Name: high throughput in vitro assessment of latency reversing agents on hiv transcription and splicing
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela concessão do projeto APP1129320 e programa grant APP1052979 do NHMRC da Austrália. Agradecemos o Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson e Michelle Y. Lee para fornecer construções essenciais e conselhos para a conclusão deste trabalho. Agradecemos também a equipe DMI fluxo instalações para seus conselhos e ajuda na manutenção do citômetro de fluxo utilizado neste estudo.

Nota: Processos de clonagem, transformação e sequenciamento são discutidas em outra parte18,19. Os protocolos aqui começam o transfeccao dos vetores de expressão de mamíferos (Figura 3).
1. transfecção de células HEK293T com cor dupla repórter construir
<ol><li>Cultivar as células HEK293T no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal...

<ol>
	<li>Siliciano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+follow-up+studies+confirm+the+stability+of+the+latent+reservoir+for+HIV-1+in+resting+CD4++T+cells.">Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).</li><li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+8.">Ch. 8.</a> HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).</li><li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transcription+and+latency:+an+update.">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67 (2013).</li><li>Archin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Expression+Within+Resting+CD4++T+Cells+After+Multiple+Doses+of+Vorinostat.">HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat.</a> Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).</li><li>Elliott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+HIV+Transcription+with+Short-Course+Vorinostat+in+HIV-Infected+Patients+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy.">Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> PLoS Pathogens. 10, (2014).</li><li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+Vacc-4x,+recombinant+human+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+vaccination,+and+romidepsin+on+the+HIV-1+reservoir+(REDUC):+a+single-arm,+phase+1B/2A+trial.">Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial.</a> The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).</li><li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panobinostat,+a+histone+deacetylase+inhibitor,+for+latent-virus+reactivation+in+HIV-infected+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy:+a+phase+1/2,+single+group,+clinical+trial.">Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial.</a> The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).</li><li>S&#248;gaard, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Depsipeptide+Romidepsin+Reverses+HIV-1+Latency+In+Vivo.">The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo.</a> PLoS Pathogens. 11, (2015).</li><li>Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+HDAC+inhibitors+in+clinical+development:+effect+on+HIV+production+in+latently+infected+cells+and+T-cell+activation.">Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).</li><li>Wei, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin+induces+HIV+expression+in+CD4+T+cells+from+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy+at+concentrations+achieved+by+clinical+dosing.">Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).</li><li>Blazkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+HIV+production+in+latently+infected,+resting+CD4(+)+T+cells+from+infected+individuals+receiving+effective+antiretroviral+therapy.">Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).</li><li>Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ex+vivo+approaches+distinguish+effective+and+ineffective+single+agents+for+reversing+HIV-1+latency+in+vivo.">New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).</li><li>Yukl, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency+in+isolated+patient+CD4+T+cells+may+be+due+to+blocks+in+HIV+transcriptional+elongation,+completion,+and+splicing.">HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li><li>Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+retention+of+multiply+spliced+HIV-1+RNA+in+resting+CD4+T+cells.">Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells.</a> PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).</li><li>Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transcription+through+an+intron+requires+the+binding+of+an+Sm-type+U1+snRNP+with+intact+stem+loop+II+to+the+splice+donor.">Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor.</a> Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).</li><li>Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+non-productive+HIV-1+infection+in+a+T-cell+line+is+driven+by+cellular+activation+state+and+NFkappaB.">Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB.</a> Retrovirology. 11, 17 (2014).</li><li>Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+HIV+reporters+trace+a+population+of+latently+infected+cells+and+enable+their+purification.">Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification.</a> Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).</li><li>Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Latency+Is+Established+Directly+and+Early+in+Both+Resting+and+Activated+Primary+CD4+T+Cells.">HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells.</a> PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).</li><li>Hunninghake, G. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+activation+of+the+cytomegalovirus+enhancer+is+mediated+by+a+viral+transactivator+and+by+T+cell+stimulation.">NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.</a> EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).</li><li>Kula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+HIV-1+RNA+associated+proteome+identifies+Matrin+3+as+a+nuclear+cofactor+of+Rev+function.">Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function.</a> Retrovirology. 8, 60 (2011).</li><li>Kula, A., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Post-Transcriptional+Regulation+of+HIV-1+Gene+Expression.">Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression.</a> Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).</li><li>Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev-ing+up+post-transcriptional+HIV-1+RNA+expression.">Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression.</a> RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).</li><li>Zolotukhin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSF+acts+through+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+mRNA+instability+elements+to+regulate+virus+expression.">PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).</li><li>Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Frequency+of+Latent+HIV-1+in+Resting+CD4(+)+T+Cells+Using+a+Limiting+Dilution+Coculture+Assay.">Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).</li><li>Cary, D. C., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+latent+reservoir+to+achieve+functional+HIV+cure.">Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure.</a> F1000Res. 5, (2016).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+identifies+effective+HIV-1+latency+-+reversing+drug+combinations.">Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).</li><li>Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+interference+antagonizes+proviral+gene+expression+to+promote+HIV+latency.">Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency.</a> Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).</li></ol>

Dada a dificuldade em medir a reativação do vírus ex vivo, uma vasta gama de em vitro modelos foram desenvolvidos ao longo do tempo, a fim de estudar a latência de HIV incluindo Latentemente infectadas T cell-linhas (J-Lats, ACH2, U1), modelos primários de infecção latente de descansar ( O ' Doherty, Lewin, Greene e Spina modelos) ou pré-activated células T CD4 + (Santos, Marini, Planelles Siliciano, Karn modelos) com a única rodada ou replicação competente repórter vírus22. Para mod...

Apesar da terapia de antiretroviral eficaz a longo prazo, HIV persiste em estado latente, como um provirus integrado em memória de células T CD4 +1. A estrutura da cromatina do HIV-1 5' promotor de repetição tempo terminal (LTR) e modificações epigenéticas como metilação de histonas e deacetilação de histona por DNA metiltransferases (DNMT) e histona deacetilases (HDAC) são mecanismos importantes, levando a repressão transcriptional e, assim, a latência de pós-integração2,3. Uma grande variedade de agentes de inversão de latência (órgãos) foi investigada por sua eficácia induzir a produção de vírus in vitro e in vivo de Latentemente infectadas descanso T CD4 + células4,5,6,7 ,8. Entre os órgãos testados, HDACi (inibidores HDAC) e aposta contem inibidores (BETis) induzem ocorre descondensação da cromatina e lançamento da transcrição positivo alongamento fator b (P-TEFb), respectivamente, levando a subsequente aliviar do transcriptional repressão em 5' LTR e ativação de HIV expressão9,10,11,12,13. No entanto, a magnitude da reativação alcançada por esses órgãos foi limitada apenas um aumento modesto na célula associada unspliced HIV mRNA (RNA nos), indicativo de transcrição viral, observou-se ex vivo14,15. Importante, estes órgãos também conseguiram induzir uma redução da frequência de células Latentemente infectadas.
Expressão de HIV pode ser ainda mais restrito por ineficiente emenda16 , bem como defeitos de exportação nuclear de multiplicar emendados HIV RNA (RNA MS)17. Assim, identificando novas classes de órgãos que são mais potentes e podem afetar aspectos distintos da vírus produção pós integração são necessários. Além disso, o desenvolvimento de novos ensaios que ajudam a definir os compostos ideais para eficientemente reverter a latência é necessário.
Aqui, é apresentado um protocolo, que utiliza uma abordagem de alto rendimento para avaliação funcional do impacto das intervenções na transcrição orientada por HIV LTR e emenda. Em breve, um novo dual LTR-driven cor repórter sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figura 1) é usado para avaliar a reativação de HIV por citometria de fluxo. Este repórter fluorescente, a expressão do mRNA de HIV unspliced (4kb) leva à expressão da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), enquanto a expressão do mRNA emendados (2KB) levaria a expressão de proteínas fluorescentes de Discosoma SP. vermelho (DsRed). Brevemente, usamos uma proteína fluorescente de fusão Env-EGFP, gp140unc. EGFP, onde a sequência de codificação da EGFP foi colocada no quadro com um formulário truncado e un-entalhado do envelope (Env). As alterações foram introduzidas para ablate o local de clivagem, impedindo a dissociação do Env em gp120 e gp41-EGFP e truncar a proteína gp160 antes do domínio transmembrana criando um análogo solúvel de Env, que facilita o correto dobramento e expressão de EGFP. Sobre a expressão dentro de uma célula, Rev localiza-se no núcleo, onde ele Medeia a exportação nuclear citoplasmática de 4KB env mRNA através da interação com o elemento responsivo rev (RRE). Truncamento de Env não compromete a RRE, que se situa entre gp120 e gp41, A7 3' site da tala. Neste sistema, emendando a HIV-1 splice doador 4 (SD4) e splice aceitador 7 (AE7) resultados na produção de um 2KB mRNA codificação de uma proteína não-funcional de Rev truncada no aminoácido 38 fundido a DsRed proteína fluorescente, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed foi inserido o exon 2nd de Rev no aminoácido 38 por sobreposição extensão18. Para facilitar a exportação nuclear de unspliced mRNA, um vetor de expressão mamíferos codificação Rev (pCMV-RevNL4.3) foi co transfected com construção de repórter fluorescente (Figura 2). Essa construção único repórter descrita aqui é útil na avaliação da elevado-produção de HIV transcrição e emenda, sem a necessidade de usar vetores virais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Origin Australia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I (1x) reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>Marcherey-Nagel</td>
			<td>740414.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 plasmid</td>
			<td>Clontech (TaKaRa)</td>
			<td>6085-1</td>
			<td>Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDsRed-Express-N1</td>
			<td>Clontech (TaKaRa)</td>
			<td>632429</td>
			<td>Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-RevNL4.3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JQ1(+)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11187</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JQ1(-)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11232</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16561-29-8</td>
			<td>Stock at 100 &#956;g/mL in DMSO; working concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohaemagglutinin (PHA)</td>
			<td>Remel</td>
			<td>HA15/R30852701</td>
			<td>Stock at 1 &#956;g/&#956;L in PBS; working concentration 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorinostat (VOR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10009929</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panobinostat (PAN)</td>
			<td>TRC</td>
			<td>P180500</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>63581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venor GeM Classic</td>
			<td>Minerva Biolabs</td>
			<td>11-1100</td>
			<td>Mycoplasma Detection Kit, PCR-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34976</td>
			<td>Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution 37/10 (37%)</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>FA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Diva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td>Calibration beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559123</td>
			<td>3.0 - 3.4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath solution</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td>90 g NaCl in 10 L water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAZ-Tabs</td>
			<td>Guest Medical</td>
			<td>H8801</td>
			<td>Chlorine release tablets for disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon 90</td>
			<td>Decon Laboratories Limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)</td>
			<td>Labco</td>
			<td>SODHYPO-5L</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7x</td>
			<td>MPBio</td>
			<td>IM76670</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (10 mL)</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.9924.284</td>
			<td>100x16 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>30x115 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Corning Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (25 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4489-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (10 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4488-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (5 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4487-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4470-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm style, 70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh</td>
			<td>SEFAR</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titertube Micro test tubes, bulk</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>2239391</td>
			<td>microfacs tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td>12x75 mm style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>SVZ4NIOU</td>
			<td>3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (Menzel-Gl&#228;ser)</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>HCS2026</td>
			<td>20 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TMS</td>
			<td>310528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000487</td>
			<td>with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo 10.4.2</td>
			<td>Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>FLUOstar multi-user reader control, version 5.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega - Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>MARS</td>
			<td>FLUOstar data analysis, version 3.20R2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel:mac 2011</td>
			<td>version 14.0.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism 7</td>
			<td>version 7.0c</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput in vitro assessment of latency reversing agents on hiv transcription and splicing

HIV permanece incurável devido à existência de um reservatório de células que abriga o formulário estável e latente do vírus, que permanece invisível para o sistema imunológico e destina-se não pela atual terapia anti-retroviral (carrinho). Transcrição e emendando foram mostrados para reforçar a latência do HIV-1 em células T CD4 + a descansar. Reversão de latência pelo uso de agentes de reversão de latência (órgãos) na abordagem de "choque e matar" tem sido estudado extensivamente na tentativa de purgar este reservatório, mas até agora não mostrou qualquer sucesso em ensaios clínicos, devido à falta de desenvolvimento de pequenas adequada moléculas que podem eficientemente a perturbar este reservatório. O protocolo apresentado aqui fornece um método para confiável e eficiente avaliação de agentes de reversão de latência (órgãos) na transcrição de HIV e de emenda. Esta abordagem baseia-se na utilização de um repórter de cor dupla LTR-driven que simultaneamente pode medir o efeito de um LRA na transcrição e emenda por citometria de fluxo. O protocolo descrito aqui é adequado para as células aderentes, bem como as células em suspensão. É útil para testar um grande número de drogas em um sistema de alta taxa de transferência. O método é tecnicamente simples de implementar e cost-effective. Além disso, o uso da citometria de fluxo permite a avaliação da viabilidade celular e, portanto, toxicidade de drogas ao mesmo tempo.

Resultados representativos são mostrados na Figura 5 para a expressão do HIV-1 unspliced (EGFP) e emendados produtos (DsRed) após o tratamento com inibidor de bromodomain JQ1. Ambos JQ1(+) e Tat aumentaram significativamente a percentagem de células expressando EGFP (2.18 e 4,13 FC sobre DMSO respectivamente; n = 3) indicativo de transcrições de unspliced. Além disso, o JQ1(+) aumentou significativamente a percentagem de células expressando DsRed (46,...

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High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar in vitro, o impacto da latência revertendo agentes no processamento de HIV mRNA. O protocolo fornece um método simples e confiável para avaliar, simultaneamente, o efeito do IRA na transcrição e splicing do HIV. Esta técnica forneceu uma visão sobre a capacidade das LRAs de induzir a reativação e desobstrução do vírus do reservatório latente.Após o cultivo de células, coloque 20.000 delas em 100 microliters de meio DMEM, complementadas com 10% de FBS, e sem antibióticos nos poços de uma placa inferior plana de 96 poços por 24 horas. No dia seguinte diluir a construção de repórter de dupla cor. Tat e Rev DNA em 50 microliters de meio livre de soro, e misture suavemente.Misture suavemente o reagente lipídeto e, em seguida, dilua 0,65 microliters por reação em 50 microliters de meio livre de soro. Misture suavemente e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Misture o reagente lipídeto diluído com o DNA diluído e misture suavemente.Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. Então, dispense 100 microliters deste complexo de DNA de reagente lipídicos, em cima das células em cada poço. Balance o prato suavemente para frente e para trás para misturar.E incubar a placa em uma incubadora umidificada, a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Depois disso, transfectar poços adicionais com 100 nanogramas de EGFP e DsRed expressos de DNA guiados por CMV e plasmídeo de DNA expresso DsRed para fins de compensação. Para começar, diluir cada agente reversível de latência para a condição de trabalho adequada com meio de crescimento.Utilizando uma cabeça de tubulação multicanal, aspire cuidadosamente o meio de transfecção e substitua-o por 100 microliters de meio contendo o agente de reversão de latência apropriado. Incubar em uma incubadora umidificada a 37%celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Para começar a colorir as células, use uma cabeça de tubo multicanal para adicionar 100 microliters de PBS a cada poço.Cabeça de tubo suavemente para cima e para baixo aproximadamente cinco vezes. Ao mesmo tempo em que evita evitar espuma para desprender as células na mídia. Em seguida, transfira as células para os poços de uma placa de fundo V de 96 poços.Centrífuga a 500 vezes a gravidade e a 4 graus celsius por cinco minutos. Aspire o médio e o PBS sem tocar nas células. Lave as células pelo menos uma vez com 200 microliters de proteína e PBS sem soro.Centrífuga a 500 vezes a gravidade e a 4 graus celsius por cinco minutos. Incline a placa para descartar o supernatante e remova o tampão de lavagem sem tocar nas células. Após isso diluir o corante de viabilidade fixa em proteína e PBS livre de soro a uma proporção de 1 a 1000, para preparar uma solução de trabalho.Adicione 50 microliters do corante diluído a cada poço, e cabeça de tubo para cima e para baixo para misturar. Incubar a 4 graus celsius. Enquanto protegido contra a luz usando papel alumínio por 10 a 15 minutos.Em seguida, lave as células uma ou duas vezes com 150 microliters de tampão de lavagem. Depois disso, centrífuga a 500 vezes a gravidade, e quatro graus celsius por cinco minutos, e descartar o supernante. Para corrigir as células, adicione 100 microliters de 1%formaldeído recém-preparado e tampão de lavagem.E incubar a quatro graus celsius enquanto está protegido da luz por 10 a 15 minutos. Depois disso, lave as células uma ou duas vezes com 100 microliters de tampão de lavagem. Centrífuga a 500 vezes a gravidade e a 4 graus celsius por cinco minutos.Descarte o supernatante e resuspenque a pelota da célula em 70 microliters de tampão de lavagem. Depois de verificar o desempenho e sensibilidade das configurações do cítômetro executando as contas de calibração, ajuste as tensões de dispersão dianteira e lateral com amostra não manchada, de modo que a população principal esteja na tela e claramente perceptível. Realize compensação manual ou automática usando as amostras manchadas únicas, garantindo o mínimo derramamento sobre a população positiva EGFP no detector DsRed e vice-versa.Usando a fluorescência menos um controles, crie parcelas e afina os portões. Em seguida, ajuste as tensões de dispersão dianteira e lateral com amostra não manchada, de modo que a população principal esteja na tela e claramente discernível. Adquira e grave um mínimo de 10.000 eventos celulares viáveis por amostra.Depois disso, use o software de análise de dados de citometria de fluxo para analisar os dados conforme descrito no protocolo de texto. Resultados representativos para a expressão do HIV-1, produtos não aplicados e emendados, após o tratamento com o inibidor de bromodomína JQ1, mostram que tanto o JQ1 positivo quanto o Tat, aumentam significativamente o percentual de células expressando EGFP. O que é indicativo de transcrições não pálicas.O JQ1 positivo também é visto para aumentar significativamente a porcentagem de células expressando DsRed. E aumentar a proporção de produto emendado para níveis semelhantes aos de Tat. Isso confirma a capacidade do JQ1 positivo de ativar a transcrição e o splicing do HIV.No entanto, o tratamento com um controle estereosomer JQ1 negativo, aboli o efeito positivo do JQ1 na transcrição e emenda do HIV. Uma vez dominado, este método pode ser realizado usando drogas individualmente ou em combinação. Testando sua capacidade de sinergizar eficientemente.O que levaria a uma dose menor da droga e toxicidade. Após cada desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para testar combinações eficientes de medicamentos em modelos primários de latência em amostras de pacientes ex vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

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Imunologia e Infecção

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Determinação de estruturas moleculares de glicoproteínas do envelope HIV usando Cryo-Electron Tomografia e Média Sub-tomogram Automated

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

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Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

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Medição de<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

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