Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
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M.L.D. とパの健康研究のためカナダの機関から営業許可を支えこの研究ここで示した作業は革新のためのカナダの財団からジョン ・ r ・ エバンス リーダー基金受賞によってサポートされパ能にオンタリオ州研究基金から一致する基金に支えられて修士博士課程転送奨学金にシューリックスクール M 学校の長のedicine ・歯学部西部オンタリオの大学で。S.D.G. は、ALS カナダから博士課程奨学金によってサポートされます。

1. 新しい蛍光タグ Httex1酵母式の報道記者の世代
注: このセクションによって変更されているプロトコルから江ら16と Albakriら19。
<ol><li>蛍光タンパク質または PCR によって関心をコードする配列を増幅するプライマーを設計します。前方のプライマーは、制限酵素消化 (GATC) 中に続いて SpeI 制限サイト (ACTAGT) と興?...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

この記事で Httex1 polyQ 展開と酵母の増殖への影響の集計を測定する様々 な試金がどのように異なる蛍光を勉強するはモデルとして採用されたタンパク質蛍光レポーターのコンテキストでその融合パートナーの変更.肯定的な制御として GFP バリアント (ymsfGFP) を使用して、示した polyQ 毒性と異なる蛍光タグ間集計の大幅な変化を検出とこに対して polyQ FP 融合パフォーマンスの直接かつ?...

オワンクラゲ1、遺伝子にエンコードされた FPs の広いパレットから緑色蛍光タンパク質 (GFP) の初期特性が開発されているので同時にローカライズし、追跡する細胞生物学者が複数にできます。生活イベント/タンパク質は細胞2,3です。FPs は、サンゴとしたがって、彼らのそれぞれの蛍光スペクトルを超えて広く流用表示特定生物物理プロパティにクラゲから複数の有機体から派生します。これらのプロパティには、明るさには、光安定性、2,4他の間で oligomerize する傾向が含まれます。適切なタグの選択の重要な側面は、単量体の FPs を選択する不適切な相互作用と融合パートナーの機能の変化を最小限に抑え、レポーターの効率を最大化するために、蛍光レポーターを設計するとき、細胞内コンパートメント4,5,6を与えられました。GFP、時間をかけて、進化されているフュージョン パートナー5,7、8、蛍光タグの影響を最小限に抑えるため、FP の新しい亜種を実行と比較してどのように GFP のまま評価することは困難です。
FPs の動作を特徴付けるいくつかの方法が存在します。それらのほとんどは、超遠心法などの生化学的アプローチを使用して FPs の生物物理特性のテストを含むし、ゲルろ過プロトコル9,10、11,12。このようなメソッドがあるのままなセルの動作に少し洞察力を提供するソリューションで精製された FPs を使用して警告。組織の円滑な小胞体 (オゼ) 試金提供の開発生活 oligomerize FPs' 傾向の定量的評価細胞13発現 FPs に小胞体尿細管を再編成する能力をテストすることによってオゼ渦巻き14。この手法は、GFP のモノマー ・ オリゴマーのバリエーション、および他の FPs の間の変更を正常に検出できます。主一時的に transfected セルで過剰発現に依存し、定量、画像解析を時間がかかること、自動データ収集および解析ワークフロー技術を採用しない限り、します。
これらのアプローチを補完するために酵母15,16毒性に関する蛍光タグの効果と polyQ 展開の集計の活用を試金を設立しました。以上 36 polyQ ストレッチの拡大は huntingtin 蛋白質 (Htt) がハンチントン病17,18と関連付けられている遺伝子の最初のエクソン内で繰り返されます。拡張 Httex1ミスフォールド Htt タンパク質が重度の成長障害に結合の強い凝集酵母で発現。興味深いことに、これらの表現型は強く FPs15,16を含む polyQ ストレッチを並べる順序によって影響されます。それは FPs のさまざまなプロパティも差動酵母 polyQ 毒性に影響を与えることができます合理化されました。確かに、GFP のような FPs と比べると、赤の蛍光タンパク質とその進化形態を示している減らされた毒性と集計16。この原稿は、次世代 FPs の polyQ 毒性と酵母の凝集の効果を評価するために詳細なプロトコルを提供します。この試金は以前の特徴と並行使用できる FP の亜種の迅速かつ潜在的高コンテンツ分析新しい FPs の最適な評価方法評価方法彼らは GFP と比較して実行できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

蛋白質のローカリゼーションと生細胞イメージングを用いた人身売買の調査、研究者は、しばしば蛍光レポーターに興味の彼らの蛋白質の融合に依存します。遺伝的に符号化された蛍光蛋白質 (FPs) の常に進化するリストは、それは蛍光融合設計に来るときいくつかの選択肢を持つユーザーを示します。各 FP は、結果として得られる蛍光融合の生化学的な携帯電話、および機能のプロパティに影響を与えることができます特定の光学的・生物物理プロパティを持ちます。たとえば、いくつかの FPs はフュージョン パートナーの機能を阻害する影響を受けやすい無指定のオリゴマーを形成する傾向があります。残念ながら、少数の方法だけは、FPs の蛍光レポーターの動作への影響をテストする存在します。ここでは、出芽酵母出芽酵母におけるポリグルタミン (polyQ) 毒性の試金を使用して FPs の影響を迅速に評価できるようにする簡単な方法をについて説明します。PolyQ 拡大 huntingtin 蛋白質は、拡張の huntingtin が有毒なオリゴマーと封入体に集約 (HD)、ハンチントン病の発症に関連付けられます。集約と酵母 polyQ 展開の毒性、蛍光タグ、FPs の動作への影響を研究する理想的な実験プラットフォーム提供の存在を含め、polyQ 地域を並べる順序に大きく依存、フュージョン パートナー。

FPs プロパティを持つ異なる生物物理 oligomerize、傾向を含む蛍光レポーターのコンテキストでその融合パートナーの行動に影響を与えることができます。このプロトコルでは、有毒な polyQ 展開に複数 FPs を融合することができます簡単な方法について説明します。PolyQ 毒性は並ぶ polyQ ストレッチ15シーケンスに依存、ので、この試金は蛍光 polyQ 融合?...

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Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

この資料では、蛍光タンパク質凝集の効果と蛍光レポーターのコンテキストで新しく, 蛍光タンパク質の迅速な評価のための誤って折りたたまれたポリグルタミン拡張の毒性を評価するためにプロトコルについて説明します。

酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

この方法は、蛍光タンパク質が融合パートナーにどのような影響を与えるかなど、蛍光タンパク質の分野における重要な質問に答える手助けとなります。この技術の主な利点は、蛍光タンパク質とその融合パートナーの効果を迅速かつ容易にスケーラブルに評価できることです。この方法は、蛍光タンパク質の挙動に関する洞察を提供することができますが、他の遺伝的にコードされたタグにも適用できます。また、この手順を実証するのは、ウェスタン大学の大学院生であるソーニャ・ディ・グレゴリオです。この方法で試験される各蛍光タンパク質は、まず、無毒な25Q反復またはハンチントン病関連毒性72Q反復のいずれかを収容するFLAGタグ付きHTTエキソン1のガラクトース誘導性バージョンをコードする酵母発現ベクターにクローン化される。クローンは、シーケンシングによって選択され、検証され、その後酵母に変換されます。各種アッセイ用の細胞培養を調製するために、炭素源としてグルコースを含む酵母選択培地を含む寒天プレート上に目的の蛍光タンパク質を有する25Qまたは72Qタグを有する酵母クローンをストリークする。同時に、25Qまたは72Q酵母を運ぶストリーク酵母は、正のコントロールとして機能するように、モノマースーパーフォルダGFPを最適化した。2~3日間、30度でプレートをインキュベートします。各プレートから3つの単一コロニーまで選択し、炭素源として2%グルコースを添加した合成完全培地の5ミリリットルを接種する。一晩摂氏30度で培養します。翌日、各一晩培養物200マイクロリットルをマイクロ遠心チューブと遠心分離機に移して細胞をペレット化する。滅菌蒸留水で少なくとも3回洗浄してください。GAL1プロモーターの誘導を抑え込むのに寄与する可能性のあるブドウ糖の痕跡をすべて排除するために、細胞をうまく洗うことが重要です。先に示したように細胞を調製し、ポリQ融合の発現を誘導する炭素源として2%ガラクトースを含む合成完全培地で再懸濁する。コントロールとして、グルコース含有培地中の細胞を再懸濁する。一晩チューブ回転機で摂氏30度で細胞をインキュベートします。翌朝、分光光度計を用いて各培養液の600ナノメートルで光学濃度を測定する。無菌96ウェルプレートで合成完全培地の100マイクロリットルの2の光学密度600に細胞密度を均等にします。前の井戸から20マイクロリットルのサンプルを次の井戸の80マイクロリットルの培地にピペット処理して、各サンプルの4つの5倍希釈液を調製します。酵母ピン留めツールを使用して、細胞を選択的プレートにスポットし、摂氏30度で2日間インキュベートします。イメージドキュメンテーションデバイスを使用してプレートをイメージします。このアッセイ用の細胞培養物を調製し、分光光度計を用いて各培養物のOD600を測定する。96ウェルプレートの300マイクロリットルの培地で1のOD600に細胞を希釈します。各サンプルを三重に準備します。プレートリーダーインキュベーターに揺れ機能を備えたインキュベートします。サンプル数、温度を摂氏30度、吸光度を600ナノメートル、実験の長さを24時間、測定間隔を15分に設定します。連続揺れモードを選択します。実験が完了したら、成長曲線を作成し、科学的グラフ作成ソフトウェアを使用して曲線下の領域を定量化します。3 つのレプリケート値を持つ XY テーブルにデータを貼り付けます。成長曲線は左側のグラフフォルダーの下に表示されます。カーブの下の領域を定量化するには、左上の解析を選択し、XY 解析で曲線の下の領域をクリックします。調製した細胞を10倍の増殖培地で希釈することにより、この手順を開始する。各サンプルの200マイクロリットルを8ウェルイメージングチャンバーに移します。標準的な広視野蛍光顕微鏡を使用して細胞を画像化します。画像取得のイメージング設定を調整します。72Q凝集体は拡散した25Q信号よりはるかに明るいので、蛍光シグナルの飽和を避けるために、異なるプラスミド間で異なる集録設定を使用することがしばしば必要とされる。適切な画像処理ソフトウェアを使用して画像を処理します。このプロトコルでは、ドットブロットを使用してタンパク質発現レベルを調べます。タンパク質ライセートを生成するためのバッファーを調製し、フェニルメチルスルホニルフッ化物の4マイクロモルとプロテアーゼ阻害剤カクテルをリシスバッファーに添加します。遠心分離により一晩培養したペレットを5ミリリットルずつペレット化する。200マイクロリットルのガラスビーズと200マイクロリットルのライシスバッファーで細胞を再懸濁します。12ラウンドで30秒間渦を起し、ラウンドの合間にアイシングします。摂氏4度で12,000倍Gで10分間遠心分離機を回収し、上清を集めます。ニトロセルロース膜上の全タンパク質の量を等しく発見するために、精密ろ過装置を使用してください。膜をPBSで予め濡らし、装置を組み立てます。真空源に接続し、ネジが締め付けされていることを確認します。サンプルをロードし、真空をオンにし、重力によって膜を通してサンプルをフィルターさせます。30分間、PBS 05%Tween 5%無脂肪ミルクで膜をブロットします。一次抗フラグ抗体を一晩摂氏4度で膜にインキュベートする。翌日、PBS 05%Tweenで、膜を10分間3回洗浄します。PBS 05%Tween 5%脂肪フリーミルクを室温で1時間、蛍光標識二次抗体で膜をインキュベートします。膜をPBS 05%Tweenでそれぞれ10分間3回洗浄します。続いて、アミノブロットドキュメンテーションシステムを使用して膜を画像化します。酵母に融合した25Qまたは72Q HTTエキソンのいずれかを発現する酵母は、酵母最適化モノマースーパーフォルダGFPまたは酵母最適化モノマータグBFP2を一晩グルコースまたはガラクトース培地で培養し、寒天プレート上で発見するか、さらに液体培地にインキュベートした。72Q酵母最適化モノマースーパーフォルダGFPは、重大な成長欠陥を誘導する一方で。72Q酵母最適化モノマータグBFP2は、蛍光タグの性質が細胞内のpolyQ拡張挙動を妨げることができることを示す非毒性25Q対応に類似した増殖表現型を表示する。蛍光顕微鏡による蛍光ポリQ融合の凝集の評価は、72Q酵母最適化モノマースーパーフォルダGFPが有意な凝集を示し、72Q酵母最適化モノマータグBFP2は非毒性25Q対応物と同様の拡散細胞質シグナルを表示することを示している。様々なポリQ融合の発現レベルが毒性に影響を与える可能性があるため、ドットブロットはタンパク質レベルを評価するために行われた。細胞ライセートの5倍希釈からの結果が示される。この技術は、GFP変異体との特徴のない蛍光タンパク質との迅速な比較を可能にしますが、オリゴマー化を直接評価することはできません。この手順に従って、他の手段、例えば哺乳動物細胞における潰瘍アッセイは、蛍光タンパク質の単量体状態などの追加の質問に答えるために行うことができる。

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

蛍光抗体を用いたマウス表皮のパラフィン切片で免疫組織化学

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

成長アッセイ酵母におけるポリグルタミン毒性を評価する

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

競合アッセイを使用してGTPアーゼ結合タンパク質の親和性を比較すると、

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...