Name: high throughput in vitro assessment of latency reversing agents on hiv transcription and splicing
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט גרנט APP1129320, תוכנית מענק APP1052979 NHMRC של אוסטרליה. אנו מודים ד ר אדם וויטלי, ד ר מרינה אלכסנדר, ד ר ג'ני ל' אנדרסון ולי י' מישל על מתן בונה חיוני וייעוץ סיומו המוצלח של עבודה זו. אנו מודים גם הצוות DMI זרימה מתקן עבור שלהם ייעוץ וסיוע נדיב בשמירה על cytometer זרימה השתמשו במחקר זה.

הערה: נהלי שכפול, שינוי, רצף הם דנו במקום18,19. הפרוטוקולים בזאת מתחילים מ תקנים של הווקטורים בתרבית של הביטוי (איור 3).
1. תרביות תאים תאים HEK293T עם כתבת צבע כפול לבנות
<ol><li>לטפח HEK293T תאים הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) בתוספ...

<ol>
	<li>Siliciano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+follow-up+studies+confirm+the+stability+of+the+latent+reservoir+for+HIV-1+in+resting+CD4++T+cells.">Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).</li><li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+8.">Ch. 8.</a> HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).</li><li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transcription+and+latency:+an+update.">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67 (2013).</li><li>Archin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Expression+Within+Resting+CD4++T+Cells+After+Multiple+Doses+of+Vorinostat.">HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat.</a> Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).</li><li>Elliott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+HIV+Transcription+with+Short-Course+Vorinostat+in+HIV-Infected+Patients+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy.">Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> PLoS Pathogens. 10, (2014).</li><li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+Vacc-4x,+recombinant+human+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+vaccination,+and+romidepsin+on+the+HIV-1+reservoir+(REDUC):+a+single-arm,+phase+1B/2A+trial.">Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial.</a> The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).</li><li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panobinostat,+a+histone+deacetylase+inhibitor,+for+latent-virus+reactivation+in+HIV-infected+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy:+a+phase+1/2,+single+group,+clinical+trial.">Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial.</a> The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).</li><li>S&#248;gaard, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Depsipeptide+Romidepsin+Reverses+HIV-1+Latency+In+Vivo.">The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo.</a> PLoS Pathogens. 11, (2015).</li><li>Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+bromodomain+inhibition+activate+transcription+via+transient+release+of+Positive+Transcription+Elongation+Factor+b+(P-TEFb)+from+7SK+small+nuclear+ribonucleoprotein.">Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).</li><li>Boehm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BET+bromodomain-targeting+compounds+reactivate+HIV+from+latency+via+a+Tat-independent+mechanism.">BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism.</a> Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).</li><li>Contreras, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suberoylanilide+hydroxamic+acid+reactivates+HIV+from+latently+infected+cells.">Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).</li><li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+HDAC+inhibitors+in+clinical+development:+effect+on+HIV+production+in+latently+infected+cells+and+T-cell+activation.">Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).</li><li>Wei, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin+induces+HIV+expression+in+CD4+T+cells+from+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy+at+concentrations+achieved+by+clinical+dosing.">Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).</li><li>Blazkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+HIV+production+in+latently+infected,+resting+CD4(+)+T+cells+from+infected+individuals+receiving+effective+antiretroviral+therapy.">Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).</li><li>Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ex+vivo+approaches+distinguish+effective+and+ineffective+single+agents+for+reversing+HIV-1+latency+in+vivo.">New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).</li><li>Yukl, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency+in+isolated+patient+CD4+T+cells+may+be+due+to+blocks+in+HIV+transcriptional+elongation,+completion,+and+splicing.">HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li><li>Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+retention+of+multiply+spliced+HIV-1+RNA+in+resting+CD4+T+cells.">Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells.</a> PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).</li><li>Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transcription+through+an+intron+requires+the+binding+of+an+Sm-type+U1+snRNP+with+intact+stem+loop+II+to+the+splice+donor.">Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor.</a> Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).</li><li>Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Linear+and+Discontinuous+Ribosome+Scanning+Are+Used+for+Translation+Initiation+from+Bicistronic+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+env+mRNAs.">Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs.</a> Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).</li><li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+detection+of+Mycoplasma+contamination+in+cell+culture.">Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).</li><li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency+reversing+agents+act+through+Tat+post+translational+modifications.">HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications.</a> Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).</li><li>Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency:+experimental+systems+and+molecular+models.">HIV latency: experimental systems and molecular models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).</li><li>Dahabieh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+non-productive+HIV-1+infection+in+a+T-cell+line+is+driven+by+cellular+activation+state+and+NFkappaB.">Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB.</a> Retrovirology. 11, 17 (2014).</li><li>Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+HIV+reporters+trace+a+population+of+latently+infected+cells+and+enable+their+purification.">Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification.</a> Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).</li><li>Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Latency+Is+Established+Directly+and+Early+in+Both+Resting+and+Activated+Primary+CD4+T+Cells.">HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells.</a> PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).</li><li>Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter-regulatory+region+of+the+major+immediate-early+gene+of+human+cytomegalovirus+responds+to+T-lymphocyte+stimulation+and+contains+functional+cyclic+AMP-response+elements.">The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements.</a> Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).</li><li>Reeves, M., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+human+cytomegalovirus+latency+and+reactivation.">Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).</li><li>Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+activation+of+the+cytomegalovirus+enhancer+is+mediated+by+a+viral+transactivator+and+by+T+cell+stimulation.">NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.</a> EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).</li><li>Kula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+HIV-1+RNA+associated+proteome+identifies+Matrin+3+as+a+nuclear+cofactor+of+Rev+function.">Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function.</a> Retrovirology. 8, 60 (2011).</li><li>Kula, A., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Post-Transcriptional+Regulation+of+HIV-1+Gene+Expression.">Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression.</a> Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).</li><li>Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev-ing+up+post-transcriptional+HIV-1+RNA+expression.">Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression.</a> RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).</li><li>Zolotukhin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSF+acts+through+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+mRNA+instability+elements+to+regulate+virus+expression.">PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).</li><li>Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Frequency+of+Latent+HIV-1+in+Resting+CD4(+)+T+Cells+Using+a+Limiting+Dilution+Coculture+Assay.">Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).</li><li>Cary, D. C., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+latent+reservoir+to+achieve+functional+HIV+cure.">Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure.</a> F1000Res. 5, (2016).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+identifies+effective+HIV-1+latency+-+reversing+drug+combinations.">Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).</li><li>Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+interference+antagonizes+proviral+gene+expression+to+promote+HIV+latency.">Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency.</a> Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).</li></ol>

לאור הקושי במדידת הפעלה מחדש וירוס ex-vivo, מגוון רחב של במבחנה מודלים שפותחו במהלך הזמן ללימוד השהיה HIV כולל לחשוף נגוע תא T-קווים (J-השרירים, ACH2, U1), מודלים העיקרי של דלקת סמויה של נח ( מודלים O'Doherty, לוין, גרין, Spina) או תאי CD4 + T מופעל מראש (Sahu, מריני, Planelles, Siliciano, מודלים Karn) עם יחיד עגול או שכפול כתב מוכ...

למרות טיפול תרופתי ארוך טווח יעיל, HIV נמשכת במצב נסתר כמו provirus משולב בזיכרון CD4 + T תאים1. המבנה כרומטין של HIV-1 5' מסוף זמן חוזר (משמאל לימין) יזם שינויים epigenetic היסטון מתילציה ו deacetylation על ידי ה-DNA methyltransferases (DNMT) ו היסטון deacetylases (HDAC) הם מנגנוני חשוב המוביל דיכוי גנים ברמת השעתוק ובכך השהיה פוסט-אינטגרציה2,3. מגוון גדול של סוכנים היפוך השהיה (LRAs) נחקר על היעילות שלהם לעודד ייצור וירוס במבחנה, לחשוף ויוו מן נגוע מנוחתו CD4 + T תאים4,5,6,7 ,8. בין LRAs נבדק, HDACi (מעכבי HDAC), מעכבי bromodomain ההימור (בו בטיס) זירוז כרומטין decondensation ושחרור של b גורם התארכות שעתוק חיובי (P-TEFb) בהתאמה, שמוביל הבאים להקל על תעתיק דיכוי-5' LTR והפעלה של HIV ביטוי9,10,11,12,13. עם זאת, סדר הגודל של הפעלה מחדש מושגת על ידי אלה LRAs היה מוגבל רק עלייה צנועה הקשורים תא unspliced HIV mRNA (אותנו RNA), מעידה על שעתוק ויראלי, נצפתה ex-vivo14,15. חשוב לציין, LRAs אלה גם נכשל לזירוז ירידה בשכיחות של תאים נגועים לחשוף.
הביטוי HIV עשוי מוגבלת עוד יותר באמצעות splicing לא יעיל16 , כמו גם פגמים גרעיני הייצוא של הכפל משולבים HIV RNA (MS RNA)17. לפיכך, נדרשים זיהוי שיעורים חדשים של LRAs זה יותר חזקות והוא יכול להשפיע על היבטים שונים של נגיף אינטגרציה שלאחר הייצור. בנוסף, נדרש הפיתוח של מבחני הרומן המסייעים הגדרת תרכובות האופטימלית להפוך ביעילות את זמן השהיה.
. הנה, פרוטוקול מוצג, אשר משתמשת בגישה תפוקה גבוהה להערכה תפקודית של ההשפעה של התערבויות על שעתוק מונחה HIV LTR ו שחבור. בקצרה, דואלי מונחה-LTR חדש צבע הכתב מערכת pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (איור 1) משמש כדי להעריך HIV הפעלה מחדש על ידי cytometry זרימה. כתבת פלורסנט, הביטוי של HIV unspliced mRNA (4kb) מוביל לביטוי משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP), ואילו הביטוי של mRNA משולבים (2 kb) יוביל ביטוי חלבון פלואורסצנטי Discosoma sp. אדום (DsRed). בקצרה, השתמשנו של חלבון כימרי פלורסנט Env-EGFP, gp140unc. ? EGFP, איפה רצף קידוד של EGFP בוצעה במסגרת עם צורה cleaved האו ם, קטום של המעטפה (מעטפה). הוכנסו שינויים כדי ablate האתר המחשוף מונע את הדיסוציאציה של מעטפה עבה לתוך gp120, gp41-EGFP, וכדי לעגל את החלבון gp160 לפני התחום transmembrane יצירת אנלוגי Env מסיסים, המאפשרת את הקיפול הנכון, ביטוי של EGFP. על הביטוי בתוך תא, Rev. רגישה את הגרעין איפה זה שמתווכת גרעיני cytoplasmic הייצוא של 4 kb env mRNA דרך האינטראקציה עם הרכיב להגיב rev (הכנה). העיגול של מעטפה לא מתפשרים על הכנה, הנמצא בין gp120, gp41 A7 3' אחוי באתר. במערכת זו, החדרת ב- HIV-1 אחוי התורם 4 (SD4), אחוי מקבל 7 (SA7) תוצאות בייצור של 2 קילובתים mRNA קידוד חלבון Rev פונקציונלי נקטע בנקודת חומצת אמינו 38 דבוקה חלבון פלואורסצנטי DsRed, RevΔ38-DsRed. בקצרה, DsRed הוכנס לתוך אקסון 2nd של Rev-חומצת אמינו 38 מאת חפיפה סיומת18. כדי להקל על הייצוא הגרעין של unspliced mRNA, וקטור ביטוי בתרבית של קידוד Rev (pCMV-RevNL4.3) היה שותף transfected עם הבונה כתב פלורסנט (איור 2). המבנה הזה, כתב ייחודי המתוארים כאן הוא שימושי תפוקה גבוהה הערכה של HIV שעתוק שחבור, ללא הצורך להשתמש וקטורים ויראלי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Origin Australia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I (1x) reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>Marcherey-Nagel</td>
			<td>740414.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 plasmid</td>
			<td>Clontech (TaKaRa)</td>
			<td>6085-1</td>
			<td>Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDsRed-Express-N1</td>
			<td>Clontech (TaKaRa)</td>
			<td>632429</td>
			<td>Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-RevNL4.3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JQ1(+)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11187</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JQ1(-)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11232</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16561-29-8</td>
			<td>Stock at 100 &#956;g/mL in DMSO; working concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohaemagglutinin (PHA)</td>
			<td>Remel</td>
			<td>HA15/R30852701</td>
			<td>Stock at 1 &#956;g/&#956;L in PBS; working concentration 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorinostat (VOR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10009929</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panobinostat (PAN)</td>
			<td>TRC</td>
			<td>P180500</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>63581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venor GeM Classic</td>
			<td>Minerva Biolabs</td>
			<td>11-1100</td>
			<td>Mycoplasma Detection Kit, PCR-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34976</td>
			<td>Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution 37/10 (37%)</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>FA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Diva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td>Calibration beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559123</td>
			<td>3.0 - 3.4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath solution</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td>90 g NaCl in 10 L water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAZ-Tabs</td>
			<td>Guest Medical</td>
			<td>H8801</td>
			<td>Chlorine release tablets for disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon 90</td>
			<td>Decon Laboratories Limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)</td>
			<td>Labco</td>
			<td>SODHYPO-5L</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7x</td>
			<td>MPBio</td>
			<td>IM76670</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (10 mL)</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.9924.284</td>
			<td>100x16 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>30x115 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Corning Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (25 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4489-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (10 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4488-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (5 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4487-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4470-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm style, 70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh</td>
			<td>SEFAR</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titertube Micro test tubes, bulk</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>2239391</td>
			<td>microfacs tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td>12x75 mm style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>SVZ4NIOU</td>
			<td>3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (Menzel-Gl&#228;ser)</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>HCS2026</td>
			<td>20 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TMS</td>
			<td>310528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000487</td>
			<td>with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo 10.4.2</td>
			<td>Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>FLUOstar multi-user reader control, version 5.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega - Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>MARS</td>
			<td>FLUOstar data analysis, version 3.20R2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel:mac 2011</td>
			<td>version 14.0.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism 7</td>
			<td>version 7.0c</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput in vitro assessment of latency reversing agents on hiv transcription and splicing

HIV נותר ללא מרפא בשל קיומה של מאגר של תאים זה בנמלים טופס החבויים ויציבה של הנגיף, אשר נשאר בלתי נראה המערכת החיסונית, לא מכוון על ידי טיפול תרופתי הנוכחי (עגלה). שעתוק ו שחבור הוכחו לחזק את השהיה HIV-1 בנח תאי CD4 + T. היפוך של השהיה על ידי שימוש השהיה סוכנים היפוך (LRAs) הגישה "הלם ולהרוג" נחקר בהרחבה, בניסיון לטהר את המאגר הזה, אבל עד כה לא הראה כל הצלחה בניסויים קליניים עקב חוסר התפתחות נאותה קטנים מולקולות יכול ביעילות perturb את המאגר הזה. פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה אמינה ויעילה הערכת השהיה היפוך סוכנים (LRAs) ב- HIV שעתוק של שחבור. גישה זו מבוססת על השימוש הכתב צבע כפול מונחה משמאל לימין בו זמנית יכול למדוד את ההשפעה של חשבון גמלאות אישי על שעתוק ו שחבור על ידי cytometry זרימה. הפרוטוקול המתואר כאן מספיקה עבור תאים חסיד, כמו גם את התאים ההשעיה. זה שימושי לבדיקת מספר רב של תרופות במערכת תפוקה גבוהה. השיטה היא טכנית פשוטה ליישום וחסכונית. בנוסף, השימוש של cytometry זרימה מאפשר להערכת הכדאיות התא, ובכך תרופות רעילות באותו זמן.

נציג התוצאות מוצגות באיור 5 עבור הביטוי של HIV-1 unspliced (EGFP), משולבים המוצרים (DsRed) בעקבות טיפול עם מעכבי bromodomain JQ1. הן JQ1(+) והן בלשכת המידע לתיירים הגדילה משמעותית את אחוז התאים לבטא EGFP (FC 2.18 ו 4.13 מעל דימתיל סולפוקסיד בהתאמה; n = 3) מעידה על תעתיקים unspliced. יתר על כן, JQ1(+...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing at JoVE.com

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך במבחנה, את ההשפעה של השהיה היפוך סוכנים על עיבוד MRNA HIV. הפרוטוקול מספק שיטה יעילה ואמינה פשוטה להערכת, בו זמנית את ההשפעה של LRA על שעתוק HIV ושזור. טכניקה זו סיפקה תובנה על היכולת של LRAs לגרום להפעלה מחדש של וירוסים וסיווג של המאגר הסמוי.לאחר טיפוח תאים, מקום 20, 000 מהם 100 microliters של מדיום DMEM, בתוספת 10% FBS, וללא אנטיביוטיקה בארות של צלחת תחתונה שטוחה 96 היטב במשך 24 שעות. למחרת לדלל את מבנה כתב צבע כפול. ה-DNA של Tat ו-Rev ב-50 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום, ומערבבים בעדינות.מערבבים בעדינות את ריאגנט השומנים, ולאחר מכן מדללים 0.65 מיקרוליטרים שלו לכל תגובה ב-50 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום. מערבבים בעדינות, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מערבבים את ריג'נט השומנים המדולל עם הדנ"א המדולל ומערבבים בעדינות.דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן, לוותר על 100 microliters של זה תסביך DNA ריג'נט השומנים טיפה חכם, על גבי התאים בכל באר. מטלטלים את הצלחת בעדינות קדימה ואחורה כדי לערבב.ולהדגור את הצלחת באינקובטור לח, ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך חמש שעות. לאחר מכן, להדביק בארות נוספות עם 100 ננוגרם של CMV מונחה EGFP ו DsRed אקספרס DNA פלסמיד למטרות פיצוי. כדי להתחיל, לדלל כל סוכן היפוך השהיה למצב העבודה המתאים עם מדיום הצמיחה.בעזרת ראש צינור רב-ערוצי, ישאףו בזהירות את מדיום ההמרה, והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטרים של מדיום המכילים את סוכן היפוך ההשהיה המתאים. דגירה באינקובטור לח ב 37% צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות. כדי להתחיל להכתים את התאים, השתמש בראש צינור רב ערוצי כדי להוסיף 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר.יש להצינור בעדינות את הראש למעלה ולמטה בערך חמש פעמים. תוך הקפדה להימנע מקצף כדי לנתק את התאים לתוך התקשורת. לאחר מכן, להעביר את התאים לתוך הבאר של צלחת V-התחתון 96 היטב.צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וב-4 מעלות צלזיוס לחמש דקות. שאף את המדיום ואת PBS מבלי לגעת בתאים. לשטוף את התאים לפחות פעם אחת עם 200 microliters של חלבון PBS ללא סרום.צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וב-4 מעלות צלזיוס לחמש דקות. להטות את הצלחת כדי להשליך את supernatant ולהסיר את מאגר לשטוף מבלי לגעת בתאים. לאחר מכן לדלל את צבע הכדאיות הקבוע בחלבון ו PBS ללא סרום ביחס של 1 עד 1000, כדי להכין פתרון עובד.מוסיפים 50 מיקרוליטרים של הצבע המדולל לכל באר, ומצינורים למעלה ולמטה כדי לערבב. דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בעוד מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום במשך 10 עד 15 דקות.לאחר מכן לשטוף את התאים פעם או פעמיים עם 150 microliters של חיץ לשטוף. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 500 פעמים כבידה, וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי. כדי לתקן את התאים, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של 1%פורמלדהיד טרי וחוצץ שטיפה.ודגירה בארבע מעלות צלזיוס בעוד מוגן מפני אור במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעם או פעמיים עם 100 microliters של חיץ לשטוף. צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וב-4 מעלות צלזיוס לחמש דקות.השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את גלולת התא ב-70 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה. לאחר בדיקת הביצועים והרגישות של הגדרות הציטרומטר על ידי הפעלת קדילי כיול, כוונן את מתחי הפיזור קדימה וצד עם מדגם לא מוכתם, כך שהאוכלוסייה הראשית תהיה על המסך ותובחנה בבירור. בצע פיצוי ידני או אוטומטי באמצעות דגימות מוכתמות יחיד, הבטחת לשפוך מינימלי על האוכלוסייה החיובית EGFP לתוך גלאי DsRed ולהיפך.באמצעות הפלואורסצנטיות מינוס אחד שולט, ליצור חלקות ולהגדיר את השערים. לאחר מכן, התאימו את מתחי הפיזור קדימה וצד עם מדגם לא מוכתם, כך שהאוכלוסייה העיקרית נמצאת על המסך ומובחנת בבירור. רכוש והקליט מינימום של 10,000 אירועי תאים בני קיימא לכל מדגם.לאחר מכן, השתמש בתוכנה לניתוח נתונים של cytometry זרימה כדי לנתח את הנתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תוצאות מייצגות לביטוי של HIV-1, מוצרים לא מרוסנים ושזורים, לאחר טיפול עם מעכבי bromodomain JQ1, מראים כי הן JQ1 חיובי ו Tat, להגדיל באופן משמעותי את אחוז התאים המבטאים EGFP. מה שמעיד על תעתיקים לא מרוסנים.JQ1 חיובי נראה גם להגדיל באופן משמעותי את אחוז התאים המבטאים DsRed. ולהגדיל את חלקו של מוצר שאנחנו שותק לרמות דומות כמו Tat. זה מאשר את היכולת של JQ1 חיובי להפעיל שעתוק HIV ושזור.עם זאת, טיפול עם שליטה stereoisomer JQ1 שלילי, מבטל את ההשפעה החיובית JQ1 על שעתוק HIV ושזור. לאחר השליטה, שיטה זו יכולה להתבצע באמצעות תרופות בנפרד או בשילוב. בודקים את היכולת שלהם לסינרגיה ביעילות.מה שיוביל למינון נמוך יותר של התרופה ורעילות. לאחר כל התפתחות, טכניקה זו סללה את הדרך לבדיקת שילובי תרופות יעילים במודלים ראשוניים של השהיה בדגימות של מטופלי אקס ויוו.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...