Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Denne studien er støttet av en drift tilskudd fra den kanadiske institutter for Health Research M.L.D. og P.L. Arbeidet presentert her er støttet av en John R. Evans leder Fund award fra det kanadiske stiftelsen for innovasjon og en matchende fondet fra Ontario Research Fund P.L. Y.J. støttes av en MSc til PhD overføring stipend fra dekan ved Schulich School of M edicine og odontologi på The University of Western Ontario. S.D.G. støttes av PhD stipend fra ALS Canada.

1. generasjon av nye Fluorescently merket Httex1 journalister for et uttrykk i gjær
Merk: Denne delen har blitt endret fra protokollen av Jiang et al. 16 og Albakri et al. 19.
<ol><li>Utforme primere å forsterke sekvensen koding fluorescerende protein eller interesse PCR. Fremover primer bør inneholde en leder sekvens for å hjelpe begrensning enzymet under fordøyelsen (GATC), etterfulgt av en SpeI begrensning n...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

I denne artikkelen, ulike analyser måle aggregering av Httex1 polyQ utvidelser og deres effekt på gjær vekst ble ansatt som modell å studere hvordan ulike fluorescerende proteiner endre deres fusion partnere i sammenheng med fluorescerende journalister . Bruker en GFP variant (ymsfGFP) som en positiv, viste vi at dette oppdager betydelige endringer i polyQ giftighet og aggregasjonen mellom ulike fluorescerende koder og tillater en direkte og rask sammenligning av polyQ-FP fusion ytelse mot GFP-merket konst...

Siden første karakterisering av grønne fluorescerende protein (GFP) fra Aequorea victoria1, et stort palett av genetisk kodet FPs er utviklet, slik at celle biologer samtidig lokalisere og spore flere mobilnettet hendelser/proteiner i levende celler2,3. FPs er avledet fra flere organismer, fra maneter koraller, og derfor bestemte Biofysiske Skjermegenskaper som avlede mye utover deres respektive fluorescerende spektrum. Disse egenskapene inkluderer lysstyrke, photostability og en tendens til å oligomerize blant annet2,4. Velge monomerisk FPs er et viktig aspekt ved valg av en passende koden når du utformer fluorescerende reporter, for å minimere upassende interaksjoner og endringer av fusion partnerens funksjon og maksimere effektiviteten reporter for en gitt mobilnettet seksjon4,5,6. Mens GFP har over tid utviklet seg til å minimere virkningen av å legge fluorescerende koden til fusion partner5,7,8, hvordan nye FP varianter utfører i forhold til GFP er vanskelig å vurdere.
Noen metoder finnes for å karakterisere opptreden av FPs. De fleste av dem involverer testing Biofysiske egenskaper fps med biokjemiske tilnærminger, slik som ultracentrifugation og gel filtrering, protokoller,9,,10,,11,,12. Slike metoder har påminnelse om bruker renset FPs i løsning, tilbyr inn i deres atferd i intakt celler. Utviklingen av organisert glatte endoplasmatiske retikulum (OSER) analysen tilbyr en kvantifiserbare vurdering av FPs' tendens til å oligomerize i levende celler13 ved å teste muligheten for overexpressed FPs å omorganisere endoplasmatiske retikulum tubules i OSER kranser14. Denne teknikken kan oppdage endringer mellom monomerisk og oligomeric varianter av GFP og andre FPs. Men den avhenger mest overuttrykte i transiently transfekterte celler, og kvantifisering og bildeanalyse kan være tidkrevende hvis teknikken er vedtatt som en automatisert innsamling og analyse arbeidsflyt.
For å utfylle disse tilnærmingene, etablerte vi en analyse som drar nytte av effekten av fluorescerende koder på toksisitet og samling av polyQ utvidelser i gjær15,16. Utvidelse av polyQ strekningen med mer enn 36 gjentar innen den første ekson genet koding huntingtin protein (Htt) er assosiert med Huntingtons sykdom17,18. Uttrykk for utvidet Httex1 i gjær fører til en sterk samling av misfolded Htt protein kombinert en alvorlig vekst defekt. Interessant, er disse fenotyper sterkt påvirket av sekvenser flankert polyQ strekningen, inkludert FPs15,16. Det var rasjonaliserte at de forskjellige egenskapene til FPs ulikt kan påvirke polyQ toksisitet i gjær. Faktisk, sammenlignet med GFP-lignende FPs, røde fluorescerende proteiner og utviklet former har vist en redusert giftighet og aggregering16. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for å vurdere effekten av neste generasjon av FPs på polyQ giftighet og aggregering i gjær. Denne analysen gir en rask og potensielt høy-innhold analyse av FP varianter som kan brukes parallelt med tidligere preget teknikker for optimal karakterisering av nye FPs og kan vurdere hvordan de utfører i forhold til GFP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

For etterforskningen av protein lokalisering og handel med levende celle imaging, stole forskere ofte på smelte deres protein interesse fluorescerende reporter. Listen stadig utvikling av genetisk kodet fluorescerende proteiner (FPs) gir brukerne flere alternativer når det gjelder fluorescerende fusion design. Hver FP har bestemte optisk og Biofysiske egenskaper som kan påvirke biokjemiske mobilnettet og funksjonelle egenskapene til de resulterende fluorescerende fusjoner. For eksempel flere FPs tendens til å danne spesifikke oligomers som er utsatt for hindre på funksjon av fusion partneren. Dessverre finnes bare noen metoder for å teste effekten av FPs på oppførselen til fluorescerende reporteren. Her beskriver vi en enkel metode som lar rask vurdering av virkningen av FPs med polyglutamine (polyQ) toksisitet analyser i spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-utvidet huntingtin proteiner er forbundet med utbruddet av Huntingtons sykdom (HD), hvor den utvidede huntingtin samler inn giftig oligomers og inkludering organer. Aggregering og toksisitet av polyQ utvidelser i gjær er svært avhengig av sekvenser flankert polyQ regionen, inkludert tilstedeværelse av fluorescerende koder, noe som gir en ideell eksperimentelle plattform for å studere virkningen av FPs på oppførselen til deres Fusion-partner.

FPs har forskjellige Biofysiske egenskaper, inkludert deres tendensen å oligomerize, som kan påvirke deres fusion partnere i sammenheng med fluorescerende journalister. Denne protokollen beskriver en enkel metode der flere FPs kan være smeltet sammen til giftige polyQ utvidelser. Siden polyQ toksisitet er svært avhengig av sekvenser flankert polyQ strekk15, gir denne analysen en rask og direkte sammenligning av fluorescerende polyQ fusion journalister (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Denne artikkelen beskriver for å vurdere effekten av fluorescerende proteiner på aggregering og toksisitet av misfolded polyglutamine utvidelse for rask vurdering av en nylig uncharacterized fluorescerende protein i konteksten av fluorescerende journalister.

Effekten av fluorescerende proteiner på Fusion partnere bruker Polyglutamine toksisitet analyser i gjær

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen fluorescerende proteiner som hvordan fluorescerende proteiner kan påvirke deres fusjonspartnere. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir en rask og lett skalerbar vurdering av effekten av fluorescerende proteiner og deres fusjonspartnere. Selv om denne metoden kan gi innsikt i fluorescerende protein atferd, Det kan også brukes på andre genetisk kodet koder.Også demonstrere denne prosedyren vil være Sonja Di Gregorio, som er utdannet student ved Western University. Hvert fluorescerende protein som testes av denne metoden, klones først inn i en gjæruttrykksvektor som koder en galaktoseinduserbar versjon av FLAG-merket HTT exon en som skjuler enten den giftfrie 25Q-repetisjonen eller Huntington-sykdommen som er forbundet med giftig 72Q-repetisjon. Kloner velges og verifiseres ved sekvensering og deretter forvandles til gjær.For å forberede cellekulturer for de ulike analysene, strek gjærklonene som bærer 25Q eller 72Q-tag med et fluorescensprotein av interesse på en agarplate som inneholder gjærvalgmedium med glukose som karbonkilde. Samtidig, strek gjær bærer 25Q eller 72Q gjær optimalisert monomeric superfolder GFP å tjene som en positiv kontroll. Inkuber platene ved 30 grader Celsius i to til tre dager.Velg opptil de tre enkeltkoloniene fra hver plate og inokuler fem milliliter syntetisk komplett medium supplert med 2% glukose som karbonkilde. Inkuber kulturene ved 30 grader Celsius over natten. På neste dag overfører du 200 mikroliter av hver overnattingskultur til et mikrocentrifugerør og sentrifuge for å pellet cellene.Vask minst tre ganger med sterilt destillert vann. Det er viktig å vaske cellene godt for å eliminere alle spor av glukose som kan bidra til å undertrykke induksjonen av GAL1-promotoren. Forbered cellene som demonstrert tidligere og re-suspendere dem i syntetisk komplett medium som inneholder 2% galaktose som karbonkilde for å indusere uttrykket av polyQ fusjoner.Som en kontroll, re-suspendere cellene i glukoseholdige medier. Inkuber cellene ved 30 grader Celsius i en rørrotator over natten. Neste morgen måler du den optiske tettheten ved 600 nanometer av hver kultur ved hjelp av et spektrofotometer.Utjevn celletetthetene til en optisk tetthet 600 av 2 i 100 mikroliter syntetisk komplett medium i en steril 96-brønnsplate. Forbered fire femdoblinger av hver prøve ved å pipetter 20 mikroliter av prøven fra den forrige brønnen til 80 mikroliter medier i neste brønn. Bruk et gjærfesteverktøy for å oppdage cellene på selektive plater og inkubere ved 30 grader Celsius i to dager.Bilde platene med en bildedokumentasjonsenhet. Forbered cellekulturene for denne analysen, og mål deretter OD600 av hver kultur ved hjelp av et spektrofotometer. Fortynn cellene til en OD600 av 1 av 300 mikroliter medier i 96-brønnplaten.Forbered hver prøve i triplicate. Inkuber platen i en plateleser inkubator med risteevner. Still inn antall prøver, temperaturen ved 30 grader Celsius, absorbansen ved 600 nanometer, lengden på eksperimentene til 24 timer, og måleintervallene til 15 minutter.Velg kontinuerlig ristingsmodus. Når eksperimentet er ferdig, lage vekstkurven og kvantifisere området under kurven ved hjelp av vitenskapelig grafprogramvare. Lim inn dataene i en XY-tabell med tre replikere verdier.Vekstkurven vises under grafmappen til venstre. Hvis du vil kvantifisere området under kurven, velger du analyser øverst til venstre og klikker området under kurve i XY-analyser. Start denne prosedyren ved å fortynne de forberedte cellene 10 ganger i vekstmedium.Overfør 200 mikroliter av hver prøve til et åtte-brønns bildekammer. Bilde cellene ved hjelp av et standard wide-field fluorescerende mikroskop. Juster bildeinnstillingene for bildeanskaffelse.Siden 72Q-aggregatene er mye lysere enn det diffuse 25Q-signalet, er det ofte nødvendig å bruke en annen oppkjøpsinnstilling mellom de forskjellige plasmidene for å unngå metning av fluorescerende signal. Behandle bildene ved hjelp av en passende bildebehandlingsprogramvare. I denne protokollen brukes dot blot til å undersøke proteinuttrykksnivåer.Forbered bufferen for å generere proteinlylater ved å tilsette fire mikromolar fenylmetylsulfonylfluorid og en proteasehemmercocktail til lysisbufferen. Pellet fem milliliter av hver overnatting kultur ved sentrifugering. Re-suspendere cellene i 200 mikroliter av glassperler og 200 mikroliter lysis buffer.Vortex i 30 sekunder i 12 runder, glasur mellom rundene. Sentrifuge ved 12 000 ganger G ved fire grader Celsius i 10 minutter og samle supernatant. Bruk et mikrofiltrasjonsapparat for å oppdage like mengder totalt protein på en nitrocellulosemembran.Forvutvr membranen med PBS og monter apparatet. Koble den til en vakuumkilde og kontroller at skruene er strammet. Last prøvene, slå på vakuumet, og la prøven filtrere gjennom membranen ved tyngdekraften.Blot membranen i PBS 05% Tween 5% fettfri melk i 30 minutter. Inkuber membranen med primært antistoff med antiflagg ved fire grader Celsius over natten. På neste dag vask membranen tre ganger i 10 minutter hver med PBS 05% Tween.Inkuber membranen med et fluorescerende merket sekundært antistoff i PBS 05% Tween 5% fettfri melk ved romtemperatur i en time. Vask membranen tre ganger i 10 minutter hver med PBS 05% Tween. Deretter bilde membranen ved hjelp av en amino flekk dokumentasjonssystem.Gjær uttrykker enten 25Q eller 72Q HTT exon en smeltet til gjær optimalisert monomeric superfolder GFP eller gjær optimalisert monomeric tag BFP2 ble dyrket i glukose eller galaktose medium over natten og enten oppdaget på agar plater eller inkubert videre i flytende medier. Mens 72Q gjær optimalisert monomerisk superfolder GFP induserer en betydelig vekstfeil. 72Q gjær optimalisert monomerisk tag BFP2 viser en vekst fenotype som ligner på de giftfrie 25Q kolleger som indikerer at arten av fluorescerende tag kan hindre polyQ ekspansjon atferd i celler.Vurdering av aggregering av fluorescerende polyQ fusjoner av fluorescerende mikroskopi viser at 72Q gjær optimalisert monomerisk superfolder GFP viser betydelig aggregering, mens 72Q gjær optimalisert monomerisk tag BFP2 viser et diffust cytoplasmatisk signal som ligner på de giftfrie 25Q kolleger. Siden uttrykksnivåer av de ulike polyQ-fusjonene kunne påvirke toksisiteten, ble prikkloter utført for å vurdere proteinnivåer. Resultater fra fem ganger fortynninger av cellelylatene vises.Ikke glem at denne teknikken tillater rask sammenligning av ukarakteriserte og fluorescerende proteiner med GFP-variantene, men det kan ikke direkte vurdere oligomerisering. Etter denne prosedyren kan andre tiltak, for eksempel såranalysen i pattedyrceller, utføres for å svare på flere spørsmål som den monomeriske statusen til fluorescerende proteiner.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Vekst Analyser å vurdere Polyglutamine giftighet i Gjær

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifisering av Protein Samspill Partners Bruke Tandem Affinity Rensing

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analyse av snare-mediert membran fusion Bruke en Enzymatisk Cell Fusion Assay

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Gransker spredning og Toxicity of prion-lignende Proteiner Bruke metazoan modellorganisme<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Sammenligning av Affinity of GTPase-bindende proteiner ved anvendelse av kompetitive analyser

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...