Name: using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00
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Die National Natural Science Foundation of China (Nr. 31800046) und der naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Liaoning (Nr. 20170540262) unterstützt diese Arbeit. Diese Arbeit wurde in den Labors der Scientific Research Center an der zweiten Hospital der Dalian Medical University durchgeführt. Die Autoren möchten danke Xiao Lin Sang für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Bo Qu und Dong-Chuan Yang für ihre Unterstützung bei der Erstellung des Videos.

Alle Verfahren wurden unter den nationalen Instituten der Gesundheitsrichtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, und die Protokolle vom Animal Care und Nutzung Ausschuss der Dalian Medical University angenommen wurden. 16-Monate-alten (mit einem Körpergewicht von 30-35 g) und acht-Woche-alten (20-25 g) SPF (spezifische-Pathogen-freies) männliche C57BL/6 Mäusen stammen aus der SPF Tiere Mitte der Dalian Medical University. Alle Mäuse wurden in Tierhaltung mit Zugang zu Nahrung und Wasser ...

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	<li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation.">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).</li><li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis:+multiple+abnormalities,+heterogeneous+responses,+and+evolving+understanding.">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li><li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients:+from+epidemiology+to+evidence-based+management.">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li><li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria.">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance.">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li><li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation.">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils.">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li><li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles(R)+by+granulocytes+in+multiple+species.">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization.">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).</li></ol>

Die Schritte in diesem Protokoll sind ganz einfach und unkompliziert. Die entscheidenden Schritte gehört, EGFP Ausdruck auf E. Colizu induzieren. In der Regel, wenn ein Gen von Eukaryoten, wie EGFP, in Prokaryoten wie E. Colizum Ausdruck bringen soll, besteht die Gefahr, dass das Protein inaktiv Aggregate (Einschlusskörperchen), bildet die native Struktur und Aktivität des Proteins verändert. Durch die Verwendung des Haustier-SUMO-Vektors und Bau das Haustier-SUMO-EGFP-Plasmid, EGFP-SUMO-Fusionsprot...

Makrophagen Phagozytose Assays werden häufig verwendet, um die angeborene immune Funktion zu studieren. Die angeborene Immunantwort kann Anfälligkeit zur Infektion hindeuten. Makrophagen-Zelllinien sind weit verbreitet in Immunologie Studien. Jedoch kann die längere Passage Genverlust und Immunfunktionen in diesen Zelllinien in Frage gestellt. So sind die primären peritonealen Makrophagen das ideale Objekt, um die Zelle Funktion1zu studieren.
Obwohl die angeborene Immunantwort im gealterten Körper intakt zu sein gedacht war, kann die phagocytic Fähigkeit im Vergleich zu verringern, dass in den jüngeren2,3 Körper. Hier zeigen wir eine Methode zur Bestimmung der Phagozytose von peritonealen Makrophagen von jung (acht-Woche-alten) und Alter (16-Monate-alten) Maus mit EGFP exprimierenden E. Coli, die bequem, schnell und wirtschaftlich machbar ist.
Die Verwendung von einem EGFP exprimierenden E. Coli -Stamm ist einer der Vorteile des Assays weil diese Bakterien stabil sind und zeigen eine starke Fluoreszenz-Signal, auch nach der Makrophagen durch 4 % (w/V) Paraformaldehyd fixiert sind. Darüber hinaus durch die Verwendung der EGFP exprimierenden E. Coli, Forscher müssen nicht weiter Färbung nach Phagozytose, was Zeit spart. Darüber hinaus sind Makrophagen Immunoresponsive für E. Coli Oberflächenantigen, so dass E. Coli für die Phagozytose-Assay als mit EGFP exprimierenden Pilze oder Fluorescein-markierten Perlen.
Mit EGFP exprimierenden E. Coliein Phagozytose-Assay problemlos in 2 h erreicht und durch beide Flow Cytometry und Fluoreszenz-Mikroskopie, je nach Zweck des Forschers gemessen. Da diese Methode direkt die phagocytic Fähigkeit misst, sind die Ergebnisse mehr als andere indirekte Methoden reproduzierbar.
Diese Methode wurde auch in einer RAW264.7 Zelllinie validiert und Menschenblut peripheren mononukleären Zellen4. Der folgende Text bietet detaillierte schrittweisen Anleitungen für die Durchführung dieses Assays und unterstreicht die entscheidenden Schritte, die die Forscher ändern können, um die Bedürfnisse ihrer Experimente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:886px;" width="887">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:417px;">BD FACSCanto II Flow cytometer</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat101303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Champion pET SUMO Protein Expression system</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Custom Gene Synthesis Service</td>
			<td style="width:176px;">Takara Biotech.</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">DAPI(4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat123110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Leica DMI3000 B&#160; Inverted Microscope</td>
			<td style="width:176px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">PE Rat IgG2a, &#954;-isotype control</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat400507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:417px;">Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution</td>
			<td style="width:176px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:123px;">Cat23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Thioglycollate medium</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T9032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache und reproduzierbare Methode um eine Phagozytose-Test durchzuführen. Der erste Teil dieser Methode beinhaltet den Aufbau eines Haustier-SUMO-EGFP-Vektors (SUMO = kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikator ") und mit dem Ausdruck grüne Fluoreszenz Protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE) erweitert. EGFP exprimierenden E. Coli ist mit Makrophagen für 1 h bei 37 ° C coincubated; die negative Kontrollgruppe wird für die gleiche Menge an Zeit auf Eis inkubiert. Dann sind die Makrophagen für die Bewertung bereit. Die Vorteile dieser Technik sind seine einfache und unkomplizierte Schritte und Phagozytose durch beide Flow Cytometer und Fluoreszenz-Mikroskop gemessen werden. EGFP exprimierenden E. Coli sind stabil und eine starke Fluoreszenz-Signal angezeigt, auch nachdem die Makrophagen mit Paraformaldehyd fixiert sind. Diese Methode ist nicht nur geeignet für die Beurteilung der Makrophagen-Zelllinien oder primären Makrophagen in Vitro, aber auch geeignet für die Bewertung von Granulozyten und Monocyte Phagozytose in peripheren mononukleären Blutzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die phagocytic Fähigkeit der peritonealen Makrophagen von jungen Mäusen (acht-Woche-alten) höher als die von Makrophagen aus Alter (16-Monate-alten) Mäuse. Zusammenfassend lässt sich sagen diese Methode misst Makrophagen Phagozytose und eignet sich für die Untersuchung der Funktion des angeborenen Immunsystems.

Der Haustier-SUMO-Vektor nutzt eine kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikator "um die Expression von nativen Proteinen in E. Colizu ermöglichen. SUMO-Fusion kann erheblich verbessern die EGFP Löslichkeit, so dass sie leicht erkannt werden. Wenn der Ausdruck EGFP erfolgreich durch Laktose induziert wird, können grüne Kolonien im Dunkeln (Abbildung 1A) beobachtet werden. Grüne Punkte, die EGFP exprimierenden E. Colidarstellen, können unter ...

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Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose mit verstärkten grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden Escherichia colizu beurteilen.

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Dieses Protokoll zeigte eine einfache und produzierbare Methode zur Beurteilung der Phagozytosefähigkeit von Makrophagen mit EGFP-exekomsochierender Escherichia coli. Hallo, mein Name ist Jun-Yu vom Zweiten Krankenhaus der Dalian Medical University. Heute werden wir Ihnen eine einfache zeigen und visualisieren die Art und Weise, Makrophage Phagozytose zu bewerten, die leicht innerhalb von zwei Stunden getan werden kann.Diese Methode wurde häufig in der Studie der angeborenen Immunfunktion verwendet. Es wird angenommen, dass angeborene Immunfunktion bei älteren Menschen intakt blieb. Heute werden wir also die peritonealen Makrophagen von den alten und jungen Mäusen isolieren und die phagozytische Fähigkeit dieser beiden Gruppen sehen.Nun, lassen Sie uns beginnen. Erstens, synthetisieren Sie das EGFP-Genfragment und klonen Sie das Fragment mit High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase. Dann ligate das PCR-Produkt in den pET SUMO-Vektor.Drittens: Umwandlung der Ligationsprodukte in den E.coli-Stamm und Induzieren EGFP-Exzess mit Laktose. Diese EGFP-exemitzenden E.coli dienten als Marker für den Phagozytose-Assay. Als nächstes wurden eine MausperitoneumMakrophagen isoliert und kultiviert.Dann wurden EGFP-exezierende E.coli mit den Makrophagen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius geprägt. Nach dem Löschschritt waren die Makrophagen sowohl mit dem Fluoreszenzmikroskop als auch mit dem Durchflusszytometer zur Bewertung bereit. Synthetisieren Sie das EGFP-Genfragment und verstärken Sie das Fragment mit einer Vorwärts- und Reverse-Primer mit High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase.Um sicherzustellen, dass die PCR-Produkte im nächsten Schritt über einzelne Drei-End-Adeninüberhänge für das TA-Klonen verfügen, wird eine 30-minütige Verlängerung bei 72 Grad Celsius nach dem letzten Zyklus empfohlen. Überprüfen Sie das PCR-Produkt durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Wenn das Fragment richtig verstärkt wurde, kann ein 717 bp Band auf dem Gel beobachtet werden.Klonen Sie das PCR-Produkt in den pET SUMO-Vektor mit der TA-Klonmethode mit T4-DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Fügen Sie fünf Mikroliter PCR-Produkt in 100 Mikroliter BL21 kompetente Zellen.Hitze schockieren die Zellen bei 42 Grad Zenigre für 90 Sekunden, dann halten Sie die Mischung auf Eis für drei Minuten. Fügen Sie 400 Mikroliter LB Medium, vorgewärmt bei 37 Grad Celsius. Schütteln eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 120 Rpm.Impfen Sie die Bakterien auf die Oberfläche der LB-Platte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin, um den vektortransformierten E.coli zu untersuchen. Inkubieren Sie die Platte im 37 Grad Centigrees Ofen über Nacht. Am nächsten Tag impfen Sie eine positive Kolonie in fünf Milliliter LB-Medien mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin.Inkubieren Sie im 37 Grad Zentigraner Schütteltinkubator bei 120 Rpm für zwei Stunden. Dann fügen Sie den Induktor Lactose zu einer endlichen Konzentration von 0,5 Millimole pro Liter und weiterhin sechs Stunden schütteln, was EGFP-Expression induziert. Empirisch kann der OD600 beim Schütteln sechs Stunden 0,7 oder höher erreichen.Schließlich mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops, um das Ausmaß der EGFP-Exzesszugung zu überprüfen. 10 Mikroliter des Bakteriellen Kulturmediums zu einer Folie hinzufügen. Dann mit einem Deckelzettel abdecken.Untersuchen Sie die Expression von EGFP unter dem Fluoreszenzmikroskop. 3,5 Gramm Thioglycolat in 100 Milliliter destilliertes Wasser geben. Sterilisieren Sie im Autoklaven vor der Verwendung.Das Thioglycolatmedium in die ein Milliliter sterile Spritze in der Haube aspirieren. Eine Maus pro Spritze, um die Infektion zu vermeiden. Injizieren Sie einen Milliliter 3,5% Thioglycolatmedium in die Peritonealhöhle der Maus mit einer 23-Spur-Nadel und halten Sie die Maus mit Wasser und Nahrung ad libitum für drei Tage.Nach drei Tagen, euthanisieren Sie die Maus durch Zervixdislokation nach schnell induzieren Anästhesie durch Sevofluran in einem geschlossenen Kasten. Dann legen Sie die Maus in eine Schüssel mit 75% Ethanol steril und schnell in die Haube übertragen. Legen Sie die Maus auf die Platte und heften Sie die Vorderpfote auf das Brett, um die Mausposition zu fixieren.Mit einer Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 20-Spur-Nadel, injizieren Fünf Milliliter kalte PBS am unteren Bauch in die Peritonealhöhle der Maus, um zu vermeiden, den Darm zu durchdringen. Führen Sie eine sanfte Massage auf zwei Seiten des Mausbauchs durch. Dann die Bauchflüssigkeit sanft und langsam ansaugen.Geben Sie die Peritonealflüssigkeit in ein 50-Milliliter-Zenrichreöhre. Wiederholen Sie diese Schritte zwei- oder dreimal. Zentrifugieren Sie die suspendierten Zellen für 10 Minuten bei 400 g in vier bis acht Grad Celsius.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in RPMI 1640 medium mit 10% fetalem Rinderserum wieder auf. Fügen Sie fünf Millionen Zellen in jeden Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte für den Durchflusszytometrie-Assay und 500.000 Zellen pro Well in eine 24-Well-Platte für das Fluoreszenzmikroskop ein. Kultur die Zellen bei 37 Grad Zenigrees in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht.Das Kulturmedium kann nach drei Stunden erfrischt werden, um nicht haftende Zellen zu entfernen, da die meisten davon Lymphozyten waren. Beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtfeldmikroskop, um die Zelllebensfähigkeit und Zelldichte zu bewerten. Das hier gezeigte Bild befand sich im normalen Zustand der Primärzelle.Normalerweise war die Makrophagenzelldichte nicht hoch, da ein Großteil der Peritonealzellen Lymphozyten waren. Entfernen Sie das Kulturmedium von der 24-Well-Platte. Fügen Sie 100 Mikroliter frisches Kulturmedium und 10 Mikroliter bakterielles Medium hinzu.Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Zenigrees in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für eine Stunde. Mit 500 Mikroliter kaltem PBS pro Brunnen drei- bis fünfmal sanft waschen, um nicht-internalisierte Bakterien auszuwaschen. Inkubieren Sie die Zellen mit 4%Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Phalloidin 633 konjugieren arbeitslösung hinzufügen, um F-Actin zu färben. 60 Minuten an einem dunklen, feuchten Ort bei Raumtemperatur aufbewahren.Fügen Sie die DAPI-Arbeitslösung hinzu, um die Zelle kernnuklear zu färben und fünf Minuten lang an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur zu brüten. Einmal mit PBS und einmal mit der gleichen Menge in destilliertem Wasser abspülen. Die EGFP-exemitende E.coli in grün dargestellt diente als Marker der Phagozytose.Um experimentelle Fehler zu minimieren und die Ergebnisse richtig zu interpretieren, legen Sie Gruppen und Steuerrohre für das Experiment fest, wie in Tabelle 2 aufgeführt. Für die Kontrollgruppe, die auf das Eis gelegt wird, entfernen Sie das Medium von der Sechs-Brunnen-Platte und waschen Sie es einmal mit PBS. Dann fügen Sie 70 Millimole pro Liter kalte EDTA einen Milliliter in den Brunnen, um die Zellen zu lösen und in den Durchfluss Zytometrierohr übertragen.50 Mikroliter bakterielle Suspension in die Röhre geben und eine Stunde lang auf das Eis legen. Für die anderen Gruppen, entfernen Sie das Kulturmedium, fügen Sie jeweils einen Milliliter frisches Medium in jeden Brunnen. Fügen Sie 50 Mikroliter Bakteriensuspension in die Brunnen nach der Gruppeneinstellung, wie in Tabelle 2 beschrieben.Dann legen Sie die Sechs-Well-Platte in den 37 Grad Zentiären 5% Kohlendioxid-Inkubator für eine Stunde. Um die Fluoreszenz von nicht-internalisiertem E.coli zu löschen, fügen Sie 200 Mikroliter 0,8% kristallviolette Wasserlösung in den Brunnen und schwanken sie kurz. Dieser Schritt zielte darauf ab, falsch positive Ergebnisse durch die EGFP E.coli Bindung an die Oberfläche der Makrophagen zu vermeiden, aber nicht internalisiert.Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um Restkristallviolett zu entfernen. Dann fügen Sie 70 Millimole pro Liter kalte EDTA einen Milliliter in den Brunnen, um die Zellen zu lösen und in den Durchfluss Zytometrierohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Rohre 2.000 U/min fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand.Fügen Sie 100 Mikroliter PBS hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen. Fügen Sie fünf Mikroliter F4 ATP konjugierten Antikörper in die Rohre oder Isotyp entsprechend der Gruppeneinstellung. Wirbel kurz und inkubieren die Proben auf Eis für fünf bis zehn Minuten im Dunkeln.Fügen Sie eine Milliliter PBS in jedes Rohr und Zentrifuge 2 000 U/min fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellpellets mit 200 bis 300 Mikroliter PBS für die Durchflusszytometrieanalyse wieder aus.Führen Sie jede Röhre aus und erfassen Sie Daten für mindestens 10.000 Ereignisse von F4/80-positiven Zellen. Hier sind die Fluoreszenzbilder von peritonealen Makrophagen aus jungen und älteren Gruppen. Die rote Fluoreszenz steht für F-Actin.Das Grün steht für EGFP-exemittierte E.coli, und das Blau steht für den von DAPI gebeizten Kern. Diese Bilder deuten darauf hin, dass Makrophagen der jungen Maus eine stärkere phagozytische Fähigkeit hatten als die von der gealterten Maus. Die F4/80-positiven und EGFP-positiven Zellen zeigten die phagozytische Fähigkeit der Makrophagen an.Diese Ergebnisse stimmen mit dem Trend der Fluoreszenzmikroskop-Ergebnisse überein. Nun, Sie sehen, obwohl die Anzahl der angeborenen Immunzellen bei alter Maus erhalten bleiben kann, verringerte sich die phagozytische Fähigkeit signifikant im Vergleich zur jungen Maus. Viele Methoden wurden verwendet, um Makrophagenphagozytose zu bewerten.Hier zeigen wir eine verbesserte Methode, die bequem, schnell und wirtschaftlich machbar ist. Mit EGFP-exezierendem E.coli kann ein Phagozytose-Assay leicht mit durchFlusszytometer und Fluoreszenzmikroskop nach den Vorlieben des Forschers durchgeführt und gemessen werden. Auch diese Methode misst direkt die phagozytische Fähigkeit.Die Ergebnisse sind reproduzierbarer als andere indirekte Methoden.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion in der neonatalen Ratten

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

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Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Im Batch-Modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

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Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Eine einfache Protokoll ortspezifisch generieren acetyliert Proteine in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...