Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
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이 연구 M.L.D.와 P.L. 건강 연구를 위한 캐나다 학회에서 운영 보조금에 의해 지원 됩니다. 여기에 제시 된 작품은 존 R. 에반스 지도자 기금 수상 혁신을 위한 캐나다 재단에서 지원 하 고 P.L. Y.J.에 온타리오 연구 기금에서 매칭 펀드 Schulich M 학교 학장에서 박사 전송 하는 MSc에 의해 지원 됩니다. edicine 고 치과에 웨스턴 온타리오 대학. S.D.G.는 ALS 캐나다에서 박사 학위 장학금에 의해 지원 됩니다.

1. 새로운 붙일 태그가 Httex1 효 모에는 식에 대 한 기자 들의 세대
참고:이 섹션은 프로토콜에서에 의해 수정 된 장 외. 16 및 Albakri 외. 19.
<ol><li>형광 단백질 또는 PCR에 의해 관심을 인코딩 순서를 증폭 하는 뇌관 디자인. 앞으로 뇌관 리더 시퀀스 소화 (GATC) 동안 제한 효소 SpeI 제한 사이트 (ACTAGT) 및 관심사의 형광 단백...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

이 문서에서는, Httex1 polyQ 확장 및 효 모 성장에 미치는 영향의 집계를 측정 하기 위해 다양 한 분석 공부 어떻게 다른 형광 모델로 채택 되었다 단백질 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 퓨전 파트너 변경 . 우리이 polyQ 독성 및 집계 다른 형광 태그 사이 상당한 변화를 감지 하 고 polyQ FP 퓨전 성능에 대 한 직접적이 고 빠른 비교에 대 한 수 보여 긍정적인 컨트롤로 GFP 변형 (ymsfGFP)를 사용 하 ...

이후 Aequorea 빅토리아1, 유전자 인코딩된 FPs의 넓은 팔레트에서에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 초기 특성을 개발 하 고, 허용 동시에 지역화 및 추적 세포 생물학 여러 생활에서 셀룰러 이벤트/단백질 세포2,3. FPs는 산호, 그리고 그러므로, 표시 특정 생물 속성을 광범위 하 게 그들의 각각 형광 스펙트럼 넘어 전환에 해파리에서 여러 유기 체에서 파생 됩니다. 이러한 속성에는 밝기, photostability, 및 다른 사람의 사이에서 oligomerize2,4경향이 포함 됩니다. 부적절 한 상호 작용 및 융합 파트너의 기능 변경 최소화 하 고 대 한 기자 효율 극대화 형광 기자를 설계할 때 적합 한 태그의 선택에 중요 한 측면 이다 단위체 FPs를 선택 하는 주어진 세포 구획4,,56. GFP는, 시간이 지남에 진화 되었습니다 융합 파트너5,,78형광 태그를 추가 하는 효과 최소화 하기 위해 하는 동안 GFP 남아 평가 하기 어려운 새로운 FP의 변종에 비해 수행 하는 방법.
FPs의 동작에 몇 가지 방법이 존재 한다. 그들의 대부분 ultracentrifugation 같은 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 프레임의 생물 속성 테스트를 포함 하 고 젤 여과 프로토콜9,10,,1112. 이러한 메서드는 그대로 셀에 그들의 행동에 약간의 통찰력을 제공 하는 솔루션에서 순화 된 프레임을 사용 하 여 경고. 조직된 부드러운 바인딩과 그물 (OSER) 분석 결과 제공의 개발 FPs' 경향이 생활에서 oligomerize의 정량 평가에 떠다니고 그물 tubules를 재구성 overexpressed FPs의 능력을 테스트 하 여13 세포 OSER whorls14. 이 기술을 성공적으로 GFP의 단위체 및 oligomeric 변형 및 다른 프레임 간의 변화를 감지할 수 있습니다. 그러나, overexpression 뚜렷이 transfected 세포에 주로 의존 하 고 정량 및 이미지 분석 시간이 걸릴 수 기술을 자동화 된 데이터 수집 및 분석 워크플로우로 채택 하지 않는 한.
이러한 접근을 보완 하기 위해 효 모15,16에서 독성에 형광 태그의 효과 및 polyQ 확장의 집계의 이용 하는 분석 결과 설립 했습니다. 이상 36와 polyQ 스트레치의 확장 huntingtin 단백질 (Htt)이 헌팅턴 병17,18연관 유전자 인코딩 첫 번째 엑손에서 반복 됩니다. 가혹한 성장 결함을 결합 misfolded Htt 단백질의 강한 집계에 효 모 결과에 확장된 Htte x 1 의 식입니다. 흥미롭게도,이 고기 FPs15,16를 포함 하 여 polyQ 스트레치 측면 시퀀스에 의해 강하게 좌우 된다. 그것은 프레임의 다른 속성 polyQ 독성 누 룩에 영향을 미칠 차동 수 합리화 했다. 실제로, GFP 같은 FPs에 비해 붉은 형광 단백질 및 그들의 진화 형태 나타났습니다 감소 독성 및 집계16. 이 원고는 polyQ 독성과 효 모에 집계에 FPs의 다음 세대의 효과 평가 하기 위해 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 분석 결과 이전 특징을 동시에 사용할 수 있는 FP의 변종의 신속 하 고 잠재적으로 하이 콘텐츠 분석에 대 한 새로운 FPs 고 수의 최적의 특성에 대 한 기술 평가 어떻게 그들이 수행 GFP에 비해 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

단백질 지 방화 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여 매매의 수사에 대 한 연구는 종종 형광 기자에 게 관심사의 그들의 단백질을 융합에 의존 합니다. 끊임없이 진화 목록이 유전자 인코딩된 형광 성 단백질 (FPs) 형광 퓨전 디자인에 관해서 여러 대안을 가진 사용자를 선물 한다. 각 FP는 특정 광학 및 생물 속성이 결과 형광 융해의 생화학, 세포, 및 기능 속성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 여러 FPs 융합 파트너의 기능에 방해에 취약 일반 올리고를 형성 하는 경향이 있다. 불행히도, 몇 가지 방법만 형광 기자의 행동에 FPs의 영향을 테스트 위해 존재 합니다. 여기, polyglutamine (polyQ) 독성 분석 실험을 사용 하 여 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 FPs의 영향의 급속 한 평가 가능 하 게 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 확장 huntingtin 단백질 확장된 huntingtin 독성 올리고 포함 시체로 집계 Huntington의 질병 (HD)의 증상과 연결 됩니다. 집계 및 효 모에 polyQ 확장의 독성은 높은 FPs의 행동에 미치는 영향을 공부 하는 이상적인 실험 플랫폼을 제공 하는 형광 태그의 존재를 포함 하 여 polyQ 지역 측면 시퀀스에 따라 그들의 퓨전 파트너입니다.

FPs는 다른 생물 속성, oligomerize에 그들의 추세를 포함 하 여 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 융합 파트너의 동작에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜에는 여러 FPs 독성 polyQ 확장을 융합 하는 수 있는 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 독성 측면 polyQ 스트레치15시퀀스에 상당히 의존 때문에,이 분석 결과 형광 polyQ 퓨전 기자 (그림 1)?...

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Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.

효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

이 방법은 형광 단백질이 융합 파트너에게 어떤 영향을 미칠 수 있는지와 같은 형광 단백질 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 단백질과 융합 파트너의 효과에 대한 신속하고 쉽게 확장 가능한 평가를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 형광 단백질 행동에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 다른 유전자 인코딩 태그에도 적용 할 수 있습니다.또한이 절차를 시연하는 것은 웨스턴 대학의 대학원생인 소냐 디 그레고리오입니다. 이 방법에 의해 시험되는 각 형광 단백질은 먼저 비독성 25Q 반복 또는 헌팅턴 질병 관련 독성 72Q 반복을 수용하는 플래그 태그 HTT 엑온의 갈라토세 유도 할 수 없는 버전을 인코딩하는 효모 발현 벡터로 복제된다. 클론은 시퀀싱에 의해 선택되고 검증되고 이어서 효모로 변환됩니다.다양한 애사에 대한 세포 배양을 준비하기 위해, 25Q 또는 72Q 태그를 운반하는 효모 클론을 탄소원으로 포도당으로 효모 선택 배지를 함유하는 한천 판에 관심 있는 형광 단백질을 적어 놓는다. 동시에, 25Q 또는 72Q 효모를 운반하는 줄무늬 효모는 양성 제어 역할을 하기 위해 단황 슈퍼폴더 GFP를 최적화했다. 2~3일 동안 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다.각 플레이트에서 최대 3개의 단일 콜로니를 선택하고 탄소 원으로 2%의 포도당으로 보충된 합성 완전 배지의 5밀리리터를 접종한다. 하룻밤 사이에 30도에서 문화를 배양하십시오. 다음 날, 각 야간 배양200마이크로리터를 미세원심분리기 튜브및 원심분리기로 이송하여 세포를 펠릿화한다.멸균 증류수로 적어도 세 번 씻으라. GAL1 프로모터의 유도를 억압하는 데 기여할 수 있는 포도당의 모든 흔적을 제거하기 위해 세포를 잘 씻는 것이 중요합니다. 이전에 입증된 바와 같이 세포를 준비하고 폴리Q 융합의 발현을 유도하기 위해 탄소 원으로서 2%의 갈라토스를 함유한 합성 완전 배지에서 세포를 다시 중단한다.대조군으로서 포도당 함유 매체에서 세포를 다시 중단한다. 하룻밤 동안 튜브 회전기에서 섭씨 30도에서 세포를 배양하십시오. 다음 날 아침, 분광광계를 사용하여 각 배양의 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다.세포 밀도를 멸균 96웰 플레이트에서 합성 완전 배지 의 100 마이크로리터 에서 2의 광학 밀도 600으로 균등화한다. 이전 우물에서 샘플의 20 마이크로리터를 파이프팅하여 각 샘플의 4개의 5배 희석제를 다음 우물에서 80 마이크로리터의 미디어로 배관하여 준비합니다. 효모 고정 도구를 사용하여 셀을 선택적 플레이트에 발견하고 2 일 동안 섭씨 30도에서 배양하십시오.이미지 설명서 장치로 플레이트를 이미지화합니다. 이 분석법에 대한 세포 배양을 준비한 다음 분광계를 사용하여 각 배양의 OD600을 측정합니다. 96웰 플레이트에서 300 마이크로리터의 미디어 중 1개 중 OD600으로 세포를 희석시 희석시다.각 샘플을 삼중으로 준비합니다. 흔들리는 기능을 사용하여 플레이트 판독기 인큐베이터에 플레이트를 배양합니다. 시료 수, 섭씨 30도의 온도, 흡광도 600 나노미터, 실험 의 길이를 24시간으로 설정하고 측정 간격을 15분으로 설정합니다.연속 흔들림 모드를 선택합니다. 실험이 완료되면 성장 곡선을 만들고 과학 그래프 소프트웨어를 사용하여 곡선 아래 영역을 정량화합니다. 데이터를 세 개의 복제 값으로 XY 테이블에 붙여 넣습니다.성장 곡선은 왼쪽의 그래프 폴더 아래에 표시됩니다. 곡선 아래 영역을 정량화하려면 왼쪽 위에서 분석하고 XY 분석에서 곡선 아래 영역을 클릭합니다. 준비된 세포를 성장 배지에서 10배 희석하여 이 절차를 시작합니다.각 샘플의 200마이크로리터를 8웰 이미징 챔버로 옮기습니다. 표준 와이드 필드 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지합니다. 이미지 수집을 위한 이미징 설정을 조정합니다.72Q 응집체는 확산된 25Q 신호보다 훨씬 밝기 때문에 형광 신호의 포화를 피하기 위해 다른 플라스미드 간에 다른 획득 설정을 사용해야 하는 경우가 많습니다. 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. 이 프로토콜에서, 닷 블롯은 단백질 발현 수준을 검사하기 위하여 이용됩니다.페닐메틸설포닐 불소의 4마이크로몰라와 리시스 완충제에 프로테아제 억제제 칵테일을 추가하여 단백질 용액생성을 위한 완충액을 준비한다. 펠릿 원심 분리에 의해 각 하룻밤 문화의 다섯 밀리리터. 유리 구슬의 200 마이크로 리터와 200 개의 용해 버퍼에서 세포를 다시 중단합니다.12라운드 동안 30초 동안 소용돌이가 회전합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 12, 000배 G로 10분 동안 상주합니다. 마이크로 여과 장치를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에서 동일한 양의 총 단백질을 발견하십시오.PBS로 멤브레인을 미리 적시고 장치를 조립합니다. 진공 소스에 연결하고 나사를 조여 있는지 확인합니다. 시료를 적재하고, 진공을 켜고, 시료가 중력에 의해 멤브레인을 통해 필터를 할 수 있도록 합니다.PBS 05%Tween 5%의 무지방 우유를 30분 동안 막에 블롯합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1 차적인 항플래그 항체로 막을 배양하십시오. 다음 날, PBS 05%Tween으로 각각 10분 동안 멤브레인을 세 번 씻는다.PBS 05%Tween 5%의 지방 이차 항체에서 1시간 동안 실온에서 형광으로 표시된 이차 항체로 멤브레인을 배양합니다. PBS 05%Tween으로 멤브레인을 각각 10분 동안 세 번 씻으시다. 그 후, 아미노 블롯 문서화 시스템을 사용하여 멤브레인을 이미지.효모는 효모에 융합된 25Q 또는 72Q HTT 엑슨 1개를 효모에 최적화된 단량형 슈퍼폴더 GFP 또는 효모 최적화 단황 태그 BFP2는 하룻밤 사이에 포도당 또는 갈라토스 배지에서 배양하여 한천판에서 발견되거나 액체 매체에서 더 많이 배양하였다. 반면 72Q 효모최적화 단황 슈퍼폴더 GFP는 상당한 성장 결함을 유도한다. 72Q 효모 최적화 단황 태그 BFP2는 형광 태그의 특성이 세포에서 폴리Q 확장 거동을 방해할 수 있음을 나타내는 비독성 25Q 대응과 유사한 성장 표현형을 나타낸다.형광 현미경 검사법에 의한 형광 폴리Q 융합의 집계 평가는 72Q 효모최적화 된 단황 슈퍼폴더 GFP가 상당한 응집을 표시하는 반면, 72Q 효모 최적화 단황 태그 BFP2는 무독성 25Q 대응과 유사한 확산 된 세포질 신호를 표시합니다. 다양한 폴리Q 퓨전의 발현 수준이 독성에 영향을 줄 수 있기 때문에, 도트 블롯은 단백질 수치를 평가하기 위해 수행되었다. 세포 용양의 5 배 희석의 결과가 표시됩니다.이 기술은 GFP 이체와 특징되지 않은 형광 단백질의 신속한 비교를 허용하지만, 직접 올리고머화를 평가할 수 없다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 이어, 다른 측정, 예를 들어, 포유류 세포내궤양 분석체는 형광 단백질의 단황 상태와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

형광 항체를 사용하여 마우스 표피의 파라핀 섹션에 Immunohistochemistry

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

연구

생물학

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Methylotrophic 효모에서 재조합 단백질의 표현 Pichia pastoris의</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

성장 Assays은 효모에서 Polyglutamine 독성을 평가하기 위해

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

경쟁 분석법을 이용는 GTPase - 결합 단백질의 친화 비교

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...