Name: using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis at JoVE.com

Bu eser desteklenen Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (no. 31800046) ve Liaoning Eyaleti doğal Bilim Vakfı (no. 20170540262). Bu eser, ikinci hastane Dalian Tıp Üniversitesi Bilimsel Araştırma Merkezi laboratuarlarında başarılı oldu. Yazarlar Xiao-Lin Sang akış sitometresi ile yardımını ve Bo Qu ve Dong-Chuan Yang video üretiminde onların yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm yordamları ulusal kurumları, sağlık kuralları altında bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının için yapıldı ve iletişim kurallarını hayvan bakım ve kullanım Komitesi Dalian Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aylık (vücut ağırlığı 30-35 g ile) on altı ve sekiz haftalık (20-25 g) SPF (özel-patojen-ücretsiz) erkek C57BL/6 fareler Dalian Tıp Üniversitesi SPF hayvan Merkezi'nden elde. Bütün fareler yiyecek ve su ad libitumiçin hayvan konut erişimli tutuldu. 20-...

<ol>
	<li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation.">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).</li><li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sepsis:+multiple+abnormalities,+heterogeneous+responses,+and+evolving+understanding.">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li><li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients:+from+epidemiology+to+evidence-based+management.">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li><li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria.">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li><li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+TA+cloning.">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance.">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li><li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation.">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li><li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils.">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li><li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles(R)+by+granulocytes+in+multiple+species.">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization.">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).</li></ol>

Bu iletişim kuralı adımda oldukça basit ve anlaşılır. Bir kritik adım E. coliEGFP ifade teşvik etmektir. Genellikle, bir gen Ökaryotlar, EGFP gibi gelen prokaryot E.coli olarak ifade etmek için planlanan tarihte protein'ın doğal yapısı ve faaliyet değişiklikleri protein etkin olmayan toplamları (dahil organları), oluşturacak bir risk olduğunu. Evde beslenen hayvan-SUMO vektör kullanarak ve evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP plazmid oluşturmak yoluyla, EGFP-SUMO füzyon protein başar?...

Makrofaj fagositoz deneyleri genellikle doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu incelemek için kullanılır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı enfeksiyon duyarlılık gösterebilir. Makrofaj hücre satırları İmmünoloji çalışmalarda yaygın olarak kullanılır. Ancak, genişletilmiş geçit gen kaybına neden olabilir ve bu hücre satırları bağışıklık fonksiyonlarında tehlikeye. Böylece, birincil periton makrofaj hücre işlevi1eğitim ideal nesneyi vardır.
Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı yaşlı gövdesine sağlam olduğu düşünülüyordu rağmen fagositik yeteneği ile karşılaştırıldığında daha genç içinde2,3vücut düşebilir. Burada, biz genç (sekiz-hafta-yaşlı) ve uygun, hızlı ve ekonomik olarak mümkün olan EGFP ifade E. coli, kullanarak (16-ay-yaşlı) yaşlı fare peritoneal makrofajlar fagositoz değerlendirmek için bir yöntem gösterecektir.
Çünkü bu bakterilerin stabildir ve sonra bile makrofajlar %4 (w/v) paraformaldehyde tarafından giderilen bir güçlü floresans sinyal görüntülemek bir EGFP ifade e.coli suşu kullanımı bu tahlil avantajlarından biridir. Ayrıca, E. coliEGFP ifade kullanarak, araştırmacılar gerek yok daha fazla zaman kazandırır fagositoz sonra boyama. Ayrıca, makrofajlar immunoresponsive E. coli yüzey antijeni, E. coli EGFP ifade mantarlar veya floresein etiketli boncuk kullanarak daha fagositoz tahlil için daha uygun yapmak için vardır.
EGFP ifade E. coliile fagositoz tahlil kolayca 2 h başarılı ve her iki akış sitometresi ve floresan mikroskopisi, araştırmacı amaca bağlı olarak tarafından ölçülür. Bu yöntem, doğrudan fagositik yeteneğini ölçer beri daha dolaylı diğer yöntemlerden daha tekrarlanabilir sonuçlarıdır.
Bu yöntem aynı zamanda bir RAW264.7 hücre kültürünü doğrulandı ve4insan periferik kan mononükleer hücreler. Aşağıdaki metin bu tahlil gerçekleştirmek için ayrıntılı adım adım yönergeler sağlar ve araştırmacılar deneyleri ihtiyaçlarını karşılamak üzere değiştirebilecek kritik adımlar vurgular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:886px;" width="887">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:417px;">BD FACSCanto II Flow cytometer</td>
			<td style="width:176px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat101303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Champion pET SUMO Protein Expression system</td>
			<td style="width:176px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">K300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Custom Gene Synthesis Service</td>
			<td style="width:176px;">Takara Biotech.</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">DAPI(4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:123px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat123110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Leica DMI3000 B&#160; Inverted Microscope</td>
			<td style="width:176px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">PE Rat IgG2a, &#954;-isotype control</td>
			<td style="width:176px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">Cat400507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:417px;">Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution</td>
			<td style="width:176px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:123px;">Cat23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:417px;">Thioglycollate medium</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T9032</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using enhanced green fluorescence protein-expressing escherichia coli to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis

Bu el yazması fagositoz tahlil gerçekleştirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklanır. Bu yöntem ilk bölümünde bir evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP vektör yapı içerir (SUMO küçük Ubikuitin benzeri değiştirici =) ve ifade gelişmiş yeşil floresans protein Escherichia coli (BL21DE) (EGFP). E. coli EGFP ifade ile makrofajlar 37 ° C'de 1 h için coincubated; negatif kontrol grubu aynı süre için buza inkübe. O zaman, makrofajlar değerlendirmesi için hazırsınız demektir. Bu teknik avantajları, basit ve kolay adımlar içerir ve fagositoz her iki akış sitometresi ve floresan mikroskop tarafından ölçülebilir. EGFP ifade E. coli stabildir ve sonra bile makrofajlar paraformaldehyde ile giderilen bir güçlü floresans sinyal görüntüler. Bu yöntem yalnızca makrofaj hücre hatları veya birincil makrofajlar in vitro olarak değerlendirilmesi için uygun ama ayrıca periferik kan mononükleer hücrelerinde granülosit ve monosit fagositoz değerlendirilmesi için uygun değildir. Sonuçları genç (sekiz-hafta-yaşlı) fareler gelen periton makrofajlar fagositik kapasitesini makrofajlar yaşında (16-ay-yaşlı) fareler dan daha yüksek olduğunu gösteriyor. Özet olarak, bu yöntem makrofaj fagositoz ölçer ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi işlevi çalışmak için uygundur.

Evde beslenen hayvan-SUMO vektör yerli protein ifade E. coliizin vermek için küçük bir Ubikuitin benzeri değiştirici kullanır. SUMO füzyon kolayca algılanabilmesini sağlayan EGFP çözünürlük önemli ölçüde artırılabilir. EGFP ifade başarıyla laktoz tarafından indüklenen, yeşil kolonileri karanlıkta (Şekil 1A) görülebilir. E. coliEGFP ifade temsil, yeşil noktalar 40 x objektif lens (Şekil 1B...

Watch this Scientific Journal Video about Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis at JoVE.com

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli

Burada, fare peritoneal makrofaj fagositoz gelişmiş yeşil floresans Escherichia coliprotein ifade kullanarak değerlendirmek için bir protokol mevcut.

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Bu protokol, EGFP ifade eden Escherichia coli kullanarak makrofajların fagositoz yeteneğini değerlendirmek için basit ve üredüzebilir bir yöntem göstermiştir. Merhaba, benim adım Dalian Tıp Üniversitesi'nden Jun-Yu. Bugün size kolay ve iki saat içinde kolayca yapılabilecek makrofaj fagositoz değerlendirmek için yol görselleştirmek için gidiyoruz.Bu yöntem doğuştan gelen immün fonksiyon çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır. Bu doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu yaşlılarda bozulmadan kaldı inanılmaktadır. Bugün, yaşlı ve genç farelerden periton makrofajlarını izole edeceğiz ve bu iki grubun fagositik yeteneğini göreceğiz.Hadi başlayalım. İlk olarak, EGFP gen parçasını sentezleyin ve yüksek sadakatli Taq DNA polimeraz kullanarak parçayı klonla. Daha sonra PCR ürünlerini pET SUMO vektörüne dönüştürün.Üçüncü olarak, e.coli suşu içine ligasyon ürünleri dönüştürmek ve laktoz ile ifade EGFP neden. Bu EGFP ifade E.coli fagositoz tofmu için belirteç olarak görev yaptı. Daha sonra, bir fare periton makrofajlar izole edildi ve kültürlü.Daha sonra, EGFP ifade E.coli 37 santigrees bir saat makrofajlar ile coincubated edildi. Söndürme adımından sonra makrofajlar hem floresan mikroskobu hem de akış sitometresi ile değerlendirilmeye hazırdı. EGFP gen parçasını sentezleyin ve yüksek sadakatli Taq DNA polimeraz kullanarak ileri ve ters astarlarla parçayı yükseltin.PCR ürünlerinin bir sonraki adımda TA klonlama için tek üç uçlu adenin çıkıntılara sahip olduğundan emin olmak için, son döngüden sonra 72 santigrat derecede 30 dakikalık bir uzatma önerilir. AGAROSE jel elektroforez ile PCR ürün kontrol edin. Eğer parça doğru bir şekilde güçlendirilmişse, jel üzerinde 717 bp bandı gözlemlenebilir.T4 DNA ligaz ile TA klonlama yöntemini kullanarak PCR ürünlerini pET SUMO vektörüne kopyala. Reaksiyonu oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. BL21 yetkili hücrelerin 100 mikrolitre içine PCR ürün beş mikrolitre ekleyin.Isı hücreleri 42 derecede 90 saniye boyunca şok eder, sonra karışımı üç dakika buzda tutar. Lb orta 400 mikrolitre ekleyin, önceden ısıtılmış 37 santimetre centigrees. 37 derece centigrees ve 120 rpm bir saat sallayarak.Vektöre dönüştürülmüş E.coli'yi taramak için bakterileri mililitre kanamisin başına 100 mikrogram ile LB plakayüzeyine aşılayın. Tabağı bir gecede 37 derece lik fırında kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, mililitre kanamisin başına 100 mikrogram ile LB medya beş mililitre içine pozitif bir koloni aşılamak.37 derece centigrees iki saat boyunca 120 rpm inkübatör sallayarak kuluçka. Sonra litre başına 0.5 milimol son konsantrasyonuna indükleyici laktoz ekleyin ve altı saat sallayarak devam, EGFP ifade indükleyen. Ampirik olarak, altı saat sallayarak, OD600 0.7 veya daha yüksek ulaşabilir.Son olarak, EGFP ifade ölçüde doğrulamak için floresan mikroskop kullanarak. Bir slayt için bakteri kültürü orta 10 mikrolitre ekleyin. Sonra bir kapak fişi ile kaplayın.Floresan mikroskobu altında EGFP ifadesini inceleyin. 100 mililitre distile suya 3,5 gram tiyoglikolat ekleyin. Kullanmadan önce otoklavda sterilize edin.Tioglikolat ortasını kaputtaki bir mililitrelik steril şırıngaya aspire edin. Enfeksiyonönlemek için şırınga başına bir fare. Fare periton boşluğuna 23 kalibrelik bir iğne kullanarak bir mililitre 3,5 tioglikolat ortası enjekte edin ve fareyi üç gün boyunca su ve gıda reklamı libitum ile koruyun.Üç gün sonra, hızlı bir şekilde kapalı bir kutuiçinde sevofluran e-posta ile anestezi indükledikten sonra servikal çıkış ile fare ötenazi. Sonra, steril ve hızlı bir şekilde kaputa aktarmak için% 75 etanol ile bir çanak içine fare koyun. Fareyi plakaya yerleştirin ve farenin konumunu düzeltmek için ön pençeyi tahtaya sabitle.20-gauge iğne ile beş mililitrelik şırınga kullanarak, fare periton boşluğuna alt karın soğuk PBS beş mililitre enjekte, bağırsak delinme kaçınarak. Fare karnının iki tarafına hafifçe masaj yapın. Sonra yavaşça ve yavaşça karın sıvısı aspire.Periton sıvısını 50 mililitrelik bir santimetrelik tüpe dağıtın. Bu adımları iki veya üç kez tekrarlayın. Askıda hücreleri 4-8 santigrat derece400 g 10 dakika santrifüj.Supernatant atın ve% 10 fetal sığır serumu ile RPMI 1640 orta hücre pelet resuspend. Akış sitometri sitometri satometri satomu ve floresan mikroskobu için 24 iyi plaka içine iyi başına 500.000 hücre için altı iyi plaka her kuyuya beş milyon hücre ekleyin. Kültür hücreleri 37 derecede bir gecede %5 karbondioksit kuvözde.Bunların çoğu lenfositler olduğu için kültür ortamı nonadherent hücreleri kaldırmak için üç saat sonra yenilenebilir. Hücre canlılığını ve hücre yoğunluğunu değerlendirmek için hücreleri parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin. Burada gösterilen görüntü birincil hücrenin normal durumundaydı.Periton hücrelerinin büyük bir kısmı lenfositler olduğu için genellikle makrofaj hücre yoğunluğu yüksek değildi. Kültür ortamını 24 kuyulu plakadan çıkarın. Taze kültür orta 100 mikrolitre ve bakteriyel orta 10 mikrolitre ekleyin.Sonra plakayı 37 derecede bir saat boyunca %5 karbondioksit kuvözde kuluçkaya yatırın. İçselleştirilmeyen bakterileri temizlemek için her kuyuda 500 mikrolitre soğuk PBS ile 3-5 kez hafifçe yıkayın. Hücreleri PBS'de %4 formaldehit ile oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. F-aktin lekepoid 633 eşleyolnize çalışma solüsyonu ekleyin. 60 dakika oda sıcaklığında karanlık ve nemli bir yerde saklayın.Hücre nükleer leke VE oda sıcaklığında karanlık bir yerde beş dakika kuluçka IÇIN DAPI çalışma solüsyonu ekleyin. Bir kez PBS ile durulayın ve bir kez distile suda aynı hacimde. Yeşil renkte görüntülenen EGFP ifade eden E.coli fagositozun belirteci olarak görev yaptı.Deneysel hataları en aza indirmek ve sonuçların doğru yorumlanmasını sağlamak için, tablo 2'de listelenen deney için gruplar ve kontrol tüpleri ayarlayın. Buzun üzerine yerleştirilecek kontrol grubu için, ortayı altı kuyulu plakadan çıkarın ve bir kez PBS ile yıkayın. Sonra hücre ayırmak ve akış sitometri tüpü içine aktarmak için kuyuiçine litre soğuk EDTA bir mililitre başına 70 milimole ekleyin.Tüpiçine 50 mikrolitre bakteriyel süspansiyon ekleyin ve bir saat boyunca buzun üzerine yerleştirin. Diğer gruplar için, kültür ortamı kaldırmak, her kuyuya bir mililitre taze orta ekleyin. Tablo ikide açıklandığı gibi grup ayarına göre kuyulara 50 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin.Sonra bir saat için 37 derece centigrees% 5 karbondioksit inkübatör altı iyi plaka yerleştirin. İçselleştirilmeyen E.coli floresansını gidermek için, kuyuya 200 mikrolitre %0,8 kristal menekşe su çözeltisi ekleyin ve kısa bir süre sallayın. Bu adım, makrofajların yüzeyine bağlanan ancak içselleştirilen EGFP E.coli tarafından yanlış pozitif sonuçları önlemek amacıyla tasarlanmıştır.Herhangi bir kalıntı kristal menekşe kaldırmak için PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Sonra hücre ayırmak ve akış sitometri tüpü içine aktarmak için kuyuiçine litre soğuk EDTA bir mililitre başına 70 milimole ekleyin. Tüpleri santrifüj 2, 000 rpm beş dakika ve supernatant atın.Hücreleri yeniden askıya almak için 100 mikrolitre PBS ekleyin. Grup ayarına göre tüplere veya isotiplere beş mikrolitre F4 ATP konjuge antikor ekleyin. Girdap kısaca ve karanlıkta 5 ila 10 dakika buz üzerinde örnekleri kuluçka.Her tüp ve santrifüj içine bir mililitre PBS ekleyin 2, 000 rpm beş dakika. Supernatant atın. Akış sitometri analizi için 200 ila 300 mikrolitre PBS ile hücre peletlerini yeniden askıya alın.Her tüpü çalıştırın ve F4/80 pozitif hücrelerin en az 10.000 olayı için veri elde edin. Burada genç ve yaşlı gruplardan periton makrofajlar floresan görüntüleri vardır. Kırmızı floresan F-aktin'i temsil eder.Yeşil, EGFP ifade eden E.coli'yi, mavi ise DAPI tarafından boyanmış çekirdeği temsil eder. Bu görüntüler, genç fareden gelen makrofajların yaşlı fareden daha güçlü fagositik bir yeteneğe sahip olduğunu göstermektedir. F4/80-pozitif ve EGFP pozitif hücreler makrofajların fagositik yeteneğini gösterdi.Bu sonuçlar floresan mikroskop sonuçları nın eğilimi ile tutarlıdır. Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin sayısı yaşlı farede korunsa da fagositik yetenek genç fareye göre önemli ölçüde azaldı. Makrofaj fagositözün değerlendirilmesinde birçok yöntem kullanılmıştır.Burada uygun, hızlı ve ekonomik açıdan uygun geliştirilmiş bir yöntem gösteriyoruz. EGFP ifade eden E.coli ile fagositoz tetkik, araştırmacının tercihlerine göre hem akış sitometresi hem de floresan mikroskop ile kolayca yapılabilir ve ölçülebilir. Ayrıca bu yöntem doğrudan fagositik yeteneğini ölçer.Sonuçlar diğer dolaylı yöntemlere göre daha çoğaltılabilir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Nötrofil-aktive protein aşın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Toplu Modunda

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Fare kemik iliği ve Periton makrofaj harekete geçirmek antikor bazlı ilaçlara etkileri değerlendirilmesi

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...