Name: high throughput in vitro assessment of latency reversing agents on hiv transcription and splicing
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av prosjekt stipend APP1129320 og programmet grant APP1052979 fra NHMRC i Australia. Vi takker Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson og Michelle Y. Lee for å gi viktig konstruksjoner og råd for en vellykket gjennomføring av dette arbeidet. Vi takker også DMI flyt anlegget ansatte for deres råd og hjelp i å opprettholde flyten cytometer brukt i denne studien.

Merk: Prosedyrer for kloning, transformasjon og sekvensering er nevnt18,19. Protokollene her begynner fra transfection av pattedyr uttrykk vektorer (Figur 3).
1. hva HEK293T celler med to farger Reporter konstruere
<ol><li>Dyrke HEK293T celler i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 10% (v/v) fetal bovin serum (FBS), penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 μg/mL) i en 5% CO...

<ol>
	<li>Siliciano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+follow-up+studies+confirm+the+stability+of+the+latent+reservoir+for+HIV-1+in+resting+CD4++T+cells.">Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).</li><li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+8.">Ch. 8.</a> HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).</li><li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transcription+and+latency:+an+update.">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67 (2013).</li><li>Archin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Expression+Within+Resting+CD4++T+Cells+After+Multiple+Doses+of+Vorinostat.">HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat.</a> Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).</li><li>Elliott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+HIV+Transcription+with+Short-Course+Vorinostat+in+HIV-Infected+Patients+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy.">Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> PLoS Pathogens. 10, (2014).</li><li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+Vacc-4x,+recombinant+human+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+vaccination,+and+romidepsin+on+the+HIV-1+reservoir+(REDUC):+a+single-arm,+phase+1B/2A+trial.">Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial.</a> The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).</li><li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panobinostat,+a+histone+deacetylase+inhibitor,+for+latent-virus+reactivation+in+HIV-infected+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy:+a+phase+1/2,+single+group,+clinical+trial.">Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial.</a> The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).</li><li>S&#248;gaard, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Depsipeptide+Romidepsin+Reverses+HIV-1+Latency+In+Vivo.">The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo.</a> PLoS Pathogens. 11, (2015).</li><li>Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+bromodomain+inhibition+activate+transcription+via+transient+release+of+Positive+Transcription+Elongation+Factor+b+(P-TEFb)+from+7SK+small+nuclear+ribonucleoprotein.">Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).</li><li>Boehm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BET+bromodomain-targeting+compounds+reactivate+HIV+from+latency+via+a+Tat-independent+mechanism.">BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism.</a> Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).</li><li>Contreras, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suberoylanilide+hydroxamic+acid+reactivates+HIV+from+latently+infected+cells.">Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).</li><li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+HDAC+inhibitors+in+clinical+development:+effect+on+HIV+production+in+latently+infected+cells+and+T-cell+activation.">Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).</li><li>Wei, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin+induces+HIV+expression+in+CD4+T+cells+from+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy+at+concentrations+achieved+by+clinical+dosing.">Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).</li><li>Blazkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+HIV+production+in+latently+infected,+resting+CD4(+)+T+cells+from+infected+individuals+receiving+effective+antiretroviral+therapy.">Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).</li><li>Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ex+vivo+approaches+distinguish+effective+and+ineffective+single+agents+for+reversing+HIV-1+latency+in+vivo.">New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).</li><li>Yukl, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency+in+isolated+patient+CD4+T+cells+may+be+due+to+blocks+in+HIV+transcriptional+elongation,+completion,+and+splicing.">HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li><li>Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+retention+of+multiply+spliced+HIV-1+RNA+in+resting+CD4+T+cells.">Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells.</a> PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).</li><li>Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transcription+through+an+intron+requires+the+binding+of+an+Sm-type+U1+snRNP+with+intact+stem+loop+II+to+the+splice+donor.">Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor.</a> Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).</li><li>Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Linear+and+Discontinuous+Ribosome+Scanning+Are+Used+for+Translation+Initiation+from+Bicistronic+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+env+mRNAs.">Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs.</a> Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).</li><li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+detection+of+Mycoplasma+contamination+in+cell+culture.">Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).</li><li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency+reversing+agents+act+through+Tat+post+translational+modifications.">HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications.</a> Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).</li><li>Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency:+experimental+systems+and+molecular+models.">HIV latency: experimental systems and molecular models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).</li><li>Dahabieh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+non-productive+HIV-1+infection+in+a+T-cell+line+is+driven+by+cellular+activation+state+and+NFkappaB.">Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB.</a> Retrovirology. 11, 17 (2014).</li><li>Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+HIV+reporters+trace+a+population+of+latently+infected+cells+and+enable+their+purification.">Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification.</a> Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).</li><li>Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Latency+Is+Established+Directly+and+Early+in+Both+Resting+and+Activated+Primary+CD4+T+Cells.">HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells.</a> PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).</li><li>Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter-regulatory+region+of+the+major+immediate-early+gene+of+human+cytomegalovirus+responds+to+T-lymphocyte+stimulation+and+contains+functional+cyclic+AMP-response+elements.">The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements.</a> Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).</li><li>Reeves, M., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+human+cytomegalovirus+latency+and+reactivation.">Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).</li><li>Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+activation+of+the+cytomegalovirus+enhancer+is+mediated+by+a+viral+transactivator+and+by+T+cell+stimulation.">NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.</a> EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).</li><li>Kula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+HIV-1+RNA+associated+proteome+identifies+Matrin+3+as+a+nuclear+cofactor+of+Rev+function.">Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function.</a> Retrovirology. 8, 60 (2011).</li><li>Kula, A., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Post-Transcriptional+Regulation+of+HIV-1+Gene+Expression.">Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression.</a> Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).</li><li>Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev-ing+up+post-transcriptional+HIV-1+RNA+expression.">Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression.</a> RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).</li><li>Zolotukhin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSF+acts+through+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+mRNA+instability+elements+to+regulate+virus+expression.">PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).</li><li>Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Frequency+of+Latent+HIV-1+in+Resting+CD4(+)+T+Cells+Using+a+Limiting+Dilution+Coculture+Assay.">Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).</li><li>Cary, D. C., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+latent+reservoir+to+achieve+functional+HIV+cure.">Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure.</a> F1000Res. 5, (2016).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+identifies+effective+HIV-1+latency+-+reversing+drug+combinations.">Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).</li><li>Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+interference+antagonizes+proviral+gene+expression+to+promote+HIV+latency.">Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency.</a> Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).</li></ol>

Gitt vanskeligheten i å måle virus reaktivering ex vivo, infisert en lang rekke i vitro modeller ble utviklet over tid for å studere HIV ventetid inkludert latently T celle-linjer (J Lats, ACH2, U1), primære modeller av latent infeksjon av hvile) O'Doherty, Lewin, Greene og Spina modeller) eller pre-aktivert CD4 + T celler (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modeller) med enkelt kompetent reporter virus22-med runde eller replikering. For å modellere fysiologiske betingelsene for HIV ven...

Til tross for effektiv langsiktige antiretroviral terapi vedvarer HIV i en latent tilstand som et integrert provirus i minnet CD4 + T celler1. Chromatin strukturen i HIV-1-5 "lenge terminal gjenta (VTH) arrangøren og epigenetic endringer som histone metylering og deacetylation av DNA methyltransferases (DNMT) og histone deacetylases (HDAC) er viktige mekanismer fører til transcriptional undertrykkelse og dermed post integrasjon ventetid2,3. En rekke ventetid snu agenter (LRAs) har blitt undersøkt for sin virkning å indusere virus produksjon i vitro og i vivo fra infisert latently hvile CD4 + T celler4,5,6,7 ,8. Blant LRAs testet, HDACi (HDAC hemmere) og BET bromodomain hemmere (BETis) indusere chromatin decondensation og utgivelsen av positiv transkripsjon forlengelse faktor b (P-TEFb) henholdsvis, fører til etterfølgende avlaste av den transcriptional undertrykkelse på den 5' LTR og aktivering av HIV uttrykk9,10,11,12,13. Omfanget av aktivering av disse LRAs ble imidlertid begrenset bare en beskjeden økning i celle-assosiert unspliced HIV mRNA (oss RNA), indikativ viral transkripsjon, ble observert ex vivo14,15. Viktigere, kunne disse LRAs også føre til en reduksjon i frekvensen av latently infiserte celler.
HIV uttrykk, begrenses ytterligere av ineffektiv skjøting16 som mangler i kjernefysiske eksport multiplisere skjøtes HIV RNA (MS RNA)17. Dermed er identifisere nye klasser av LRAs som er sterkere og kan påvirke forskjellige aspekter av viruset produksjon etter integrering nødvendig. I tillegg er utviklingen av romanen analyser som definerer den optimale forbindelser for å effektivt reversere ventetid nødvendig.
Her, er en protokoll presentert, som utnytter en høy gjennomstrømming tilnærming for funksjonell vurdering av virkningen av tiltakene på HIV LTR-drevet transkripsjon og skjøting. I korte trekk, en ny LTR-drevet dobbelt farge reporter systemet pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (figur 1) brukes til å vurdere HIV reaktivering av flowcytometri. I dette fluorescerende reporter fører uttrykk for unspliced HIV mRNA (4 kb) til forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) uttrykk, mens uttrykk for skjøtes mRNA (2 kb) vil føre til Discosoma sp. rød (DsRed) fluorescerende protein uttrykk. Kort, vi brukte en fluorescerende Env-EGFP fusion protein, gp140unc. EGFP, der koding sekvensen av EGFP ble plassert i rammen med en un cleaved og avkortede form av konvolutten (Env). Endringene ble innført ablate cleavage området hindrer dissosiasjon av konv i gp120 og gp41-EGFP og avkorte gp160 protein før transmembrane domenet oppretter en løselig konv analog, som letter den riktige folding og uttrykk for EGFP. På uttrykket i en celle, Rev regionaliserer til kjernen der det formidler kjernefysiske-cytoplasmatiske eksport av 4 kb konv mRNA via samspill med rev forståelsesfull elementet (RRE). Trunkering av konv kompromiss ikke RRE, som ligger mellom gp120 og gp41, og det A7 3 skjøte området. I dette systemet, skjøting på HIV-1 skjøte donor 4 (SD4) og spleise acceptor 7 (SA7) resulterer i produksjon av en 2 kb mRNA koding en ikke-fungerende Rev protein avkortet på aminosyre 38 smeltet DsRed fluorescerende protein, RevΔ38-DsRed. Kort, DsRed ble satt inn i 2nd ekson av Rev på aminosyre 38 av overlapping forlengelsen18. For å lette kjernefysiske eksport av unspliced mRNA, en pattedyr uttrykk vektor koding Rev (pCMV-RevNL4.3) var co transfekterte med fluorescerende reporter konstruere (figur 2). Denne unike reporter konstruere beskrevet her er nyttig i høy gjennomstrømming vurdering av HIV transkripsjon og skjøting, uten å måtte bruke viral vektorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Origin Australia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I (1x) reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>Marcherey-Nagel</td>
			<td>740414.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 plasmid</td>
			<td>Clontech (TaKaRa)</td>
			<td>6085-1</td>
			<td>Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDsRed-Express-N1</td>
			<td>Clontech (TaKaRa)</td>
			<td>632429</td>
			<td>Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-RevNL4.3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JQ1(+)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11187</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JQ1(-)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11232</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16561-29-8</td>
			<td>Stock at 100 &#956;g/mL in DMSO; working concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohaemagglutinin (PHA)</td>
			<td>Remel</td>
			<td>HA15/R30852701</td>
			<td>Stock at 1 &#956;g/&#956;L in PBS; working concentration 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorinostat (VOR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10009929</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panobinostat (PAN)</td>
			<td>TRC</td>
			<td>P180500</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>63581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venor GeM Classic</td>
			<td>Minerva Biolabs</td>
			<td>11-1100</td>
			<td>Mycoplasma Detection Kit, PCR-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34976</td>
			<td>Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution 37/10 (37%)</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>FA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Diva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td>Calibration beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559123</td>
			<td>3.0 - 3.4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath solution</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td>90 g NaCl in 10 L water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAZ-Tabs</td>
			<td>Guest Medical</td>
			<td>H8801</td>
			<td>Chlorine release tablets for disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon 90</td>
			<td>Decon Laboratories Limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)</td>
			<td>Labco</td>
			<td>SODHYPO-5L</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7x</td>
			<td>MPBio</td>
			<td>IM76670</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (10 mL)</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.9924.284</td>
			<td>100x16 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>30x115 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Corning Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (25 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4489-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (10 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4488-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (5 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4487-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4470-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm style, 70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh</td>
			<td>SEFAR</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titertube Micro test tubes, bulk</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>2239391</td>
			<td>microfacs tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td>12x75 mm style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>SVZ4NIOU</td>
			<td>3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (Menzel-Gl&#228;ser)</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>HCS2026</td>
			<td>20 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TMS</td>
			<td>310528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000487</td>
			<td>with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo 10.4.2</td>
			<td>Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>FLUOstar multi-user reader control, version 5.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega - Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>MARS</td>
			<td>FLUOstar data analysis, version 3.20R2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel:mac 2011</td>
			<td>version 14.0.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism 7</td>
			<td>version 7.0c</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput in vitro assessment of latency reversing agents on hiv transcription and splicing

HIV er uhelbredelig på grunn av eksistensen av et reservoar av celler som havner stabil og latent form av viruset, som forblir usynlig for immunsystemet og ikke er målrettet etter gjeldende antiretroviral terapi (handlevogn). Transkripsjon og skjøting har vist å forsterke HIV-1 ventetid hviler CD4 + T celler. Reversering av ventetid ved bruk av ventetid reversering agenter (LRAs) i "sjokk og drepe" tilnærming har vært studert i et forsøk på å tømme dette reservoar, men så langt ikke har vist noen suksess i kliniske forsøk på grunn av mangel på utvikling av tilstrekkelig små molekyler som kan effektivt forurolige dette reservoar. Protokollen presenteres her gir en metode for pålitelig og effektivt vurdere ventetid reversering agenter (LRAs) på HIV transkripsjon og skjøting. Denne tilnærmingen er basert på bruk av en LTR-drevet to farger reporter som samtidig kan måle effekten av en LRA på transkripsjon og skjøting av flowcytometri. Protokollen beskrevet her er tilstrekkelig for tilhenger celler som cellene i suspensjon. Det er nyttig for testing en rekke narkotika i en høy gjennomstrømning system. Metoden er teknisk enkel å implementere og kostnadseffektiv. Dessuten, bruk av flowcytometri kan vurdering av cellen levedyktighet og dermed drug giftighet samtidig.

Representant resultater er vist i figur 5 for uttrykket av HIV-1 unspliced (EGFP) og skjøtes (DsRed) produktene etter behandling med bromodomain hemmer JQ1. Både JQ1(+) og Tat betydelig økt andelen celler uttrykke EGFP (2,18 og 4.13 FC over DMSO henholdsvis; n = 3) om unspliced utskrifter. Videre JQ1(+) betydelig økt andelen celler uttrykke DsRed (46,6 FC over DMSO) og andelen skjøtes produktet (7.37 FC over DMSO) nivå som Tat (59.6 og 5.83 FC over DMSO...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing at JoVE.com

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

Høy gjennomstrømning i Vitro vurdering av ventetid reversere agenter på HIV transkripsjon og skjøting

En høy gjennomstrømning protokoll for funksjonell vurdering av HIV effektiv reaktivering og rydding av latente proviruses er beskrevet og ved å teste effekten av intervensjoner på HIV transkripsjon og skjøting. Representant resultatene av effekten av ventetid snu agenter på LTR-drevet transkripsjon og skjøting tilbys.

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å vurdere in vitro, virkningen av latens reverserende midler på HIV mRNA behandling. Protokollen gir en enkel effektiv og pålitelig metode for vurdering, samtidig effekten av LRA på HIV transkripsjon og spleising. Denne teknikken ga et innblikk i LRAs evne til å indusere virusreaktivering og clearance av det latente reservoaret.Etter å ha dyrket celler, plasser 20.000 av dem i 100 mikroliter DMEM medium, supplert med 10% FBS, og uten antibiotika i brønnene til en 96-brønn flat bunnplate i 24 timer. Neste dag fortynner dual color reporter konstruere. Tat og Rev DNA i 50 mikroliter serumfritt medium, og bland forsiktig.Bland forsiktig lipidreagensen, og fortynne deretter 0,65 mikroliter av den per reaksjon hos 50 mikroliter serumfritt medium. Bland forsiktig, og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Kombiner den fortynnede lipidreagensen med fortynnet DNA og bland forsiktig.Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter. Deretter dispenserer 100 mikroliter av dette lipid reagens DNA-komplekset dråpe klokt, på toppen av cellene i hver brønn. Rock platen forsiktig frem og tilbake for å blande.Og inkuber platen i en fuktet inkubator, ved 37 grader celsius med 5% karbondioksid i fem timer. Etter dette, transfect flere brønner med 100 nanogram cmv drevet EGFP og DsRed uttrykke DNA plasmid for kompensasjon formål. For å begynne, fortynne hvert latensrediringsmiddel til riktig arbeidstilstand med vekstmedium.Bruk et flerkanals rørhode, aspirer forsiktig transinfeksjonsmediet, og bytt det ut med 100 mikroliter medium som inneholder riktig latensreiningsmiddel. Inkuber i en fuktet inkubator ved 37 % celsius med 5 %karbondioksid i 48 timer. For å begynne å fargelegge cellene, bruk et flerkanals rørhode for å legge til 100 mikroliter PBS til hver brønn.Rørhodet forsiktig opp og ned omtrent fem ganger. Mens du sørger for å unngå skummende å løsne cellene i media. Deretter overfører cellene til brønnene på en 96-brønns V-bunnplate.Sentrifuge på 500 ganger tyngdekraften og på fire grader celsius i fem minutter. Aspirer mediet og PBS uten å berøre cellene. Vask cellene minst én gang med 200 mikroliter protein og serumfri PBS.Sentrifuge på 500 ganger tyngdekraften og på fire grader celsius i fem minutter. Vipp platen for å kaste supernatanten og fjern vaskebufferen uten å berøre cellene. Etter dette fortynner den faste levedyktigheten fargestoff i protein og serumfri PBS i forholdet 1 til 1000, for å forberede en arbeidsløsning.Tilsett 50 mikroliter av det fortynnede fargestoffet til hver brønn, og rørhodet opp og ned for å blande. Inkuber ved fire grader celsius. Mens beskyttet mot lys ved hjelp av folie i 10 til 15 minutter.Vask deretter cellene en eller to ganger med 150 mikroliter vaskebuffer. Etter dette, sentrifuge på 500 ganger tyngdekraften, og fire grader celsius i fem minutter, og kast supernatant. For å fikse cellene, legg til 100 mikroliter nylaget 1% formaldehyd og vaskebuffer.Og inkuber ved fire grader celsius mens den er beskyttet mot lys i 10 til 15 minutter. Etter dette vasker du cellene en eller to ganger med 100 mikroliter vaskebuffer. Sentrifuge på 500 ganger tyngdekraften og på fire grader celsius i fem minutter.Kast det overnaturante, og gjenoppusst cellepelleten i 70 mikroliter vaskebuffer. Etter å ha sjekket cytometerinnstillingenes ytelse og følsomhet ved å kjøre kalibreringsperler, juster forover- og sidesp scatterspenningene med uopphetet prøve, slik at hovedpopulasjonen er på skjermen og tydelig merkbar. Utfør manuell eller automatisk kompensasjon ved hjelp av enkeltfargede prøver, noe som sikrer minimalt utslipp over EGFP-positiv populasjon inn i DsRed-detektoren og omvendt.Ved hjelp av fluorescens minus en kontroller, lage tomter og sette portene. Deretter justerer du forover- og sidesp scatterspenningene med uopphetet utvalg, slik at hovedpopulasjonen er på skjermen og tydelig merkbar. Hent og registrer minst 10 000 levedyktige cellehendelser per eksempel.Etter dette bruker du flytcytometridataanalyseprogramvare til å analysere dataene som beskrevet i tekstprotokollen. Representative resultater for uttrykk for HIV-1, uutskårne og skjøtede produkter, etter behandling med bromodomainhemmeren JQ1, viser at både JQ1-positive og Tat, øker signifikant prosentandelen celler som uttrykker EGFP. Som er et tegn på ulisensierte transkripsjoner.JQ1 positiv er også sett å øke andelen celler som uttrykker DsRed betydelig. Og øke andelen av skjøtet produkt til lignende nivåer som Tat. Dette bekrefter JQ1s evne til å slå på HIV-transkripsjon og spleising.Behandling med stereoisomerkontroll JQ1 negativ, avskaffer JQ1 positiv effekt på HIV-transkripsjon og spleising. Når mestret, denne metoden kan utføres ved hjelp av narkotika individuelt eller i kombinasjon. Testing for deres evne til å synergisere effektivt.Som ville føre til en lavere dose av stoffet og toksisitet. Etter hver utvikling banet denne teknikken vei for testing av effektive legemiddelkombinasjoner i primære modeller av ventetid i ex vivo pasientprøver.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Fastsettelse av Molecular Structures av HIV Konvolutt glykoproteiner bruker Cryo-Electron Tomography og Automated Sub-tomogram gjennomsnitt

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Imaging av HIV-1-konvolutt-indusert virologisk Synapse og signaliserer på Syntetiske Lipid bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro analysen å evaluere virkningen av immunoregulatory Pathways på HIV-spesifikke CD4 T Cell effektorfunksjon

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Rapid Screening av HIV revers transkriptase og integrasehemmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Høy gjennomstrømning Fluorometrisk Teknikk for Vurdering av Macrophage Fagocytose og Actin Polymerisering

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Høy gjennomstrømning Måling av ekstracellulært DNA Slipp og kvantitative NET-formasjonen i Human Neutrophils<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Høy throughput Gene Tagging i<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

måling av<em&gt; In Vitro</em&gt; Integrering Aktivitet av HIV-1 Preintegration Komplekser

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...