Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Denna studie stöds av ett driftsbidrag från den kanadensiska institut för hälsa forskning till M.L.D. och P.L. Arbetet presenteras här stöds av en John R. Evans ledare Fund award från den kanadensiska Institutet för Innovation och en matchande fond från Ontario forskningsfonden till P.L. yj stöds av civilingenjör till PhD överföring stipendium från dekanus för den Schulich School av M läkemedlet och tandvård vid The University of Western Ontario. S.D.G. stöds av ett PhD stipendium från ALS Kanada.

1. generering av ny Fluorescently taggade Httex1 reportrar för ett uttryck i jäst
Obs: Detta avsnitt har ändrats från protokollet av Jiang et al. 16 och Albakri o.a. 19.
<ol><li>Design grundfärger att förstärka sekvensen kodning på fluorescerande protein eller ränta med PCR. Forward primer bör omfatta en ledare sekvens för att bistå den restriktionsenzym under matsmältningen (GATC), följt av en SpeI be...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

I denna artikel, olika analyser att mäta sammanläggning av Httex1 polyQ expansioner och deras inverkan på jäst tillväxt var anställda som en modell att studera hur olika fluorescerande proteiner förändrar deras fusion partners i samband med fluorescerande reportrar . Med en god Jordbrukarsed variant (ymsfGFP) som en positiv kontroll, visade vi att detta upptäcker betydande förändringar i polyQ toxicitet och aggregering mellan olika fluorescerande Taggar och möjliggör en direkt och snabb jämförel...

Eftersom den ursprungliga karakteriseringen av grönt fluorescerande protein (GFP) från Aequorea victoria1, en bred palett av genetiskt kodade FPs har utvecklats, så att cellbiologer att lokalisera och spåra samtidigt flera cellulära händelser/proteiner i levande celler2,3. FPs härleds från flera organismer, från maneter till coral och därför kan specifika biofysiska egenskaper för bildskärm att avleda utförligt bortom deras respektive fluorescerande spektrum. Dessa egenskaper omfattar ljusstyrka, photostability och en tendens att oligomerize bland annat2,4. Att välja monomer FPs är en viktig aspekt i valet av en lämplig tagg när du utformar en fluorescerande reporter, för att minimera olämpliga interaktioner och förändringar av fusion partnerns funktion och maximera reporter effektivitet för en ges mobilfack4,5,6. Medan GFP, över tid, har utvecklats för att minimera effekten av att lägga till taggen fluorescerande till fusion partner5,7,8, hur nya FP varianter utföra jämfört med GFP är fortfarande svårt att bedöma.
Det finns några metoder för att karakterisera uppförandet av FPs. De flesta av dem omfattar försök biofysiska egenskaper för FPs med biokemiska metoder, såsom ultracentrifugering och gel filtrering protokoll9,10,11,12. Sådana metoder har förbehållet att använda renat FPs i lösning, som ger lite insikt i deras beteende i intakta celler. Utvecklingen av den organisera slät endoplasmatiska nätverket (OSER) test erbjudanden en kvantifierbar bedömning av FPs' tendensen till oligomerize i levande celler13 genom att testa överuttryckt FPs förmåga att omorganisera endoplasmatiska retiklet tubuli in OSER virvlar14. Denna teknik kan identifiera ändringar mellan monomer och Oligomera varianter av god Jordbrukarsed och andra FPs. Men det bygger mestadels på överuttryck i normalnivå transfekterade celler och den kvantifiering och bildanalys kan vara tidskrävande såvida inte tekniken antas som en automatisk datainsamling och analys arbetsflöde.
För att komplettera dessa närmar sig, etablerat vi en analysmetod som utnyttjar effekten av fluorescerande taggar på toxicitet och aggregering av polyQ expansioner i jäst15,16. Utbyggnaden av sträckan polyQ med mer än 36 upprepas inom den första exon gen kodning huntingtin proteinet (Htt) är associerad med Huntingtons sjukdom17,18. Uttrycket av utökade Httex1 i jäst resulterar i en stark aggregation av felveckning Htt protein kopplat till en kraftig tillväxt defekt. Intressant, är dessa fenotyper starkt influerad av de sekvenser som flankerar sträckan polyQ, inklusive FPs15,16. Det var rationaliseras att de olika egenskaperna hos FPs differentially kan påverka polyQ toxicitet i jäst. Faktiskt, det har visat en minskad toxicitet och aggregering16jämfört med GFP-liknande FPs, röd fluorescerande proteiner och deras utvecklade former. Detta manuskript ger ett detaljerat protokoll för att bedöma effekten av nästa generation av FPs på polyQ toxicitet och aggregering i jäst. Denna analys möjliggör en snabb och potentiellt hög-innehåll analys av FP varianter som kan användas parallellt med tidigare kännetecknas tekniker för optimal karakterisering av nya FPs och kan bedöma hur de utför jämfört med GFP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

För utredning av protein localization och handel med hjälp av levande cell imaging, forskare förlitar sig ofta på fusing deras protein av intresse för en fluorescerande reporter. Ständigt listan över genetiskt kodade fluorescerande proteiner (FPs) presenterar användare med flera alternativ när det gäller fluorescerande fusion design. Varje FP har särskilda optiska och biofysiska egenskaper som kan påverka de resulterande fluorescerande fusioner biokemiska, cellulära och funktionella egenskaper. Exempelvis flera FPs tenderar att bilda ospecifik oligomerer som är mottagliga för hindra på funktionen av fusion partner. Tyvärr finns bara några metoder för att testa effekterna av FPs på uppförandet av fluorescerande reportern. Här, beskriver vi en enkel metod som möjliggör en snabb bedömning av effekterna av FPs med polyglutamine (polyQ) toxicitet analyser i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-utökade huntingtin protein är associerade med uppkomsten av Huntingtons sjukdom (HD), där den utökade huntingtin aggregerar till toxiska oligomerer och inkludering organ. Sammanläggning och toxicitet av polyQ expansioner i jäst är starkt beroende av de sekvenser som flankerar polyQ regionen, inklusive förekomsten av fluorescerande taggar, vilket ger en idealisk experimentell plattform för att studera inverkan av FPs på beteendet hos sina Fusion partner.

FPs har olika biofysiska egenskaper, inklusive deras tendens att oligomerize, som kan påverka beteendet hos sina fusion partners i samband med fluorescerande reportrar. Det här protokollet beskriver en enkel metod där flera FPs kan vara smält till giftiga polyQ expansioner. Eftersom polyQ toxicitet är starkt beroende av de sekvenser som flankerar polyQ stretch15, tillåter denna analys en snabb och direkt jämförelse av fluorescerande polyQ fusion reportrar (...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Denna artikel beskriver protokoll för att bedöma effekten av fluorescerande proteiner om sammanläggning och toxicitet av felveckning polyglutamine expansion för snabb utvärdering av en nyligen uncharacterized fluorescerande protein inom ramen av fluorescerande reportrar.

Effekten av fluorescerande proteiner på Fusion Partners använder Polyglutamine toxicitet analyser i jäst

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom fluorescerande proteiner som hur fluorescerande proteiner kan påverka deras fusionspartner. Den största fördelen med denna teknik är att den ger en snabb och lätt skalbar bedömning av effekterna av de fluorescerande proteinerna och deras fusionspartners. Även om denna metod kan ge insikt i fluorescerande protein beteende, det kan också tillämpas på andra genetiskt kodade taggar.Också visar detta förfarande kommer att Sonja Di Gregorio, som är en doktorand vid Western University. Varje fluorescerande protein som testas med denna metod klonas först till en jästuttrycksvektor som kodar en galaktosinducerbar version av FLAG-taggad HTT exon en som hyser antingen den giftfria 25Q-upprepningen eller Huntington-sjukdomen som förknippas med toxisk 72Q-upprepning. Kloner väljs ut och verifieras genom sekvensering och därefter omvandlas till jäst.För att förbereda cellkulturer för de olika analyserna, strimma jästen kloner redovisade 25Q eller 72Q tagg med en fluorescens protein av intresse på en agar platta som innehåller jäst urvalsmedium med glukos som kol källa. Samtidigt, strimma jäst bär 25Q eller 72Q jäst optimerade monomeriska superfolder GFP att fungera som en positiv kontroll. Inkubera plattorna i 30 grader Celsius i två till tre dagar.Välj upp till de tre enstaka kolonierna från varje platta och inokulera fem milliliter syntetiskt komplett medium kompletterat med 2%glukos som kolkälla. Inkubera kulturerna vid 30 grader Celsius över natten. På följande dag, överföra 200 mikroliter av varje övernattning kultur till en microcentrifug röret och centrifug till pellet cellerna.Tvätta minst tre gånger med sterilt destillerat vatten. Det är viktigt att tvätta cellerna väl för att eliminera alla spår av glukos som kan bidra till att undertrycka induktion av GAL1 promotorn. Förbered cellerna som visat tidigare och åter avbryta dem i syntetiska komplett medium som innehåller 2%galaktos som kolkälla för att inducera uttrycket av polyQ fusioner.Som en kontroll, åter avbryta cellerna i glukos-innehållande media. Inkubera cellerna i 30 grader Celsius i en rörrotator över natten. På följande morgon, mäta den optiska densiteten vid 600 nanometer av varje kultur med hjälp av en spektrofotometer.Utjämna cellen tätheter till en optisk densitet 600 av 2 i 100 mikroliter av syntetiska komplett medium i en steril 96-brunns platta. Förbered fyra femfaldiga utspädningar av varje prov genom pipettering av 20 mikroliter av provet från föregående brunn in i 80 mikroliter media i nästa brunn. Använd en jäst fästverktyg för att upptäcka cellerna på selektiva plattor och inkubera i 30 grader Celsius i två dagar.Avbilda plattorna med en bilddokumentationsenhet. Förbered cellkulturerna för denna analys och mät sedan OD600 av varje odling med hjälp av en spektrofotometer. Späd cellerna till en OD600 av 1 i 300 mikroliter media i 96-brunnsplattan.Förbered varje prov i tre exemplar. Inkubera plattan i en tallrik läsare inkubator med skakningar kapacitet. Ställ in antalet prover, temperaturen vid 30 grader Celsius, absorbansen vid 600 nanometer, experimentens längd till 24 timmar och mätintervallen till 15 minuter.Välj det kontinuerliga skakningsläget. När experimentet är klart, skapa tillväxtkurvan och kvantifiera området under kurvan med hjälp av vetenskaplig grafprogramvara. Klistra in data i en XY-tabell med tre replikerande värden.Tillväxtkurvan kommer att visas under grafmappen på vänster sida. Om du vill kvantifiera området under kurvan väljer du analysera längst upp till vänster och klickar på område under kurva i XY-analyser. Starta detta förfarande genom att späda ut de beredda cellerna 10-faldig i tillväxtmedium.Överför 200 mikroliter av varje prov till en åtta-brunnsbildkammare. Avbilda cellerna med hjälp av ett vanligt wide-field fluorescerande mikroskop. Justera bildframställningsinställningarna för bildanskaffning.Eftersom 72Q aggregat är mycket ljusare än den diffusa 25Q signalen, är det ofta krävs att använda en annan förvärv inställning mellan de olika plasmiderna för att undvika mättnad av fluorescerande signal. Bearbeta bilderna med hjälp av en lämplig bildbehandlingsprogramvara. I detta protokoll används dot blot för att undersöka proteinuttrycksnivåer.Förbered bufferten för att generera protein lysates genom att tillsätta fyra mikromolar av fenylmetylsulfonylfluorid och en proteashämmare cocktail till lysbufferten. Pellet fem milliliter av varje övernattning kultur genom centrifugering. Re-suspend cellerna i 200 mikroliter av glaspärlor och 200 mikroliter av lysbuffert.Vortex i 30 sekunder i 12 omgångar, isande i mellan omgångarna. Centrifugera vid 12, 000 gånger G vid fyra grader Celsius i 10 minuter och samla supernatanten. Använd en mikrofiltreringsapparat för att upptäcka lika stora mängder totalt protein på ett nitrocellulosamembran.Förväta membranet med PBS och montera apparaten. Anslut den till en vakuumkälla och se till att skruvarna är åtdragna. Ladda proverna, slå på vakuumet och låt provet filtrera genom membranet genom tyngdkraften.Blot membranet i PBS 05%Tween 5%fettfri mjölk i 30 minuter. Inkubera membranet med primär anti-flagga antikropp vid fyra grader Celsius över natten. På följande dag, tvätta membranet tre gånger i 10 minuter vardera med PBS 05%Tween.Inkubera membranet med en fluorescerande märkt sekundär antikropp i PBS 05%Tween 5%fettfri mjölk i rumstemperatur i en timme. Tvätta membranet tre gånger i 10 minuter vardera med PBS 05%Tween. Därefter, bild membranet med hjälp av en amino blot dokumentationssystem.Jäst uttrycker antingen 25Q eller 72Q HTT exon en smält till jäst optimerad monomeric superfolder GFP eller jäst optimerad monomeric tag BFP2 odlades i glukos eller galaktos medium över natten och antingen fläckig på agar plattor eller inkuberas ytterligare i flytande media. Medan 72Q jäst optimerad monomeric superfolder GFP inducerar en betydande tillväxt defekt. 72Q jäst optimerad monomerisk tagg BFP2 visar en tillväxt fenotyp som liknar de giftfria 25Q motsvarigheter som anger att arten av fluorescerande taggen kan hindra polyQ expansion beteende i celler.Bedömning av aggregering av de fluorescerande polyQ fusioner genom fluorescerande mikroskopi visar att 72Q jäst optimerad monomeric superfolder GFP visar betydande aggregering, medan 72Q jäst optimerad monomerisk tagg BFP2 visar en diffus cytoplasmatisk signal som liknar de icke-toxiska 25Q motsvarigheter. Eftersom uttrycksnivåer av de olika polyQ-fusionerna kunde påverka toxiciteten utfördes dot blots för att bedöma proteinnivåer. Resultat från femfaldiga utspädningar av cellen lysates visas.Glöm inte att denna teknik möjliggör snabb jämförelse av okarakteriserade och fluorescerande proteiner med GFP-varianterna, men den kan inte direkt bedöma oligomerisering. Efter detta förfarande kan andra åtgärder, till exempel, såranalysen i däggdjursceller utföras för att besvara ytterligare frågor som den monomeriska statusen för de fluorescerande proteinerna.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Immunohistokemi på Paraffinsnitt av Mouse Epidermis med fluorescerande antikroppar

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetiska studier av människans proteiner DNA Repair använder jäst som modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression av rekombinanta proteiner i Methylotrophic Jäst Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Snabb Homogen detektion av biologiska analyser med magnetkamera System Modulation biosensing

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Tillväxtanalyser att utvärdera polyglutaminsystem toxicitet i jäst

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifiering av Protein Samverkande Partners Använda Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Analys av SNARE-medierad membran fusion Använda en enzymatisk analys Cellfusion

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Undersöka spridning och toxicitet Prion-liknande proteiner Använda metazoan Model Organism<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Jämföra Affinity av GTPas-bindande proteiner med hjälp av konkurrensanalyser

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...