caratterizzazione ottima del nuovo FPs e può valutare come se la cavano rispetto a GFP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

Per l'indagine di localizzazione della proteina e il traffico usando la formazione immagine di cellule vive, i ricercatori spesso si affidano loro proteina di interesse ad un reporter fluorescente di fusione. L'elenco in continua evoluzione delle proteine fluorescenti geneticamente codificate (FPs) presenta agli utenti con diverse alternative quando si tratta di design fusion fluorescente. Ogni FP ha specifiche proprietà ottiche e biofisiche che possono influenzare le proprietà biochimiche, cellulari e funzionali delle fusioni fluorescente risultante. Per esempio, parecchi FPs tendono a formare oligomeri non specifici che sono suscettibili di ostacolare la funzione del partner di fusione. Purtroppo, solo pochi metodi esistono per testare l'impatto di FPs sul comportamento del reporter fluorescente. Qui, descriviamo un metodo semplice che permette la rapida valutazione dell'impatto della FPs utilizzando poliglutammina (polyQ) saggi di tossicità nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Proteine di huntingtin PolyQ espanso sono associati con l'insorgenza della malattia di Huntington (HD), dove l'huntingtina espanso vengono aggregati in oligomeri tossici e corpi di inclusione. L'aggregazione e la tossicità di poliQ espansioni in lievito sono altamente dipendente sulle sequenze fiancheggianti la regione di poliQ, compresa la presenza di tag fluorescente, fornendo così una piattaforma sperimentale ideale per studiare l'impatto di FPs sul comportamento dei loro partner di fusione.

FPs hanno differenti proprietà biofisiche, compresa la loro tendenza a oligomerizzazione, che possono influenzare il comportamento dei loro partner di fusione nel contesto del reporter fluorescenti. Questo protocollo descrive un metodo semplice dove più FPs possono essere fusi per espansioni polyQ tossici. Poiché polyQ tossicità dipende fortemente le sequenze fiancheggianti il tratto poliQ15, questo dosaggio permette un confronto rapido e diretto dei reporter d...

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Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Questo articolo descrive i protocolli per valutare l'effetto di proteine fluorescenti sull'aggregazione e la tossicità di polyglutamine misfolded espansione per la valutazione rapida di una proteina fluorescente appena atipico nel contesto del reporter fluorescenti.

Effetto di proteine fluorescenti su Fusion partner utilizzando saggi di tossicità di Polyglutamine in lievito

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle proteine fluorescenti come come le proteine fluorescenti possono influenzare i loro partner di fusione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una valutazione rapida e facilmente scalabile degli effetti delle proteine fluorescenti e dei loro partner di fusione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul comportamento delle proteine fluorescenti, può anche essere applicato ad altri tag geneticamente codificati.A dimostrare questa procedura sarà anche Sonja Di Gregorio, laureata alla Western University. Ogni proteina fluorescente testata con questo metodo viene prima clonata in un vettore di espressione del lievito che codifica una versione induttabile di galattosio dell'esone HTT contrassegnato da FLAG che ospita la ripetizione 25Q non tossica o la ripetizione toxic 72Q della malattia di Huntington associata. I cloni vengono selezionati e verificati sequenziando e successivamente trasformati in lievito.Per preparare colture cellulari per i vari saggi, striare i cloni di lievito che trasportano tag 25Q o 72Q con una proteina di fluorescenza di interesse su una piastra di agar contenente mezzo di selezione del lievito con glucosio come fonte di carbonio. Allo stesso tempo, il lievito striato che trasporta 25Q o 72Q lievito ha ottimizzato la supercartella monomerica GFP per fungere da controllo positivo. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.Selezionare fino alle tre singole colonie da ogni piastra e inoculare cinque millilitri di mezzo sintetico completo integrato con il 2% di glucosio come fonte di carbonio. Incubare le colture a 30 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, trasferire 200 microlitri di ogni coltura notturna su un tubo di microcentrifugo e centrifuga per pellettizzare le cellule.Lavare almeno tre volte con acqua distillata sterile. È importante lavare bene le cellule per eliminare tutte le tracce di glucosio che potrebbero contribuire a reprimere l'induzione del promotore GAL1. Preparare le cellule come dimostrato in precedenza e sospenderle di nuovo in un supporto completo sintetico contenente il 2% di galattosio come fonte di carbonio per indurre l'espressione di fusioni poliQ.Come controllo, sospendere di nuovo le cellule nei mezzi contenenti glucosio. Incubare le cellule a 30 gradi Celsius in un rotatore di tubi durante la notte. La mattina seguente, misurare la densità ottica a 600 nanometri di ogni coltura usando uno spettrofotometro.Equalizzare le densità cellulari ad una densità ottica 600 di 2 microlitri su 100 di mezzo sintetico completo in una piastra sterile da 96 pozzetti. Preparare quattro diluizioni di cinque volte di ciascun campione pipettando 20 microlitri del campione dal pozzo precedente in 80 microlitri di supporti nel pozzo successivo. Utilizzare uno strumento di inchiodamento del lievito per individuare le cellule su piastre selettive e incubare a 30 gradi Celsius per due giorni.Immagini le lastre con un dispositivo di documentazione dell'immagine. Preparare le colture cellulari per questo saggio e quindi misurare l'OD600 di ogni coltura utilizzando uno spettrofotometro. Diluire le cellule in un OD600 di 1 microlitri su 300 di supporti nella piastra da 96 pozzi.Preparare ogni campione in triplice copia. Incubare la piastra in un incubatore di lettore di lastre con capacità di scuotimento. Impostare il numero di campioni, la temperatura a 30 gradi Celsius, l'assorbanza a 600 nanometri, la lunghezza degli esperimenti a 24 ore e gli intervalli di misurazione a 15 minuti.Selezionare la modalità di agitazione continua. Al termine dell'esperimento, creare la curva di crescita e quantificare l'area sotto la curva utilizzando un software di grafica scientifica. Incollare i dati in una tabella XY con tre valori di replica.La curva di crescita verrà visualizzata sotto la cartella grafici sul lato sinistro. Per quantificare l'area sotto la curva, selezionate analizza in alto a sinistra e fate clic sull'area sotto curva nelle analisi XY. Iniziare questa procedura diluire le cellule preparate 10 volte nel mezzo di crescita.Trasferire 200 microlitri di ciascun campione in una camera di imaging a otto pozzi. Immagini le celle usando un microscopio fluorescente standard a campo largo. Regolare le impostazioni di imaging per l'acquisizione dell'immagine.Poiché gli aggregati 72Q sono molto più luminosi del segnale 25Q diffuso, è spesso necessario utilizzare un'impostazione di acquisizione diversa tra i diversi plasmidi al fine di evitare la saturazione del segnale fluorescente. Elaborare le immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini adatto. In questo protocollo, dot blot viene utilizzato per esaminare i livelli di espressione proteica.Preparare il tampone per generare glisati proteici aggiungendo quattro micromolari di fluoruro di fenilmetilsulfonil e un cocktail inibitore della proteasi al tampone di lysis. Pellet cinque millilitri di ogni coltura notturna per centrifugazione. Sospendere di nuovo le celle in 200 microlitri di perline di vetro e 200 microlitri di tampone dilisi.Vortice per 30 secondi per 12 round, ciliegina tra un round e l'altro. Centrifuga a 12.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti e raccogli il supernatante. Utilizzare un apparato di microfiltrazione per individuare uguali quantità di proteine totali su una membrana nitrocellulosa.Pre-bagnare la membrana con PBS e assemblare l'apparecchio. Collegarlo a una fonte di vuoto e assicurarsi che le viti siano serrate. Caricare i campioni, accendere il vuoto e lasciare che il campione filtri attraverso la membrana per gravità.Asciugare la membrana in PBS 05%Tween 5% latte senza grassi per 30 minuti. Incubare la membrana con anticorpi anti-flag primari a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, lavare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna con PBS 05%Tween.Incubare la membrana con un anticorpo secondario etichettato fluorescentmente in PBS 05%Tween 5% latte privo di grassi a temperatura ambiente per un'ora. Lavare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna con PBS 05%Tween. Successivamente, immagini la membrana utilizzando un sistema di documentazione amino macchia.Il lievito che esprime esonero HTT 25Q o 72Q fuso a GFP monomerico ottimizzato per lievito o tag monomerico ottimizzato per lievito BFP2 è stato coltivato in glucosio o mezzo galattosio durante la notte e individuato su piastre di agar o incubato ulteriormente in mezzi liquidi. Mentre la supercartella monomerica ottimizzata per il lievito 72Q GFP induce un significativo difetto di crescita. L'etichetta monomerica ottimizzata per il lievito 72Q BFP2 mostra un fenotipo di crescita simile alle controparti 25Q non tossiche che indicano che la natura del tag fluorescente può impedire il comportamento di espansione del polyQ nelle cellule.La valutazione dell'aggregazione delle fusioni poliQ fluorescenti mediante microscopia fluorescente mostra che la supercartella monomerica ottimizzata per il lievito 72Q GFP mostra un'aggregazione significativa, mentre il tag monomerico ottimizzato per il lievito 72Q BFP2 mostra un segnale citoplasmatico diffuso simile alle controparti 25Q non tossiche. Poiché i livelli di espressione delle varie fusioni poliQ potrebbero influire sulla tossicità, sono state eseguite macchie di punti per valutare i livelli proteici. Vengono mostrati i risultati di diluizioni cinque volte dei lire cellulari.Non dimenticare che questa tecnica consente un rapido confronto delle proteine non caratteristiche e fluorescenti con le varianti GFP, ma non può valutare direttamente l'oligomerizzazione. Seguendo questa procedura, altre misure, ad esempio, il saggio dell'ulcera nelle cellule di mammifero possono essere eseguite per rispondere a domande aggiuntive come lo stato monomerico delle proteine fluorescenti.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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