Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
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Este estudo é suportado por uma subvenção de funcionamento de institutos canadenses para pesquisa em saúde para M.L.D. e paixao O trabalho aqui apresentado é suportado por um prêmio de John R. Evans líder fundo da Fundação Canadense para a inovação e um fundo correspondente do fundo de investigação do Ontário para paixao Y.J. é suportado por um MSc para bolsa de doutorado transferência do reitor da escola de Schulich M edicine e odontologia na Universidade de Ontário ocidental. S.D.G. é suportado por uma bolsa de doutorado do Canadá ALS.

1. geração de novo fluorescente etiquetado Httex1 repórteres para uma expressão em levedura
Nota: Esta secção foi modificada o protocolo por Jiang et al . 16 e Albakri et al . 19.
<ol><li>Desenho de primers para amplificar a sequência de codificação da proteína fluorescente ou interesse pelo PCR. O primer para a frente deve incluir uma sequência de líder para ajudar a enzima de restrição durante a dige...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. 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J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

Neste artigo, vários ensaios para medir a agregação de Httex1 polyQ expansões e seu efeito sobre o crescimento de levedura foram utilizados como modelo para estudar como diferente fluorescente proteínas alteram seus parceiros de fusão no contexto dos repórteres fluorescentes . Usando uma variante GFP (ymsfGFP) como um controle positivo, mostramos que isso detecta alterações significativas de toxicidade polyQ e agregação entre diferentes etiquetas fluorescentes e permite uma comparação direta e rá...

Desde a caracterização inicial da proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria1, uma variada gama de FPs geneticamente codificado foram desenvolvidos, permitindo que biólogos da célula localizar e rastrear simultaneamente múltiplos eventos/proteínas celulares na vida células2,3. FPs são derivadas de vários organismos, de água-viva de coral e, portanto, a exibição Propriedades biofísicas específicas que desviam-se extensivamente para além de seu respectivo espectro fluorescente. Essas propriedades incluem o brilho, fotoestabilidade e uma tendência para oligomerize, entre outros,2,4. Selecionar monomérico FPs é um aspecto importante na seleção de uma marca adequada ao projetar um repórter fluorescente, a fim de minimizar interações inadequadas e alterações da função do parceiro fusão e maximizar a eficiência de repórter para uma dado compartimento celular4,5,6. Enquanto as boas práticas agrícolas, ao longo do tempo, sido evoluiu para minimizar o efeito de adicionar a tag fluorescente para a fusão parceiro5,7,8, como novas variantes FP executam em relação ao GFP continua a ser difícil de avaliar.
Existem alguns métodos para caracterizar o comportamento de FPs. A maioria deles envolve testar propriedades biofísicas de FPs usando abordagens bioquímicas, tais como ultracentrifugação e gel filtração protocolos9,10,11,12. Tais métodos têm a limitação do uso de FPs purificada em solução, oferecendo pequeno insight sobre seu comportamento nas células intactas. O desenvolvimento do retículo endoplasmático liso organizado (OSER) ensaio oferece uma avaliação quantificável da tendência de FPs' a oligomerize em vida células13 , testando a capacidade de FPs Blumental de reorganizar os túbulos do retículo endoplasmático em Espirais OSER14. Esta técnica com êxito pode detectar alterações entre monoméricas e oligoméricas variantes de GFP e outros FPs. No entanto, baseia-se principalmente na superexpressão em células transfectadas transitoriamente, e a quantificação e análise de imagens podem ser demorados, a menos que a técnica é adotada como uma coleção de dados automatizada e fluxo de trabalho de análise.
A fim de complementar essas abordagens, estabelecemos um ensaio que se beneficia do efeito de etiquetas fluorescentes sobre a toxicidade e a agregação de expansões polyQ no fermento15,16. A expansão do trecho com mais de 36 polyQ repete dentro o primeiro exon de codificação do gene que da proteína huntingtina (Htt) está associada com a doença de Huntington17,18. A expressão de expandido Httex1 em resultados de levedura em um forte agregação da proteína Htt misfolded acoplada a um defeito grave de crescimento. Curiosamente, estes fenótipos são fortemente influenciados pelas sequências flanqueando o trecho polyQ, incluindo FPs15,16. Isso foi racionalizado que as diferentes propriedades de FPs diferencialmente podem afetar polyQ toxicidade no fermento. De fato, comparado ao GFP-como FPs, proteínas fluorescentes vermelhas e suas formas evoluídas mostraram uma reduzida toxicidade e agregação16. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para avaliar o efeito da próxima geração de FPs na toxicidade polyQ e agregação em levedura. Este ensaio permite uma análise rápida e potencialmente alto teor de variantes FP que pode ser usado em paralelo com anteriormente caracterizada técnicas para caracterização ideal de novo FPs e pode avaliar qual o seu desempenho em comparação com as boas práticas agrícolas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

Para a investigação de localização da proteína e tráfico utilizando imagens de células vivas, pesquisadores muitas vezes dependem de sua proteína de interesse para um repórter fluorescente de fusão. A lista em constante evolução de proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (FPs) apresenta aos usuários com várias alternativas quando se trata de projeto de fusão fluorescente. Cada FP tem propriedades específicas de ópticas e biofísicas que podem afetar as propriedades bioquímicas, celulares e funcionais das fusões fluorescentes resultantes. Por exemplo, vários FPs tendem a formar oligómeros inespecíficos que são susceptíveis de impedir a função do parceiro de fusão. Infelizmente, apenas alguns métodos existem para testar o impacto de FPs sobre o comportamento do repórter fluorescente. Aqui, descrevemos um método simples que permite a avaliação rápida do impacto da FPs usando polyglutamine (polyQ) ensaios de toxicidade em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Huntingtina expandido PolyQ proteínas estão associadas com o aparecimento da doença de Huntington (HD), onde a huntingtina expandida agrega em oligômeros tóxicos e corpos de inclusão. A agregação e a toxicidade do polyQ expansões em levedura são altamente dependentes as sequências flanqueando a região polyQ, incluindo a presença de etiquetas fluorescentes, proporcionando uma plataforma experimental ideal para estudar o impacto do FPs sobre o comportamento de seus parceiro de fusão.

FPs têm diferentes propriedades biofísicas, incluindo sua tendência a oligomerize, que podem afetar o comportamento dos seus parceiros de fusão no contexto dos repórteres fluorescentes. Este protocolo descreve um método simples onde várias FPs pode ser fundido a expansões polyQ tóxicos. Desde polyQ toxicidade é altamente dependente as sequências flanqueando o estiramento polyQ15, este ensaio permite uma comparação rápida e direta de repórteres de fus...

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Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Este artigo descreve os protocolos para avaliar o efeito de proteínas fluorescentes na agregação e toxicidade de misfolded polyglutamine expansão para a avaliação rápida de uma proteína fluorescente recentemente descaracterizada no contexto dos repórteres fluorescentes.

Efeito de proteínas fluorescentes na fusão parceiros usando Polyglutamine ensaios de toxicidade em levedura

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das proteínas fluorescentes, como como as proteínas fluorescentes podem afetar seus parceiros de fusão. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma avaliação rápida e facilmente escalável dos efeitos das proteínas fluorescentes e seus parceiros de fusão. Embora este método possa fornecer informações sobre o comportamento da proteína fluorescente, ele também pode ser aplicado a outras tags geneticamente codificadas.Também demonstrando esse procedimento estará Sonja Di Gregorio, que é estudante de pós-graduação na Western University. Cada proteína fluorescente testada por este método é primeiramente clonada em um vetor de expressão de levedura que codifica uma versão indutível galactose de exon HTT marcado por BANDEIRA, abrigando a repetição não tóxica do 25Q ou a repetição tóxica 72Q associada à Doença de Huntington. Os clones são selecionados e verificados por sequenciamento e posteriormente transformados em leveduras.Para preparar culturas celulares para os vários ensaios, listrar os clones de levedura carregando etiqueta 25T ou 72Q com uma proteína de fluorescência de interesse em uma placa de ágar contendo meio de seleção de leveduras com glicose como fonte de carbono. Ao mesmo tempo, a levedura de raia carregando leveduras 25Q ou 72Q otimizada superpatos monoméricas GFP para servir como um controle positivo. Incubar as placas a 30 graus Celsius por dois a três dias.Selecione até as três colônias únicas de cada placa e inocula cinco mililitros de meio completo sintético suplementado com 2% de glicose como fonte de carbono. Incubar as culturas a 30 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, transfira 200 microliters de cada cultura durante a noite para um tubo de microcentrifuuagem e centrífuga para pelotar as células.Lave pelo menos três vezes com água destilada estéril. É importante lavar bem as células para eliminar todos os traços de glicose que poderiam contribuir para reprimir a indução do promotor GAL1. Prepare as células como demonstrado anteriormente e suspenda-as em meio sintético completo contendo 2% de galactose como fonte de carbono para induzir a expressão de fusões de poliq.Como controle, suspenda as células em mídia contendo glicose. Incubar as células a 30 graus Celsius em um rotador de tubo durante a noite. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros de cada cultura usando um espectrofotômetro.Equalize as densidades celulares a uma densidade óptica de 600 de 2 em 100 microlitres de meio sintético completo em uma placa estéril de 96 poços. Prepare quatro diluições de cinco vezes de cada amostra, pipetando 20 microliters da amostra do poço anterior em 80 microliters de mídia no próximo poço. Use uma ferramenta de fixação de levedura para detectar as células em placas seletivas e incubar a 30 graus Celsius por dois dias.Imagem das placas com um dispositivo de documentação de imagem. Prepare as culturas celulares para este ensaio e, em seguida, meça o OD600 de cada cultura usando um espectrofotômetro. Diluir as células para um OD600 de 1 em 300 microliters de mídia na placa de 96 poços.Prepare cada amostra em triplicado. Incubar a placa em uma incubadora leitora de placas com capacidades de agitação. Defina o número de amostras, a temperatura em 30 graus Celsius, a absorvância em 600 nanômetros, o comprimento dos experimentos para 24 horas, e os intervalos de medição para 15 minutos.Selecione o modo de agitação contínua. Quando o experimento é feito, crie a curva de crescimento e quantifique a área sob a curva usando software de gráficos científicos. Cole os dados em uma tabela XY com três valores de replicação.A curva de crescimento será mostrada sob a pasta de gráficos no lado esquerdo. Para quantificar a área sob a curva, selecione analisar no canto superior esquerdo e clicar na área sob curva em análises XY. Inicie este procedimento diluindo as células preparadas 10 vezes em meio de crescimento.Transfira 200 microliters de cada amostra para uma câmara de imagem de oito poços. Imagem das células usando um microscópio fluorescente de campo amplo padrão. Ajuste as configurações de imagem para aquisição de imagens.Uma vez que os agregados 72Q são muito mais brilhantes do que o sinal 25Q difundido, muitas vezes é necessário usar um ajuste de aquisição diferente entre os diferentes plasmídeos, a fim de evitar a saturação do sinal fluorescente. Processe as imagens usando um software adequado de processamento de imagens. Neste protocolo, a mancha de ponto é usada para examinar os níveis de expressão proteica.Prepare o tampão para gerar lisesicas adicionando quatro micromolar de flúor de fenilmetilsulfonil e um coquetel inibidor de protease ao tampão de lise. Pellet cinco mililitros de cada cultura da noite para o dia por centrifugação. Suspenda as células em 200 microliters de contas de vidro e 200 microliters de tampão de lise.Vórtice por 30 segundos por 12 rounds, congelando entre as rodadas. Centrifugar a 12.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos e coletar o supernaspe. Use um aparelho de microfiltração para detectar quantidades iguais de proteína total em uma membrana de nitrocelulose.Pré-molhar a membrana com PBS e montar o aparelho. Conecte-o a uma fonte de vácuo e certifique-se de que os parafusos estão apertados. Carregue as amostras, ligue o vácuo e deixe a amostra filtrar através da membrana por gravidade.Borrite a membrana em PBS 05%Tween 5% leite sem gordura por 30 minutos. Incubar a membrana com anticorpo anti-bandeira primário a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave a membrana três vezes por 10 minutos cada com PBS 05%Tween.Incubar a membrana com um anticorpo secundário rotulado fluorescentemente em PBS 05%Tween 5% de leite livre de gordura à temperatura ambiente por uma hora. Lave a membrana três vezes por 10 minutos cada com PBS 05%Tween. Posteriormente, imagem a membrana usando um sistema de documentação amino blot.Levedura expressando exon 25Q ou 72Q HTT um fundido à superpatos monomérica otimizada de levedura GFP ou marca monomérica otimizada de levedura BFP2 foi cultivada em glicose ou meio galactose durante a noite e ou manchada em placas de ágar ou incubada ainda mais em mídia líquida. Enquanto a levedura 72T otimizada superpatos monomérica GFP induz um defeito significativo de crescimento. A marca monomérica otimizada de levedura 72Q BFP2 exibe um fenótipo de crescimento semelhante às contrapartes não tóxicas do 25T indicando que a natureza da tag fluorescente pode impedir o comportamento de expansão do polq nas células.A avaliação da agregação das fusões de poliQ fluorescentes por microscopia fluorescente mostra que a superpatosa monomérica 72Q otimizada GFP exibe agregação significativa, enquanto a tag monomérica otimizada de 72Q BFP2 exibe um sinal citoplasmático difuso semelhante às contrapartes não tóxicas do 25T. Uma vez que os níveis de expressão das várias fusões de QI poderiam afetar a toxicidade, manchas de pontos foram realizadas para avaliar os níveis de proteína. Os resultados das diluições cinco vezes dos lises celulares são mostrados.Não se esqueça que essa técnica permite uma comparação rápida de proteínas não caracterizadas e fluorescentes com as variantes GFP, mas não pode avaliar diretamente a oligomerização. Após esse procedimento, outras medidas, por exemplo, o ensaio de úlcera em células mamíferas podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como o status monomérico das proteínas fluorescentes.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Imuno-histoquímica em parafina da epiderme do rato utilizando anticorpos fluorescentes

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Biologia

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expressão de proteínas recombinantes em levedura metilotróficas Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Labeling fluorescentes de COS-7 expressando as proteínas SNAP tag-Fusion para imagens de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Ensaios de crescimento para avaliar a toxicidade poliglutamina em Levedura

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Comparando-se a afinidade de proteínas de ligação utilizando ensaios de competição de GTPase

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...