Name: effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Bu çalışmada sağlık araştırma M.L.D. ve P.L. Kanada Enstitüleri çalışma bir hibe tarafından desteklenmektedir Burada sunulan iş John R. Evans lideri Fonu Ödülü yenilik için Kanada Vakfı tarafından desteklenen ve P.L. yj Ontario araştırma fonundan eşleşen bir fon tarafından bir MSc M Schulich okul Dekanı doktora transfer burs için desteklenir son sürümü ve diş hekimliği, University of Western Ontario'dan. S.D.G. ALS Kanada'dan bir Doktora Bursu tarafından desteklenmektedir.

1. nesil yeni Fluorescently öğesini Httex1 Maya bir ifadede muhabirleri
Not: Bu bölüm iletişim kuralından Jiang vd tarafından değiştirildi. 16 ve Albakri vd. 19.
<ol><li>Floresan protein veya ilgi PCR tarafından kodlama sırası yükseltmek için astar tasarım. İleri astar Restriksiyon enzimi SpeI kısıtlama sitesi (ACTAGT) ve (ATG hariç) ATG floresan protein gen ilgi 20 üsleri akıntı yönünde taki...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+tags.">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li><li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+proteins:+advanced+imaging+applications+and+future+design.">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670 (2015).</li><li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles:+serious+pitfalls+and+some+solutions.">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li><li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein.">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics.">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li><li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry,+mutagenesis,+and+oligomerization+of+DsRed,+a+red+fluorescent+protein+from+coral.">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li><li>P&#233;delacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast.">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li><li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions.">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li><li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington's+disease.">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li><li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens.">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li><li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+[version+1;+referees:+1+approved,+1+approved+with+reservations].">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242 (2018).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li><li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation.">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li><li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity.">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li><li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+blue,+green,+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae.">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902 (2013).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li><li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA.">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li><li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C:+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications.">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li><li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1.">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li></ol>

Bu makalede, toplama Httex1 polyQ açılımları ve Maya büyüme üzerindeki etkileri ölçmek için çeşitli deneyleri, bir model olarak ne kadar farklı floresan çalışmaya istihdam edildi proteinler alter füzyon eşleri floresan gazetecilere bağlamında . GFP değişken (ymsfGFP) olumlu bir denetimi kullanarak, biz bu polyQ toksisite ve toplama farklı floresan etiketleri arasındaki önemli değişiklikleri algılar ve polyQ-FP füzyon performans karşı doğrudan ve hızlı karşılaştırması içi...

Aequorea victoria1, genetik olarak kodlanmış FPs geniş bir palet yeşil flüoresan protein (GFP) ilk karakterizasyonu geliştirilen beri hücre biyologları aynı anda yerelleştirilmesine ve izlemek birden çok izin verme hücresel olaylar/proteinler yaşayan hücreleri2,3. FPs denizanası mercan ve bu sayede, görüntü belirli biyofiziksel özellikleri kapsamlı bir şekilde onların anılan sıraya göre floresan spektrum aktarma üzerinden birden çok organizmalar den türemiş. Bu özellikler parlaklık, photostability ve diğerleri arasında2,4oligomerize eğilimi içerir. Monomeric FPs seçmek uygun bir etiket seçiminde önemli bir yönü floresan muhabir uygunsuz etkileşimleri ve füzyon ortağının işlev değişiklikleri en aza indirmek ve muhabir verimliliği en üst düzeye çıkarmak için tasarlarken olur bir hücresel yuvası4,5,6verilen. GFP kez, Füzyon ortağı5,7,8' e, floresan etiket ekleme etkisini en aza indirmek için değişmiştir iken yeni FP türevleri ile karşılaştırıldığında gerçekleştirmek nasıl GFP değerlendirmek zor kalır.
FPs davranışını tanımlamak için birkaç yöntem vardır. Bunların çoğu FPS ultrasantrifüj gibi biyokimyasal yaklaşımları kullanarak biyofiziksel özellikleri test içerir ve filtrasyon protokolleri9,10,11,12jel. Böyle yöntemlerinin davranışlarını olduğu gibi hücrelerde küçük içgörü sunan çözümünde, saflaştırılmış FPs kullanımının bilmeniz gereken vardır. Organize Pürüzsüz endoplazmik retikulum (OSER) tahlil teklifler gelişimi FPs eğilim'da yaşayan oligomerize ölçülebilir bir değerlendirme13 overexpressed FPs endoplazmik retikulum tübüllerin içine yeniden düzenleme yeteneğini test ederek hücreleri OSER gözlemleyebileceğiniz14. Bu tekniği başarıyla GFP monomeric ve oligomeric türevleri ve diğer FPs arasındaki değişiklikleri algılayabilir. Ancak, bu çoğunlukla overexpression geçici transfected hücrelerdeki erişimine ve teknik bir otomatik veri toplama ve analiz iş akışı olarak kabul edilen sürece Nefelometri ve görüntü analizi zaman alıcı olabilir.
Sipariş bu yaklaşımlar tamamlamak için Maya15,16' floresan etiketleri toksisite etkisi ve polyQ açılımları agregasyon yararlanır bir tahlil kurduk. PolyQ streç fazla 36 ile genişleme huntingtin protein (Htt) Huntington hastalığı17,18ile ilişkili gen kodlama ilk exon içinde yineler. Genişletilmiş Httex1 Maya sonucu ciddi büyüme kusur birleştiğinde misfolded Htt protein güçlü bir toplama ifadesi. İlginçtir, bu fenotipleri şiddetle FPs15,16dahil olmak üzere polyQ germek kanat dizileri tarafından etkilenmiştir. FPs farklı özelliklerini differentially Maya polyQ toksisite etkileyebilir rasyonalize. Nitekim, GFP benzeri FPs için karşılaştırıldığında, kırmızı floresan proteinler ve gelişmiş formlarını bir azaltılmış toksisite ve toplama16göstermiştir. Bu el yazması FPs yeni nesil polyQ toksisite ve Maya toplamada etkisini değerlendirmek için detaylı bir protokol sağlar. Bu tahlil ile paralel olarak daha önce karakterize kullanılabilir FP türevleri hızlı ve potansiyel olarak yüksek içeriği analiz için nasıl GFP ile karşılaştırıldığında performans teknikleri yeni FPs ve -ebilmek en uygun karakterizasyonu için değerlendirmek sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent E. coli (High efficiency)</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>C2987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R3133</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New Englanfd Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td>High fidelity enzymes are preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicilin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2 microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments inc</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Pin Replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific inc.</td>
			<td>VP407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI imager</td>
			<td>S&#38;P Robotics inc.</td>
			<td>spImager-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 800 confocal with AryScan</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well Lab-Tek imaging chambers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot apparatus</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemi Doc XRS+</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FLAG M1 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>A32727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid MiniPrep Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Gel extraction Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prizm</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP13354</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effect of fluorescent proteins on fusion partners using polyglutamine toxicity assays in yeast

Protein yerelleştirme ve canlı hücre Imaging'i kullanma kaçakçılığı soruşturma için araştırmacılar çoğunlukla onların protein flüoresan muhabir ilgi eritme üzerinde kullanır. Floresan füzyon tasarım için geldiğinde genetik olarak kodlanmış floresan proteinler (FPs) sürekli gelişen listesi kullanıcılar ile çeşitli alternatifler sunar. Her FP elde edilen floresan füzyon biyokimyasal, hücresel ve fonksiyonel özelliklerini etkileyen belirli optik ve biyofiziksel özellikler vardır. Örneğin, birkaç FPs füzyon ortağının işlevini üzerinde engel duyarlı nonspesifik reaksiyonlar formu eğilimindedir. Ne yazık ki, sadece birkaç yöntem FPs etkisi floresan muhabir davranışını sınamak için mevcut. Burada, polyglutamine (polyQ) toksisite deneyleri tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaekullanarak FPs etkisinin hızlı değerlendirme sağlar basit bir yöntem açıklanmaktadır. Huntingtin PolyQ-genişletilmiş proteinler nerede toksik reaksiyonlar ve dahil organları genişletilmiş huntingtin toplayan Huntington hastalığı (HD), başlangıcı ile ilişkilidir. Toplama ve Maya polyQ açılımları toksisite yüksek floresan Etiketler, böylece FPs davranışı üzerindeki etkisini incelemek için ideal bir deneysel platform sunan varlığı da dahil olmak üzere polyQ bölge kanat dizileri bağlı onların Füzyon ortağı.

Füzyon eşleri floresan gazetecilere bağlamında davranışını etkileyen onların eğilimi oligomerize de dahil olmak üzere farklı biyofiziksel özellikleri, fPs var. Bu iletişim kuralı birden fazla FPs için toksik polyQ açılımları nerede erimiş basit bir yöntem açıklanır. PolyQ toksisite polyQ streç15kanat dizileri son derece bağımlı olduğundan, bu tahlil floresan polyQ füzyon gazetecilere (Şekil 1) hızlı ve...

Watch this Scientific Journal Video about Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast at JoVE.com

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Bu makalede, toplama üzerinde floresan proteinlerin etkisi ve hızlı değerlendirme bağlamında yeni uncharacterized floresan protein misfolded polyglutamine genişlemesi floresan gazetecilere toksisitesi değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar.

Floresan proteinlerin etkisi Polyglutamine toksisite deneyleri Maya kullanılarak füzyon ortakları

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Bu yöntem floresan proteinlerin füzyon ortaklarını nasıl etkileyebileceği gibi floresan proteinler alanında anahtar soruların yanıtlatıcı yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, floresan proteinlerin ve füzyon ortaklarının etkilerinin hızlı ve kolay ölçeklenebilir bir değerlendirmesini sağlamasıdır. Bu yöntem floresan protein davranışı içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer genetik olarak kodlanmış etiketleri uygulanabilir.Bu prosedürü gösteren sonja Di Gregorio, Batı Üniversitesi'nde yüksek lisans öğrencisi olacak. Bu yöntemle test edilen her floresan protein ilk olarak, flag etiketli HTT eksonunun galaktoz indüklenebilir versiyonunu kodlayan bir maya ekspresyonu vektörü içine klonlanır ve toksik olmayan 25Q tekrarı veya Huntington Hastalığı ile ilişkili toksik 72Q tekrarı barındırır. Klonlar seçilir ve sıralama ile doğrulanır ve daha sonra maya dönüştürülür.Çeşitli tahliller için hücre kültürleri hazırlamak için, karbon kaynağı olarak glikoz ile maya seçim ortamı içeren bir agar plaka ilgi bir floresan protein ile 25Q veya 72Q etiketi taşıyan maya klonları çizgi. Aynı zamanda, 25Q veya 72Q maya taşıyan çizgi maya pozitif bir kontrol olarak hizmet etmek için monomerik superfolder GFP optimize. Plakaları 30 derecede 2-3 gün kuluçkaya yatırın.Her plaka dan üç tek koloniler kadar seçin ve karbon kaynağı olarak% 2 glikoz ile desteklenen sentetik tam orta beş mililitre aşılamak. Kültürleri bir gecede 30 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, her gece kültüründen 200 mikrolitreyi bir mikrosantrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın.Steril distile su ile en az üç kez yıkayın. GAL1 organizatörün indüksiyonunun bastırılmasına katkıda bulunabilecek tüm glikoz izlerini ortadan kaldırmak için hücreleri iyi yıkamak önemlidir. Hücreleri daha önce gösterildiği gibi hazırlayın ve polyQ füzyonlarının ekspresyonunu indüklemek için karbon kaynağı olarak %2 galaktoz içeren sentetik komple ortamda yeniden askıya alın.Bir kontrol olarak, glikoz içeren ortamdahücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri bir gecede bir tüp rotatorda 30 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, optik yoğunluğu nu her kültürün 600 nanometre'si bir spektrofotometre kullanarak ölçün.Hücre yoğunluğunu, steril 96 kuyulu bir plakadaki 100 mikrolitre sentetik komple ortada 2'nin 2'sinin 600'ü kadar optik yoğunlukla eşitleştirin. Bir önceki kuyudan 20 mikrolitre numuneyi bir sonraki kuyuda 80 mikrolitre ortama borulandırarak her numunenin dört beş kat seyreltmesini hazırlayın. Hücreleri seçici plakalara göre tespit etmek ve iki gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırmak için bir maya sabitleme aracı kullanın.Plakaları bir görüntü dokümantasyon aygıtıyla görüntüleyin. Hücre kültürlerini bu töziçin hazırlayın ve sonra bir spektrofotometre kullanarak her kültürün OD600'ü ölçün. Hücreleri 96 kuyuluk plakadaki 300 mikrolitre de 1'lik bir OD600'e seyreltin.Her örneği triplicate olarak hazırlayın. Titreme yetenekleri ile bir plaka okuyucu kuluçka plaka kuluçka. Numune sayısını, sıcaklığı 30 santigrat derece, emiciliği 600 nanometre, deneylerin uzunluğunu 24 saate ve ölçüm aralıklarını 15 dakikaya ayarlayın.Sürekli sallayarak modunu seçin. Deneme yapıldığında, büyüme eğrisioluşturun ve bilimsel grafik yazılımını kullanarak eğrinin altındaki alanı ölçün. Verileri üç çoğaltma değeriyle bir XY tablosuna yapıştırın.Büyüme eğrisi sol taraftaki grafik klasörü altında gösterilir. Eğrinin altındaki alanı ölçmek için sol üstteki analizi ve XY analizlerinde eğrinin altındaki alanı tıklatın. Hazırlanan hücreleri büyüme ortamında 10 kat seyrelterek bu işlemi başlatın.Her numuneden 200 mikrolitreyi sekiz kuyulu bir görüntüleme odasına aktarın. Hücreleri standart geniş alan floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Görüntü edinimi için görüntüleme ayarlarını ayarlayın.72Q agregalar dağınık 25Q sinyalden çok daha parlak olduğundan, floresan sinyalinin doygunluğuönlemek için genellikle farklı plazmidler arasında farklı bir kazanım ayarı kullanmak gerekir. Uygun bir görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri işleyin. Bu protokolde protein ekspresyonu düzeylerini incelemek için nokta lekesi kullanılır.Tamponu, lysis tamponuna dört mikromofenietilsülfonil florür ve proteaz inhibitörü kokteyli ekleyerek protein lisatları üretmek için hazırlayın. Pelet santrifüj tarafından her gece kültür beş mililitre. 200 mikrolitre cam boncuk ve 200 mikrolitre likis tamponu ile hücreleri yeniden askıya alın.Girdap 12 mermi için 30 saniye, mermi arasında buzlanma. 12, 000 kez G'de 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin ve süpernatant toplayın. Bir nitroselüloz membran üzerinde toplam protein eşit miktarda nokta için bir mikrofiltrasyon cihazı kullanın.Membranı PBS ile önceden ıslavenin ve cihazı monte edin. Bir vakum kaynağına bağlayın ve vidaların sıkılmış olduğundan emin olun. Örnekleri yükleyin, vakumaçın ve yerçekimi tarafından membran filtre örnek sağlar.PBS%05 Ara %5 yağsız sütte membranı 30 dakika boyunca blotlayın. Membranı bir gecede dört santigrat derecede birincil anti-bayrak antikoruile kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, pbs 05% Tween ile 10 dakika her membran üç kez yıkayın.PBS%05 Ara %5 yağsız sütte floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikorile membranı oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. PBS 05% Tween ile 10 dakika boyunca membran üç kez yıkayın. Daha sonra, bir amino leke dokümantasyon sistemi kullanarak membran görüntü.Maya ya ifade 25Q veya 72Q HTT ekson bir maya optimize monomerik superfolder GFP veya maya optimize monomerik etiket BFP2 erimiş glukoz veya galaktoz orta gecede kültürlü ve ya agar plakaları üzerinde benekli ya da sıvı ortamda daha fazla kuluçkaya yatırıldı. 72Q maya optimize monomerik superfolder GFP önemli bir büyüme kusuru neden olurken. 72Q maya optimize monomerik etiket BFP2, floresan etiketin doğasının hücrelerde poliQ genişleme davranışını engelleyebilir belirten toksik olmayan 25Q benzerlerine benzer bir büyüme fenotipi görüntüler.Floresan poliQ füzyonlarının floresan mikroskopi ile toplanması, 72Q maya optimize edilmiş monomerik süper klasör GFP'nin önemli ölçüde toplama gösterdiğini gösterirken, 72Q maya optimize edilmiş monomerik etiket BFP2 toksik olmayan 25Q muadillerine benzer diffüz sitoplazmik bir sinyal gösterir. Çeşitli poliQ füzyonlarının ekspresyon düzeyleri toksisiteyi etkileyebileceğinden, protein düzeylerini değerlendirmek için nokta lekeleri yapıldı. Hücre lisatlarının beş kat seyreltme sonuçları gösterilmiştir.Bu tekniğin, tanımlanmamış ve floresan proteinlerin GFP varyantları ile hızlı bir şekilde karşılaştırılmasına olanak sağladığını unutmayın, ancak oligomerizasyonu doğrudan değerlendiremez. Bu prosedürü takiben, diğer önlemler, örneğin, memeli hücrelerinde ülser test floresan proteinlerin monomerik durumu gibi ek sorulara cevap için yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Büyüme Tahliller Mayalarda poliglutamin toksisite değerlendirilmesi için

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

Rekabet tahlilleri kullanılarak GTPaz bağlayıcı proteinlerin afinitesini

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...