Name: using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00
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中国国家自然科学基金 (第3180046号) 和辽宁省自然科学基金 (20170540262) 对这项工作给予了支持。这项工作是在大连医科大学第二医院科研中心的实验室完成的。作者要感谢桑小林对流式细胞术的协助, 感谢博曲和杨东川在制作视频方面的协助。

所有程序均根据《国家卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行, 这些程序得到了大连医科大学动物护理和使用委员会的批准。6个月大 (体重30-35 克) 和8周大 (20-25 克) spf (无特定病原体) 雄性 c57bl6 小鼠从大连医科大学 spf 动物中心获得。所有的老鼠都被关押在动物住所里, 可以获得食物和水.温度保持在 20-24°c, 湿度为 40%-70%, 照明为 12小时/12小时暗。在实验前, 动物被允许在环境中适应至少...

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	<li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation.">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).</li><li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis:+multiple+abnormalities,+heterogeneous+responses,+and+evolving+understanding.">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li><li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients:+from+epidemiology+to+evidence-based+management.">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li><li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria.">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance.">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li><li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation.">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils.">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li><li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles(R)+by+granulocytes+in+multiple+species.">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization.">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).</li></ol>

此协议中的步骤非常简单和直接。其中一个关键的步骤是诱导 egfp 在大肠杆菌上的表达。通常, 当一个来自真核生物的基因, 如 egfp, 计划用原核生物表达像大肠杆菌, 有风险的蛋白质将形成不活跃的聚集物 (包涵体), 这改变了蛋白质的原生结构和活性。利用 pet-sumo 载体构造 pet-sumo-egfp 质粒, 成功表达了 egfp-sumo 融合蛋白, 光信号强到足以被荧光显微镜和流式细胞仪检测。
<p class="jove_c...

巨噬细胞吞噬检测常用于研究先天免疫功能。先天免疫反应可能表明易受感染。巨噬细胞系在免疫学研究中得到了广泛的应用。然而, 延长的通道可能会导致基因丢失和这些细胞系的免疫功能受损。因此, 原代腹腔巨噬细胞是研究细胞功能1的理想对象。
虽然先天免疫反应被认为是完整的在老年身体,吞噬能力可能会下降相比, 在年轻的身体2, 3。在这里, 我们将演示一种方法来评估腹腔巨噬细胞的吞噬细胞的年轻 (8周大) 和老年 (16个月大) 使用 egfp 表达大肠杆菌, 这是方便, 快速, 经济上可行的。
使用表达 egfp 的大肠杆菌菌株是本方法的优点之一, 因为这些细菌是稳定的, 并显示强烈的荧光信号, 即使在巨噬细胞固定 4% (w/v) 甲醛。此外, 通过使用表达 egfp 的大肠杆菌, 研究人员不需要进一步染色后吞噬, 这节省了时间。此外, 巨噬细胞对大肠杆菌表面抗原具有免疫耐受性, 使大肠杆菌比使用表达 egfp 的真菌或荧光标记的珠子更适合进行吞噬试验。
使用表达 egfp 的大肠杆菌, 可以很容易地在2小时内完成吞噬检测, 并根据研究人员的用途, 通过流式细胞仪和荧光显微镜进行测量。由于该方法直接测量吞噬能力, 其结果比其他间接方法更具有重现性。
该方法也已在 raw264.7 细胞系和人外周血单个核细胞4中得到验证。下面的文本提供了执行此检测的详细分步说明, 并强调了研究人员可能修改以满足其实验需求的关键步骤。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:886px;" width="887">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:417px;">BD FACSCanto II Flow cytometer</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat101303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Champion pET SUMO Protein Expression system</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Custom Gene Synthesis Service</td>
			<td style="width:176px;">Takara Biotech.</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">DAPI(4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat123110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Leica DMI3000 B&#160; Inverted Microscope</td>
			<td style="width:176px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">PE Rat IgG2a, &#954;-isotype control</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat400507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:417px;">Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution</td>
			<td style="width:176px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:123px;">Cat23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Thioglycollate medium</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T9032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis

这份手稿描述了一种简单和可重复的方法来进行吞噬试验。该方法的第一部分涉及建立一个 pet-sumo-egfp 矢量 (sumo = 小泛素样改性剂), 并在大肠杆菌(bl21de) 中表达增强的绿色荧光蛋白 (egfp)。在37°c 条件下, 与巨噬细胞共培养 1小时;负对照组在冰上孵育相同时间。然后, 巨噬细胞就可以进行评估了。该技术的优点包括步骤简单、简单, 流式细胞仪和荧光显微镜均可测量吞噬能力。即使巨噬细胞与甲醛固定, egfp 表达大肠杆菌也是稳定的, 即使在巨噬细胞固定后也能显示出强烈的荧光信号。该方法不仅适用于巨噬细胞系或原代巨噬细胞的体外评估, 而且适用于外周血单个核细胞粒细胞和单核细胞吞噬的评价。结果表明, 小 (8周) 小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力高于老年 (16个月大) 小鼠的巨噬细胞。总之, 该方法能测定巨噬细胞吞噬, 适用于先天免疫系统功能的研究。

pET-SUMO 载体利用一种类似于泛素的小改性剂, 允许在大肠杆菌中表达原生蛋白质。sumo 融合可以显著提高 egfp 的溶解度, 使其易于检测。如果用乳糖成功诱导 egfp 表达, 则可以在黑暗中观察到绿色菌落 (图 1a)。绿色圆点代表 egfp 表达大肠杆菌, 可以在荧光显微镜下使用40x 物镜观察到 (图 1b)。
<p class="jove_content" fo:kee...

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Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

增强型绿色荧光蛋白表达大肠杆菌评价小鼠腹腔巨噬细胞吞噬细胞增多

在这里, 我们提出了一个评估小鼠腹腔巨噬细胞吞噬使用增强绿色荧光蛋白表达大肠杆菌的方案.

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

该协议演示了一种简单和可产生的方法，使用EGFP表达大肠杆菌评估巨噬细胞的噬菌体细胞形成能力。你好，我叫大连医科大学第二医院的俊宇。今天，我们将向您展示一个简单和可视化的方式来评估巨噬细胞病，可以很容易地在两个小时内完成。该方法在先天免疫功能的研究中得到了广泛的应用。据认为，老年人的先天免疫功能仍然完好无损。因此，今天我们将从老年和年轻的小鼠中分离出内酮巨噬细胞，并了解这两组小鼠的吞噬能力。好吧，我们开始吧。首先，合成EGFP基因片段，使用高保真TaqDNA聚合酶克隆片段。然后将 PCR 产品放入 pET SUMO 矢量中。第三，将结扎产品转化为大肠杆菌菌株，诱导用乳糖表达EGFP。这些EGFP表达大肠杆菌作为噬菌体测定的标记。接下来，对小鼠食距巨噬细胞进行分离和培养。然后，EGFP表达大肠杆菌与巨噬细胞在37摄氏度下被铸造一小时。淬火步骤后，宏噬细胞已做好荧光显微镜和流式细胞仪的测评准备。合成EGFP基因片段，并使用高保真TaqDNA聚合酶用正向和反向底转放大片段。为确保 PCR 产品在下一步中具有用于 TA 克隆的单三端腺苷悬垂，建议在上一个周期后以 72 摄氏度的 30 分钟扩展。通过阿加罗斯凝胶电泳检查 PCR 产品。如果片段被正确放大，可以在凝胶上观察到717 bp波段。使用使用 T4 DNA 连接酶的 TA 克隆方法将 PCR 产品克隆到 pET SUMO 载体中。在室温下孵育反应30分钟。将五微升PCR产品加入100微升的BL21功能细胞中。热在42摄氏度下冲击细胞90秒，然后将混合物留在冰上3分钟。加入 400 微升 LB 介质，在 37 摄氏度下预热。在 37 摄氏度和 120 rpm 转速下摇动一小时。将细菌接种到LB板表面，每毫升卡那霉素100微克，以筛查病媒转化的大肠杆菌。在37摄氏度的烤箱中孵育一夜。第二天，用每毫升卡纳霉素100微克接种5毫升LB介质的阳性菌落。在 37 摄氏度的振动培养箱中孵育，在 120 rpm 时孵育两个小时。然后将诱导乳糖加入每升0.5毫摩尔的最终浓度，并继续摇晃6小时，诱导EGFP表达。经验上，当震动6小时时，OD600可能达到0.7或更高。最后，利用荧光显微镜验证EGFP表达的程度。在幻灯片中加入 10 微升的细菌培养介质。然后用盖板盖住。检查荧光显微镜下EGFP的表达。在100毫升蒸馏水中加入3.5克硫化醇。使用前在自用器中消毒。将硫化醇介质吸入发动机罩中一毫升无菌注射器。每个注射器一只鼠标，以避免感染。用23测针将一毫升3.5%硫化基注射到小鼠腹腔中，用水和食物维持小鼠三天。三天后，在闭合的盒子里迅速诱导麻醉后，通过宫颈脱位使小鼠安乐死。然后，将鼠标放入75%乙醇的盘中进行无菌，并迅速转移到机罩中。将鼠标放在板上，将前爪固定在板上以固定鼠标位置。使用5毫升注射器与20规格的针头，注射5毫升的冷PBS在下腹部到小鼠腹膜腔，避免刺穿肠道。在小鼠腹部的两侧进行温和的按摩。然后轻轻地慢慢吸气腹部液体。将内酮液分配到 50 毫升离心管中。重复这些步骤两到三次。在4至8摄氏度内将悬浮细胞在400克下离心10分钟。丢弃上一提液，用10%的胎儿牛血清在RPMI 1640培养基中重新暂停细胞颗粒。将500万个细胞加入六井板的每个井中，用于流动细胞测定，每井50万个细胞加入荧光显微镜的24井板中。在5%的二氧化碳培养箱中培养37摄氏度的细胞。培养基可以在三个小时后刷新，以去除非连续细胞，因为大多数是淋巴细胞。在明亮的场显微镜下观察细胞，以评估细胞的生存能力和细胞密度。此处显示的图像处于主单元格的正常状态。通常，巨噬细胞密度不高，因为内膜细胞的主要部分是淋巴细胞。从 24 井板中去除培养介质。加入100微升新鲜培养剂和10微升细菌培养。然后在5%的二氧化碳培养箱中孵育37摄氏度的板，孵育一小时。每井用 500 微升的冷 PBS 轻轻清洗三到五次，以洗净非内化细菌。在室温下用PBS中4%甲醛孵育细胞30分钟。用PBS清洗细胞三次。添加法罗丁633结合工作溶液，以染色F-actin。在室温下存放在黑暗潮湿的地方60分钟。加入DAPI工作溶液，在室温的黑暗地方染色细胞核并孵育5分钟。用 PBS 冲洗一次，在蒸馏水中用相同体积冲洗一次。以绿色显示的EGFP表达大肠杆菌是噬菌体病的标记。为了尽量减少实验误差，并正确解释结果，请为实验设置组和控制管，如表2所列。对于将放在冰上的控制组，从六井板中取下介质，用 PBS 清洗一次。然后将每升70毫升冷EDTA加入井中，分离细胞并转移到流动的细胞仪管中。将50微升的细菌悬浮液加入管子，放在冰上一小时。对于其他组，删除培养介质，在每个井中添加一毫升新鲜介质。根据表二中描述的组设置，在井中加入50微升的细菌悬浮液。然后将六井板放在37度5%的二氧化碳培养箱中一小时。为了淬火非内化大肠杆菌的荧光，在井中加入200微升0.8%的水晶紫水溶液，并很快摇摆。此步骤旨在避免 EGFP 大肠杆菌与巨噬细胞表面结合，但非内化导致误报结果。用PBS清洗细胞三次，去除任何残留的水晶紫罗兰。然后将每升70毫升冷EDTA加入井中，分离细胞并转移到流动的细胞仪管中。离心管2000转/5分钟，并丢弃上流水。添加 100 微升 PBS 以重新暂停细胞。根据组设置，将五微升的 F4 ATP 结合抗体加入管中或等值。漩涡在黑暗中短暂地孵育样品5至10分钟。在每个管中加入一毫升 PBS，5 分钟离心 2，000 rpm。丢弃上一杯。用 200 到 300 微升 PBS 重新泵化细胞颗粒，用于流式细胞测量分析。运行每个管并获取至少 10，000 个 F4/80 阳性细胞事件的数据。以下是来自年轻和老年群体的围食巨噬细胞的荧光图像。红色荧光表示F-actin。绿色表示EGFP表达大肠杆菌，蓝色代表被DAPI染色的原子核。这些图像表明，来自年轻小鼠的巨噬细胞比老年小鼠的巨噬细胞具有更强的噬菌体能力。F4/80阳性和EGFP阳性细胞表明巨噬细胞的噬菌体能力。这些结果与荧光显微镜结果的趋势一致。嗯，你看，虽然先天免疫细胞的数量可以保留在老小鼠，噬菌体能力明显下降相比，年轻的小鼠。许多方法已被用于评估巨噬细胞噬菌体。在这里，我们演示了一种方便、快捷、经济可行的改进方法。使用EGFP表达大肠杆菌，噬菌体测定可以方便地通过流动细胞仪和荧光显微镜根据研究人员的喜欢进行和测量。此外，该方法直接测量噬菌细胞的能力。结果与其他间接方法相比更具可重复性。

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Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

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小鼠腹膜腔细胞的分离

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

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免疫与感染

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

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Neuropathogenic的非侵入型<em&gt;大肠杆菌</em&gt;感染乳鼠

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High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

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Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

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一步法负色谱纯化<em&gt;幽门螺杆菌</em&gt;中性粒细胞激活蛋白过度表达<em&gt;大肠杆菌</em&gt;在批处理模式

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

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Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

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利用共焦显微镜可视化巨噬细胞胞外陷阱

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

抗体药物对小鼠骨髓及腹腔巨噬细胞活化作用的评价

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

在大肠杆菌中生成特异的乙酰蛋白的简易协议

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...