Name: using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis at JoVE.com

את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מספר 31800046) את מדעי הטבע קרן של ליאונינג (מספר 20170540262) תמיכה עבודה זו. העבודה הזו הושלמה במעבדות של המרכז לחקר מדעי באוניברסיטה השני בבית החולים של דאליאן רפואי. המחברים רוצה להודות שאו-לין סאנג עבור שלה בסיוע cytometry זרימה, ואת Qu בו יאנג דונג-צ'ואן לסיוע שלהם בהפקת הוידאו.

כל ההליכים היו מבוצעים תחת מוסדות לאומיים של בריאות הנחיות טיפול, שימוש של חיות מעבדה, הפרוטוקולים אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של דאליאן האוניברסיטה הרפואית. 16 בן חודש (עם משקל הגוף של 30-35 גר'), בת שבוע-שמונה עכברים C57BL/6 (ספציפי פתוגן-חינם) גברים (20-25 גרם) SPF התקבלו ממרכז SPF בעלי חיי...

<ol>
	<li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation.">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).</li><li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis:+multiple+abnormalities,+heterogeneous+responses,+and+evolving+understanding.">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li><li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients:+from+epidemiology+to+evidence-based+management.">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li><li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria.">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance.">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li><li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation.">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils.">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li><li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles(R)+by+granulocytes+in+multiple+species.">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization.">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).</li></ol>

השלבים של פרוטוקול זה הם די פשוטה וישירה. אחד השלבים הקריטיים הוא לגרום EGFP ביטוי ב e. coli. בדרך כלל, כאשר הגן של פרוקריוטים, כמו EGFP, מתוכנן לבטא באופן אאוקריוטים כמו e. coli, יש סיכון כי החלבון טופס לא פעיל אגרגטים (הכללה גופים), אשר משנה את הפעילות ומבנה מקורית של החלבון. באמצעות וקטור pET-?...

מקרופאג phagocytosis מבחני משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את תפקוד מערכת החיסון המולדת. התגובה החיסונית מולדת עשוי להצביע על הרגישות לזיהום. קווי macrophage התא נמצאים בשימוש נרחב במחקרים אימונולוגיה. אולם, מעבר מורחב עלול לגרום אובדן הגן, נחשף פונקציות החיסונית בשורות תאים אלו. כך, המקרופאגים הצפק העיקרי הם האובייקט האידיאלי שבו ללמוד את תפקוד התא1.
למרות התגובה החיסונית מולדת נחשב להיות שלמים בגוף בגילאי, היכולת phagocytic עשויה להקטין בהשוואה לכי בהצעיר הגוף2,3. כאן, אנו נדגים שיטה כדי להעריך את phagocytosis של מקרופאגים הצפק יאנג (8-בת שבוע) ועכבר יישון (חודש בן 16) באמצעות הבעת EGFP e. coli, וזה נוח, מהיר, כדאיות כלכלית.
השימוש של זן לבטא EGFP e. coli הוא אחד היתרונות של זה וזמינותו כי חיידקים אלה יציבים ולהציג אות חזק פלורסצנטיות, גם לאחר מקרופאגים נפתרות על-ידי paraformaldehyde 4% (w/v). בנוסף, באמצעות הבעת EGFP e. coli, החוקרים לא צריך מכתים נוסף לאחר phagocytosis, אשר חוסך זמן. יתר על כן, המקרופאגים הם immunoresponsive עבור e. coli האנטיגנים, עושה e. coli יותר מתאים וזמינותו phagocytosis מאשר את הבעת-EGFP פטריות או חרוזים התווית על-ידי fluorescein.
עם הבעת EGFP e. coli, וזמינותו phagocytosis יכול להיות בקלות הושלמה ב 2 h, נמדדת בשני לזרום cytometry, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, בהתאם למטרה של החוקר. מאז בשיטה זו ישירות מודד את היכולת phagocytic, התוצאות הן יותר לשחזור מאשר שיטות עקיפות אחרות.
שיטה זו אומתה גם בקו תא RAW264.7, דם היקפיים אנושי תאי תאי4. הטקסט שלהלן מספקת את הוראות מפורטות לביצוע הזה assay, מדגיש את השלבים הקריטיים החוקרים שעשויה לשנות כדי לענות על הצרכים של הניסויים שלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:886px;" width="887">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:417px;">BD FACSCanto II Flow cytometer</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat101303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Champion pET SUMO Protein Expression system</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Custom Gene Synthesis Service</td>
			<td style="width:176px;">Takara Biotech.</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">DAPI(4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat123110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Leica DMI3000 B&#160; Inverted Microscope</td>
			<td style="width:176px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">PE Rat IgG2a, &#954;-isotype control</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat400507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:417px;">Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution</td>
			<td style="width:176px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:123px;">Cat23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Thioglycollate medium</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T9032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה לשחזור כדי לבצע וזמינותו של phagocytosis. החלק הראשון של שיטה זו כרוכה בניין וקטור pET-סומו-EGFP (סומו = צירוף קטן דמוי אוביקוויטין) לבטא משופרת חלבון פלורסצנטיות ירוק (EGFP) ב- Escherichia coli (BL21DE). ביטוי EGFP e. coli הוא coincubated עם מקרופאגים עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס; קבוצת הביקורת השלילית מודגרת בקרח עבור אותה כמות של זמן. . אז, המקרופאגים מוכנים להערכה. היתרונות של טכניקה זו כוללים את הצעדים שלו פשוט וברור, phagocytosis נמדד על ידי שני זרימה cytometer, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. הבעת-EGFP e. coli יציבים ולהציג אות פלורסצנטיות חזק גם לאחר המקרופאגים קבועים עם paraformaldehyde. שיטה זו היא לא רק מתאים ההערכה של קווי macrophage התא או מקרופאגים הראשית in vitro לקשרי אבל מתאים גם הערכת phagocytosis גרנולוציט, מונוציט בתאי תאי דם היקפיים. התוצאות מציגות כי היכולת phagocytic של מקרופאגים הצפק של עכברים צעירים (8-בת שבוע) הוא גבוה מזה של מקרופאגים מ בגילאי עכברים (חודש בן 16). לסיכום, שיטה זו מודדת מקרופאג phagocytosis ומתאים ללמוד את פונקציית מערכת החיסון המולדת.

הווקטור pET-סומו מנצל צירוף אוביקוויטין דמויי קטנים כדי לאפשר הביטוי של חלבונים מקורית e. coli. סומו פיוז'ן יכול לשפר באופן משמעותי את המסיסות EGFP, ומאפשרת לזהות בקלות. אם הביטוי EGFP בהצלחה הנגרמת על ידי לקטוז, מושבות ירוק יכול להיות שנצפו בחושך (איור 1 א'). נק...

Watch this Scientific Journal Video about Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis at JoVE.com

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק phagocytosis שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia coli.

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

פרוטוקול זה הדגים שיטה פשוטה ו producible להעריך את יכולת phagocytosis של מקרופאגים באמצעות EGFP-מבטא Escherichia coli. שלום, שמי ג'ון-יו מבית החולים השני של האוניברסיטה הרפואית של דאליאן. היום אנחנו הולכים להראות לך קל לדמיין את הדרך להעריך phagocytosis מקרופאג אשר ניתן לעשות בקלות בתוך שעתיים.שיטה זו הייתה בשימוש נרחב בחקר תפקוד מערכת החיסון המולדת. הוא האמין כי תפקוד חיסוני המולד נשאר שלם אצל קשישים. אז היום אנחנו הולכים לבודד את המקרופאגים הפניטון מהעכברים הצעירים והמבוגרים ולראות את היכולת הפוגוציטית של שתי הקבוצות האלה.ובכן, בואו נתחיל. ראשית, לסנתז את שבר הגן EGFP ולשכפל את השבר באמצעות פולימראז DNA Taq נאמנות גבוהה. לאחר מכן לצרף את מוצר PCR לתוך וקטור סומו PET.שלישית, להפוך את מוצרי קשירה לתוך זן E.coli ולזרז EGFP הבעה עם לקטוז. E.coli מבטאים EGFP אלה שימשו כסמן לבדיקת הפאגוציטוזיס. לאחר מכן, מקרופאגים של צפאגים של עכברים היו מבודדים ותרבותים.לאחר מכן, E.coli מבטא EGFP היו coincubated עם מקרופאגים במשך שעה אחת ב 37 מעלות סנטימטרים. לאחר שלב המיתון, המקרופאגים היו מוכנים להערכה הן על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והן על ידי ציטומטר זרימה. לסנתז את שבר הגן EGFP ולהעצים את השבר עם פריימרים קדימה ואחורי באמצעות פולימראז DNA Taq נאמנות גבוהה.כדי להבטיח כי מוצרי PCR היו אחד שלושה קצה אדנין overhangs עבור שיבוט ת"א בשלב הבא, הרחבה של 30 דקות ב 72 מעלות centigrees לאחר המחזור האחרון מומלץ. בדוק את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. אם השבר הוגבר כראוי, ניתן לראות רצועת 717 bp על הג'ל.לשכפל את המוצר PCR לתוך וקטור סומו PET באמצעות שיטת שיבוט ת"א עם קשירה DNA T4. הדגירה את התגובה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. הוסף חמישה מיקרוליטר של מוצר PCR לתוך 100 מיקרוליטר של תאים מוסמכים BL21.החום מזעזע את התאים ב-42 מעלות במשך 90 שניות, ואז שומר את התערובת על הקרח למשך שלוש דקות. הוסף 400 מיקרוליטר של LB בינוני, שחומם מראש ב 37 מעלות centigrees. רועד שעה ב 37 מעלות צל"ש ו 120 סל"ד.לחסן את החיידקים על פני השטח של צלחת LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin כדי לסנן את וקטור טרנספורמציה E.coli. דגירה את הצלחת בתנור 37 מעלות צלסינרים לילה. ביום שלמחר, לחסן מושבה חיובית לחמישה מיליליטר של מדיה LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin.אינקובט בסנטיגרנים של 37 מעלות רועד אינקובטור ב 120 סל"ד במשך שעתיים. לאחר מכן מוסיפים את הלקטוז המושרה לריכוז סופי של 0.5 מילימול לליטר וממשיכים לרעוד שש שעות, מה שגרם לביטוי EGFP. באופן אמפירי, כאשר רועדים שש שעות, OD600 עשוי להגיע 0.7 ומעלה.לבסוף, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את היקף ההבעה של EGFP. הוסף 10 מיקרוליטר של מדיום תרבות החיידקים לשקופית. ואז לכסות עם פתק כיסוי.בחן את הביטוי של EGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מוסיפים 3.5 גרם של תיוגליקולאט ל-100 מיליליטר מים מזוקקים. יש לעקר במקלה אוטומטית לפני השימוש.שאף את מדיום התיוגליקולאט למזרק הסטרילי של מיליליטר אחד בשכונה. עכבר אחד לכל מזרק כדי למנוע את הזיהום. להזריק מיליליטר אחד של 3.5% thioglycollate בינוני לתוך חלל הלידה העכבר באמצעות מחט 23-מד ולשמור על העכבר עם מים ומזון עד ליביטום במשך שלושה ימים.לאחר שלושה ימים, המתת את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר גרימת הרדמה במהירות על ידי sevoflurane בתיבה סגורה. לאחר מכן, לשים את העכבר לתוך צלחת עם 75% אתנול סטרילי ולהעביר לתוך מכסה המנוע במהירות. מניחים את העכבר על הצלחת ולהצמיד את הכף הקדמית על הלוח כדי לתקן את מיקום העכבר.באמצעות מזרק חמישה מיליליטר עם מחט 20-מד, להזריק חמישה מיליליטר של PBS קר בבטן התחתונה לתוך חלל הצפי של העכבר, הימנעות מנקב את המעי. בצע עיסוי עדין משני צידי הבטן של העכבר. ואז לשוגם את נוזל הבטן בעדינות ולאט.מחלקים את הנוזל צפק לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. חזור על שלבים אלה פעמיים או שלוש. צנטריפוגה התאים המושעים במשך 10 דקות ב 400 גרם בארבעה עד שמונה סנטימטרים.השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת התא במדיום RPMI 1640 עם סרום לב עוברי 10%. הוסף חמישה מיליון תאים לתוך כל באר של צלחת שש בארות עבור בדיקה cytometry זרימה ו 500, 000 תאים לתוך צלחת 24 באר עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תרבו את התאים ב-37 מעלות באינקובטור של 5%פחמן דו-חמצני בן לילה.מדיום התרבות ניתן לרענן לאחר שלוש שעות כדי להסיר תאים לא עקביים כי רוב אלה היו לימפוציטים. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להעריך את הכדאיות של התא ואת צפיפות התאים. התמונה המוצגת כאן הייתה במצב רגיל של התא הראשי.בדרך כלל, צפיפות תאי המקרופאג' לא הייתה גבוהה, מכיוון שחלק מרכזי של התאים הצפיוניים היה לימפוציטים. מוציאים את מדיום התרבות מהצלחת של 24 בארות. הוסף 100 מיקרוליטר של תרבות טרייה בינונית ו 10 microliter של מדיום חיידקי.ואז להידגר את הצלחת ב 37 מעלות צליגה ב 5% פחמן דו חמצני אינקובטור במשך שעה אחת. לשטוף בעדינות עם 500 microliter של PBS קר לגם שלוש עד חמש פעמים כדי לשטוף חיידקים שאינם הפנימו. הדגירה את התאים עם 4% פורמלדהיד ב PBS בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. הוסף פאלודין 633 תוסף פתרון עבודה כתם F-actin. יש לאחסן במקום חשוך ולח בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.הוסף פתרון עבודה DAPI כדי להכתים את התא גרעיני דגירה במשך חמש דקות במקום חשוך בטמפרטורת החדר. יש לשטוף פעם אחת עם PBS ופעם עם אותו נפח במים מזוקקים. ה- E.coli המבטא את EGFP המוצג בירוק שימש כסמן של phagocytosis.כדי למזער שגיאות ניסיוניות ולהפוך פרשנות נכונה של התוצאות, הגדר קבוצות וצינורות בקרה עבור הניסוי כמפורט בטבלה 2. עבור קבוצת הביקורת אשר יונח על הקרח, להסיר את המדיום מן הצלחת שש באר לשטוף עם PBS פעם אחת. לאחר מכן להוסיף 70 מילימול לליטר קר EDTA מיליליטר לתוך באר כדי לנתק את התאים ולהעביר לתוך צינור ציטומטריה זרימה.מוסיפים 50 מיקרוליטר של מתלה חיידקי לתוך הצינור ומ מניחים אותו על הקרח במשך שעה אחת. עבור הקבוצות האחרות, להסיר את מדיום התרבות, להוסיף מדיום טרי מיליליטר אחד לתוך כל באר. הוסף 50 microliter של השעיית חיידקים לתוך בארות על פי הגדרת הקבוצה כמתואר בטבלה 2.ואז למקם את הצלחת שש באר ב 37 מעלות centigrees 5% פחמן דו חמצני אינקובטור במשך שעה אחת. כדי להתרווה על הפלואורסצנטיות של E.coli שאינו מופנם, להוסיף 200 מיקרוליטר של 0.8% פתרון מים סגולים גבישיים לתוך הבאר ולהתנדנד בקרוב. שלב זה נועד למנוע תוצאה חיובית שגויה על ידי איגוד EGFP E.coli לפני השטח של מקרופאגים אך לא הופנם.לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר כל סגול גביש שיורית. לאחר מכן להוסיף 70 מילימול לליטר קר EDTA מיליליטר לתוך באר כדי לנתק את התאים ולהעביר לתוך צינור ציטומטריה זרימה. צנטריפוגה הצינורות 2, 000 סל"ד חמש דקות ולהשליך את supernatant.הוסף 100 מיקרוליטר של PBS כדי לעשות שימוש חוזר בתאים. הוסף חמישה microliter של F4 ATP הוסיף נוגדן לתוך הצינורות או isotype על פי הגדרת הקבוצה. מערבולת לזמן קצר להדגר את הדגימות על קרח במשך חמש עד 10 דקות בחושך.הוסף PBS מיליליטר אחד לתוך כל צינור צנטריפוגה 2, 000 סל"ד חמש דקות. השלך את העל-טבעי. תן שוב את כדורי התא עם 200 עד 300 מיקרוליטר של PBS לניתוח ציטומטריה זרימה.הפעל כל צינור ורכוש נתונים עבור לפחות 10,000 אירועים של תאים חיוביים F4/80. הנה תמונות פלואורסצנטיות של מקרופאגים צפורים מהקבוצות הצעירות וההתיישנות. הפלואורסצנטיות האדומה מייצגת את F-actin.הירוק מייצג E.coli מבטא EGFP, והכחול מייצג גרעין מוכתם על ידי DAPI. תמונות אלה מצביעות על כך שלמפאגים מהעכבר הצעיר הייתה יכולת phagocytic חזקה יותר מאלה של העכבר המזדקן. התאים החיוביים וה-EGFP החיוביים של F4/80 הצביעו על היכולת הפאגוציטית של המקרופאגים.תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם המגמה של תוצאות מיקרוסקופ פלואורסצנטיות. ובכן, אתה רואה, למרות שמספר תאי החיסון המולדים עשוי להישמר בעכבר מיושן, היכולת הפוגוציטית ירדה באופן משמעותי בהשוואה לעכבר הצעיר. שיטות רבות נעשה כדי להעריך מקרופאג phagocytosis.כאן אנו מדגימים שיטה משופרת נוחה, מהירה וישימה מבחינה כלכלית. עם EGFP-ביטוי E.coli, בדיקה phagocytosis ניתן לבצע בקלות ולמדוד על ידי ציטומטר זרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי על פי העדפות החוקר. גם שיטה זו מודדת ישירות את היכולת הphagocytic.התוצאות ניתנות לשחזור יותר משיטות עקיפות אחרות.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; זיהום בעכברוש הילודים

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; חלבון נויטרופילים-הפעלת ביתר<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; במצב אצווה

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

הערכה של נוגדן מבוססי תרופות השפעות על מח העצם מאתר והפעלה מקרופאג הצפק

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...