Name: using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31800046) en de Natural Science Foundation van Liaoning Province (nr. 20170540262). Dit werk werd gerealiseerd in de laboratoria van het Scientific Research Center aan de tweede ziekenhuis van Dalian medische universiteit. De auteurs bedank Xiao-Lin Sang voor haar hulp bij de stroom cytometry, en Bo Qu en Dong-Chuan Yang voor hun hulp bij het opstellen van de video.

Alle procedures werden uitgevoerd onder de nationale instituten van gezondheid richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren, en de protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité van Dalian medische universiteit. Zestien-maand-oude (met een lichaamsgewicht van 30-35 g) en acht weken oude (20-25 g) SPF (specific pathogen-vrij) mannelijke C57BL/6 muizen werden verkregen van de SPF dierlijke centrum van Dalian Medizinische Universität. Alle muizen werden bewaard in de huisvesting van de die...

<ol>
	<li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation.">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).</li><li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis:+multiple+abnormalities,+heterogeneous+responses,+and+evolving+understanding.">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li><li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients:+from+epidemiology+to+evidence-based+management.">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li><li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria.">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance.">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li><li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation.">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils.">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li><li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles(R)+by+granulocytes+in+multiple+species.">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization.">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).</li></ol>

De stappen in dit protocol zijn vrij eenvoudig en duidelijk. Een van de kritische stappen is voor het opwekken van de expressie van EGFP op E. coli. Meestal, wanneer een gen van eukaryoten, zoals EGFP, is gepland om uit te drukken in prokaryoten zoals E. coli, is er een risico dat het eiwit zal vormen inactief aggregaten (opneming lichamen), waardoor de oorspronkelijke structuur en de activiteit van het eiwit is gewijzigd. Met behulp van het huisdier-SUMO vector en bouw van het huisdier-SUMO-EGFP plasmi...

Macrophage fagocytose tests worden vaak gebruikt voor het bestuderen van het aangeboren immuunsysteem. De aangeboren immuunrespons kan duiden op gevoeligheid voor infectie. Macrophage cellijnen worden veel gebruikt in studies van de immunologie. Echter, de uitgebreide passage kan gene verlies en immuun functies in deze cellijnen in gevaar gebracht. De primaire peritoneale macrofagen zijn dus het ideale object in waarnaar u de cel functie1studie.
Hoewel de aangeboren immuunrespons gedacht intact in het jaar oud lichaam dat werd, kan de fagocytische vermogen afnemen in vergelijking met dat in de jongere lichaam2,3. Hier zullen we laten zien dat een methode voor de beoordeling van de fagocytose van peritoneale macrofagen van jonge (acht weken oude) en ouderen (16-maand-oude) muis met behulp van EGFP-uiten E. coli, die handig, snel en economisch haalbaar is is.
Het gebruik van een uiting van EGFP E. coli stam is een van de voordelen van deze test omdat deze bacteriën stabiel zijn en een sterke fluorescentie-signaal, zelfs nadat macrofagen worden opgelost door 4% (m/v) paraformaldehyde weergegeven. Bovendien, met behulp van de uiting van EGFP E. coli, onderzoekers hoeft niet verder kleuring na fagocytose, wat tijd bespaart. Bovendien zijn de macrofagen immunoresponsive voor E. coli oppervlakte-antigeen, meer geschikt voor de fagocytose assay dan het gebruik van het uiten van EGFP schimmels of fluoresceïne-geëtiketteerden kralen maken van E. coli .
Met uiten van EGFP E. coli, kan een fagocytose assay gemakkelijk worden bereikt in 2 h en gemeten door beide stroom cytometry en fluorescentie microscopie, afhankelijk van het doel van de onderzoeker. Aangezien deze methode direct de fagocytische mogelijkheid meet, zijn de resultaten meer reproduceerbare dan andere indirecte methoden.
Deze methode is ook gevalideerd in een cellijn van RAW264.7 en perifere bloed mononucleaire cellen4. Onderstaande tekst de gedetailleerde stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van deze test en benadrukt de essentiële stappen die de onderzoekers wijzigen kunnen om te voldoen aan de behoeften van hun experimenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:886px;" width="887">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:417px;">BD FACSCanto II Flow cytometer</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat101303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Champion pET SUMO Protein Expression system</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Custom Gene Synthesis Service</td>
			<td style="width:176px;">Takara Biotech.</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">DAPI(4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat123110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Leica DMI3000 B&#160; Inverted Microscope</td>
			<td style="width:176px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">PE Rat IgG2a, &#954;-isotype control</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat400507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:417px;">Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution</td>
			<td style="width:176px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:123px;">Cat23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Thioglycollate medium</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T9032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het uitvoeren van een fagocytose assay. Het eerste deel van deze methode gaat om het bouwen van een huisdier-SUMO-EGFP vector (SUMO = kleine ubiquitin-achtige modifier) en uiting geven aan verbeterde groene fluorescentie eiwit (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). Uitdrukken van EGFP E. coli is coincubated met macrofagen gedurende 1 uur bij 37 ° C; de negatieve controlegroep is ge¨ uncubeerd op ijs de dezelfde hoeveelheid tijd. De macrofagen zijn klaar voor beoordeling. De voordelen van deze techniek bevatten zijn eenvoudig en duidelijk stappen en fagocytose kan worden gemeten door beide stroom cytometer en fluorescentie Microscoop. De uiting van EGFP E. coli zijn stabiel en een sterke fluorescentie signaal weergeven, zelfs nadat de macrofagen worden bevestigd met paraformaldehyde. Deze methode is niet alleen geschikt voor de beoordeling van macrofaag cellijnen of primaire macrofagen in vitro maar ook geschikt voor de evaluatie van granulocyt en monocyt fagocytose in perifere bloed mononucleaire cellen. Uit de resultaten blijkt dat het fagocytische vermogen van peritoneale macrofagen van jonge (acht weken oude) muizen hoger dan die van macrofagen van leeftijd (16-maand-oude) muizen is. Kortom, deze methode meet macrofaag fagocytose en is geschikt voor de bestudering van het aangeboren immuunsysteem.

De vector van het huisdier-SUMO maakt gebruik van een kleine ubiquitin-achtige modifier zodat de uitdrukking van inheemse proteïnen in de E. coli. SUMO fusion kan aanzienlijk vergroten de EGFP oplosbaarheid, waardoor ze gemakkelijk worden gedetecteerd. Als de expressie van EGFP met succes door lactose veroorzaakt wordt, kunnen groene kolonies worden waargenomen in het donker (figuur 1A). Groene stippen, die de uiting van EGFP E. coli vertegenwoo...

Watch this Scientific Journal Video about Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis at JoVE.com

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van muis peritoneale macrofaag fagocytose met behulp van verbeterde groene fluorescentie eiwit-uiting van Escherichia coli.

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Dit protocol toonde een eenvoudige en reproduceerbare methode aan om het fagocytosevermogen van macrofagen te beoordelen met behulp van EGFP-uitdrukkende Escherichia coli. Hallo, mijn naam is Jun-Yu van het tweede ziekenhuis van dalian Medical University. Vandaag gaan we u een gemakkelijke en visualiseren van de manier om macrofaag fagocytose die gemakkelijk kan worden gedaan binnen twee uur te beoordelen.Deze methode werd veel gebruikt in de studie van de aangeboren immuunfunctie. Er wordt aangenomen dat aangeboren immuunfunctie intact bleef bij ouderen. Vandaag gaan we dus de buikvliesmacrofagen isoleren van de oude en jonge muizen en het fagocytische vermogen van deze twee groepen zien.Laten we beginnen. Ten eerste, synthetiseren van de EGFP gen fragment en kloon het fragment met behulp van high-fidelity Taq DNA polymerase. Ligate het PCR-product vervolgens in de pET SUMO-vector.Ten derde, zet de ligatieproducten om in de E.coli-stam en induceer EGFP uitdrukken met lactose. Deze EGFP-uitdrukkende E.coli diende als marker voor de fagocytosetest. Vervolgens werd een muis peritoneum macrofagen geïsoleerd en gekweekt.Vervolgens werden EGFP-uitdrukkende E.coli een uur lang met de macrofagen gemunt op 37 graden centigrees. Na de blusstap waren de macrofagen klaar voor beoordeling door zowel fluorescentiemicroscoop als stroomcytometer. Synthetiseer het EGFP-genfragment en versterk het fragment met een voorwaartse en omgekeerde primers met behulp van high-fidelity Taq DNA polymerase.Om ervoor te zorgen dat de PCR-producten in de volgende stap enkele drie-end adenine-overhangen voor TA-klonen hadden, wordt een verlenging van 30 minuten bij 72 graden centigrees na de laatste cyclus aanbevolen. Controleer het PCR-product op agarose gel elektroforese. Als het fragment correct is versterkt, kan een 717 bp-band op de gel worden waargenomen.Kloon het PCR-product in de pET SUMO-vector met behulp van de TA-kloonmethode met T4 DNA-ligase. Broed de reactie 30 minuten bij kamertemperatuur uit. Voeg vijf microliter pcr-product toe aan 100 microliter bl21-competente cellen.Verwarm schok de cellen op 42 graden centigrees gedurende 90 seconden, dan houd het mengsel op ijs gedurende drie minuten. Voeg 400 microliter LB medium toe, voorverwarmd op 37 graden centigrees. Schudden een uur bij 37 graden centigrees en 120 rpm.Inenting van de bacteriën op het oppervlak van LB plaat met 100 microgram per milliliter kanamycine om de vector getransformeerde E.coli scherm. Incubeer de plaat in de 37 graden centigrees oven 's nachts. Op de volgende dag, inenting een positieve kolonie in vijf milliliter van LB media met 100 microgram per milliliter kanamycine.Incubeer in de 37 graden centigrees schudden incubator op 120 rpm voor twee uur. Voeg vervolgens de inductor lactose toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,5 millimole per liter en blijf zes uur schudden, waardoor EGFP-expressie wordt ingeleid. Empirisch, bij het schudden van zes uur, kan de OD600 bereiken 0,7 of hoger.Ten slotte, met behulp van fluorescentie microscoop om de omvang van EGFP uitdrukken te verifiëren. Voeg 10 microliter van het bacteriemedium toe aan een dia. Dek af met een cover slip.Bestudeer de expressie van EGFP onder de fluorescentiemicroscoop. Voeg 3,5 gram thioglycollate toe in 100 milliliter gedestilleerd water. Steriliseren in autoclave voor gebruik.Aspirate de thioglycollate medium in de een milliliter steriele spuit in de kap. Een muis per spuit om de infectie te voorkomen. Injecteer een milliliter van 3,5% thioglycollate medium in de buikholte van de muis met behulp van een 23-gauge naald en onderhoud de muis met water en voedsel ad libitum gedurende drie dagen.Na drie dagen, euthanaseren de muis door cervicale dislocatie na snel induceren anesthesie door sevoflurane in een gesloten doos. Doe vervolgens de muis in een schaal met 75% ethanol te steriel en snel over te brengen in de kap. Plaats de muis op de plaat en speld de voorpoot op het bord om de muispositie te bevestigen.Met behulp van een vijf-milliliter spuit met een 20-gauge naald, injecteren vijf milliliter koude PBS op de onderbuik in de muis peritoneale holte, het vermijden van puncturing de darm. Voer een zachte massage uit aan twee zijden van de muisbuik. Dan aspirate de buikvloeistof zachtjes en langzaam.Doe de buikvloeistof in een centrifugebuis van 50 milliliter. Herhaal deze stappen twee of drie keer. Centrifugeren de zwevende cellen gedurende 10 minuten bij 400 g in vier tot acht centigrade.Gooi de supernatant weg en verhoog de celpellet opnieuw in RPMI 1640 medium met 10% foetale runderserum. Voeg vijf miljoen cellen in elke put van de zes-put plaat voor de stroom cytometrie test en 500, 000 cellen per goed in een 24-put plaat voor fluorescentie microscoop. Kweek de cellen op 37 graden centigrees in een 5%koolstofdioxide incubator 's nachts.Het kweekmedium kan na drie uur worden vernieuwd om niet-loodzware cellen te verwijderen omdat de meeste van deze lymfocyten waren. Observeer de cellen onder een heldere veldmicroscoop om de levensvatbaarheid van de cel en de celdichtheid te evalueren. De hier getoonde afbeelding was in normale staat van de primaire cel.Meestal was de macrofaagceldichtheid niet hoog, omdat een groot deel van de buikcellen lymfocyten was. Verwijder het kweekmedium van de 24-put plaat. Voeg 100 microliter vers kweekmedium en 10 microliter van bacterieel medium toe.Dan incubeer de plaat op 37 graden centigrees in een 5%koolstofdioxide incubator voor een uur. Was voorzichtig met 500 microliter koude PBS per put drie tot vijf keer uit te wassen niet-geïnternaliseerde bacteriën. Incubeer de cellen met 4% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Was de cellen drie keer met PBS. Voeg phalloïden 633 conjugaat werkoplossing toe aan vlek F-actin. Bewaar op een donkere, vochtige plaats bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.Voeg dapi-werkoplossing toe om de celkern te bevlekken en vijf minuten in te broeden op een donkere plaats bij kamertemperatuur. Spoel één keer met PBS en eenmaal met hetzelfde volume in gedestilleerd water. De EGFP-uitdrukkende E.coli in het groen diende als marker van fagocytose.Als u experimentele fouten wilt minimaliseren en de resultaten een goede interpretatie wilt geven, stelt u groepen en controlebuizen in voor het experiment zoals vermeld in tabel 2. Voor de controlegroep die op het ijs wordt geplaatst, verwijder het medium van de zes-put plaat en was met PBS een keer. Voeg vervolgens 70 millimole per liter koude EDTA een milliliter in de put om de cellen los te maken en over te dragen in de stroom cytometrie buis.Voeg 50 microliter bacteriële suspensie toe aan de buis en leg deze een uur lang op het ijs. Voor de andere groepen, verwijder de cultuur medium, voeg een milliliter vers medium in elke put. Voeg 50 microliter bacteriën suspensie toe aan de putten volgens de groepsinstelling zoals beschreven in tabel twee.Plaats vervolgens de zes-put plaat in de 37 graden centigrees 5%kooldioxide incubator voor een uur. Om de fluorescentie van niet-geïnternaliseerde E.coli te doven, voeg 200 microliter van 0,8% kristal violet water oplossing in de put en zwaaien binnenkort. Deze stap was bedoeld om vals positief resultaat van de EFP E.coli binding aan het oppervlak van de macrofagen te voorkomen, maar niet geïnternaliseerd.Was de cellen met PBS drie keer om eventuele resterende kristal violet te verwijderen. Voeg vervolgens 70 millimole per liter koude EDTA een milliliter in de put om de cellen los te maken en over te dragen in de stroom cytometrie buis. Centrifuge de buizen 2.000 rpm vijf minuten en gooi de supernatant.Voeg 100 microliter PBS toe om de cellen opnieuw op te maken. Voeg vijf microliter van F4 ATP geconjugeerd antilichaam in de buizen of isotype volgens de groepsinstelling. Vortex kort en incubeer de monsters op ijs gedurende vijf tot 10 minuten in het donker.Voeg een milliliter PBS in elke buis en centrifuge 2, 000 rpm vijf minuten. Gooi de supernatant weg. Resuspend de celpellets met 200 tot 300 microliter PBS voor flow cytometrie analyse.Voer elke buis uit en verwerf gegevens voor ten minste 10.000 gebeurtenissen van F4/80-positieve cellen. Hier zijn de fluorescentie beelden van buikvliesmacrofagen van de jonge en oudere groepen. De rode fluorescentie vertegenwoordigt F-actine.Het groen staat voor EGFP-uitdrukkende E.coli, en de blauwe vertegenwoordigt kern gekleurd door DAPI. Deze beelden suggereren dat macrofagen van de jonge muis een sterker fagocytisch vermogen hadden dan die van de oude muis. De F4/80-positieve en EGFP-positieve cellen wezen op het fagocytische vermogen van de macrofagen.Deze resultaten komen overeen met de trend van fluorescentie microscoop resultaten. Hoewel het aantal aangeboren immuuncellen kan behouden blijven in de oude muis, is het fagocytische vermogen aanzienlijk afgenomen in vergelijking met de jonge muis. Veel methoden zijn gebruikt om macrofaagfencytose te beoordelen.Hier tonen we een verbeterde methode die handig, snel en economisch haalbaar is. Met EGFP-uitdrukkende E.coli kan een fagocytosetest gemakkelijk worden uitgevoerd en gemeten door zowel flow cytometer als fluorescerende microscoop volgens de voorkeur van de onderzoeker. Ook meet deze methode direct de fagocytische capaciteit.De resultaten zijn reproduceerbaarder dan andere indirecte methoden.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolatie van Mouse buikholte Cellen

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model van Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infectie in de Neonatale Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrofagen Cholesterol Uitputting en het effect daarvan op de Fagocytose van<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Een stap Negatieve Chromatografische zuivering van<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofiel-activerend eiwit overexpressie in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In Batchmodus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpressie en zuivering van het menselijk<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Beoordeling van antilichaam gebaseerde Drugs gevolgen voor lymfkliertest beenmerg en peritoneale Macrophage activering

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Een Facile Protocol voor het genereren van Site-Specifically geacetyleerd eiwitten in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...