Name: high throughput in vitro assessment of latency reversing agents on hiv transcription and splicing
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing at JoVE.com

Эта работа была поддержана проект Грант APP1129320 и Грант APP1052979 программы от NHMRC Австралии. Мы благодарим д-р Адам Wheatley, д-р Марина Александр, д-р Дженни л Андерсон и Мишель ю. ли за предоставление основных конструкций и советы для успешного завершения этой работы. Мы также благодарим сотрудников DMI потока объекта за их советы и щедрой помощи в поддержании проточный цитометр, используемые в данном исследовании.

Примечание: Процедуры для клонирования, трансформации и последовательности, рассматриваются в других18,19. Протоколы здесь начинаются от трансфекции млекопитающих выражение векторов (рис. 3).
1. transfection клеток HEK293T с дв...

<ol>
	<li>Siliciano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+follow-up+studies+confirm+the+stability+of+the+latent+reservoir+for+HIV-1+in+resting+CD4++T+cells.">Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).</li><li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+8.">Ch. 8.</a> HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).</li><li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transcription+and+latency:+an+update.">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67 (2013).</li><li>Archin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Expression+Within+Resting+CD4++T+Cells+After+Multiple+Doses+of+Vorinostat.">HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat.</a> Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).</li><li>Elliott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+HIV+Transcription+with+Short-Course+Vorinostat+in+HIV-Infected+Patients+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy.">Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> PLoS Pathogens. 10, (2014).</li><li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+Vacc-4x,+recombinant+human+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+vaccination,+and+romidepsin+on+the+HIV-1+reservoir+(REDUC):+a+single-arm,+phase+1B/2A+trial.">Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial.</a> The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).</li><li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panobinostat,+a+histone+deacetylase+inhibitor,+for+latent-virus+reactivation+in+HIV-infected+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy:+a+phase+1/2,+single+group,+clinical+trial.">Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial.</a> The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).</li><li>S&#248;gaard, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Depsipeptide+Romidepsin+Reverses+HIV-1+Latency+In+Vivo.">The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo.</a> PLoS Pathogens. 11, (2015).</li><li>Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+bromodomain+inhibition+activate+transcription+via+transient+release+of+Positive+Transcription+Elongation+Factor+b+(P-TEFb)+from+7SK+small+nuclear+ribonucleoprotein.">Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).</li><li>Boehm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BET+bromodomain-targeting+compounds+reactivate+HIV+from+latency+via+a+Tat-independent+mechanism.">BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism.</a> Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).</li><li>Contreras, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suberoylanilide+hydroxamic+acid+reactivates+HIV+from+latently+infected+cells.">Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).</li><li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+HDAC+inhibitors+in+clinical+development:+effect+on+HIV+production+in+latently+infected+cells+and+T-cell+activation.">Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).</li><li>Wei, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin+induces+HIV+expression+in+CD4+T+cells+from+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy+at+concentrations+achieved+by+clinical+dosing.">Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).</li><li>Blazkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+HIV+production+in+latently+infected,+resting+CD4(+)+T+cells+from+infected+individuals+receiving+effective+antiretroviral+therapy.">Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).</li><li>Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ex+vivo+approaches+distinguish+effective+and+ineffective+single+agents+for+reversing+HIV-1+latency+in+vivo.">New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).</li><li>Yukl, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency+in+isolated+patient+CD4+T+cells+may+be+due+to+blocks+in+HIV+transcriptional+elongation,+completion,+and+splicing.">HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li><li>Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+retention+of+multiply+spliced+HIV-1+RNA+in+resting+CD4+T+cells.">Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells.</a> PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).</li><li>Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transcription+through+an+intron+requires+the+binding+of+an+Sm-type+U1+snRNP+with+intact+stem+loop+II+to+the+splice+donor.">Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor.</a> Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).</li><li>Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Linear+and+Discontinuous+Ribosome+Scanning+Are+Used+for+Translation+Initiation+from+Bicistronic+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+env+mRNAs.">Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs.</a> Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).</li><li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+detection+of+Mycoplasma+contamination+in+cell+culture.">Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).</li><li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency+reversing+agents+act+through+Tat+post+translational+modifications.">HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications.</a> Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).</li><li>Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+latency:+experimental+systems+and+molecular+models.">HIV latency: experimental systems and molecular models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).</li><li>Dahabieh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+non-productive+HIV-1+infection+in+a+T-cell+line+is+driven+by+cellular+activation+state+and+NFkappaB.">Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB.</a> Retrovirology. 11, 17 (2014).</li><li>Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+HIV+reporters+trace+a+population+of+latently+infected+cells+and+enable+their+purification.">Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification.</a> Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).</li><li>Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Latency+Is+Established+Directly+and+Early+in+Both+Resting+and+Activated+Primary+CD4+T+Cells.">HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells.</a> PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).</li><li>Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter-regulatory+region+of+the+major+immediate-early+gene+of+human+cytomegalovirus+responds+to+T-lymphocyte+stimulation+and+contains+functional+cyclic+AMP-response+elements.">The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements.</a> Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).</li><li>Reeves, M., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+of+human+cytomegalovirus+latency+and+reactivation.">Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).</li><li>Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+activation+of+the+cytomegalovirus+enhancer+is+mediated+by+a+viral+transactivator+and+by+T+cell+stimulation.">NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.</a> EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).</li><li>Kula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+HIV-1+RNA+associated+proteome+identifies+Matrin+3+as+a+nuclear+cofactor+of+Rev+function.">Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function.</a> Retrovirology. 8, 60 (2011).</li><li>Kula, A., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Post-Transcriptional+Regulation+of+HIV-1+Gene+Expression.">Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression.</a> Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).</li><li>Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev-ing+up+post-transcriptional+HIV-1+RNA+expression.">Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression.</a> RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).</li><li>Zolotukhin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSF+acts+through+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+mRNA+instability+elements+to+regulate+virus+expression.">PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).</li><li>Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Frequency+of+Latent+HIV-1+in+Resting+CD4(+)+T+Cells+Using+a+Limiting+Dilution+Coculture+Assay.">Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).</li><li>Cary, D. C., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+latent+reservoir+to+achieve+functional+HIV+cure.">Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure.</a> F1000Res. 5, (2016).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+CD4++T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes.">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li><li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+identifies+effective+HIV-1+latency+-+reversing+drug+combinations.">Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).</li><li>Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+interference+antagonizes+proviral+gene+expression+to+promote+HIV+latency.">Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency.</a> Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).</li></ol>

Учитывая трудности в области измерения реактивации вируса ex vivo, широкий спектр в пробирке, которые со временем были разработаны модели для изучения задержка ВИЧ, включая латентно инфицированных клеток T линии (J-латов, АЧ2, U1), основной модели латентной инфекции отдыха) O'Doherty, Левин, Грин и...

Несмотря на эффективную долгосрочную антиретровирусной терапии ВИЧ сохраняется в состоянии скрытой как комплексной Провирус в памяти клеток CD4 + T1. Структура хроматина ВИЧ-1 5' долго терминала повторить (LTR) промоутер и Эпигенетические модификации, такие как метилирование гистонов и диацетилморфина ДНК methyltransferases (DNMT) и гистонов комплексы (HDAC) являются важными механизмами, ведущих к транскрипционный анализ репрессий и, таким образом, задержка после интеграции2,3. Большое разнообразие задержка обратного агентов (МРВ) исследована для их эффективности побудить вирус производства в пробирке и в естественных условиях от латентно инфицированных отдыха CD4 + T клетки4,5,6,7 ,8. Среди МРВ испытания, HDACi (ингибиторы ГДАЦ) и ставка bromodomain ингибиторы (Бетис) вызвать decondensation хроматина и выпуска позитивные транскрипции удлинение фактор b (P-TEFb) соответственно, ведет к последующей освобождает от транскрипционный анализ репрессии на 5' LTR и активации ВИЧ выражение9,10,11,12,13. Однако масштабы оживления, достигнутый этими МРВ был ограничен, как было отмечено лишь незначительное увеличение связанные ячейки unspliced ВИЧ мРНК (нас РНК), свидетельствует о вирусных транскрипции, ex vivo14,15. Важно отметить, что эти МРВ также удалось вызвать снижение частоты латентно инфицированных клеток.
ВИЧ выражение может быть ограничено неэффективных сплайсинга16 , а также дефекты в ядерного экспорта умножить сращивания РНК ВИЧ (РНК MS)17. Таким образом необходимы выявления новых классов МРВ, которые являются более мощными и могут влиять на различные аспекты вируса производства после интеграции. Кроме того развитие новых анализов, которые помогают определение оптимального соединения эффективно обратить задержка не требуется.
Здесь представлен протокол, который использует подход высокой пропускной способностью для функциональной оценки воздействия мероприятий по ВИЧ LTR-driven транскрипции и сплайсинга. Короче говоря новой инициативе LTR двойной цвет репортер системы pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (рис. 1) используется для оценки ВИЧ реактивации проточной цитометрии. В этом флуоресцентные репортер выражение unspliced ВИЧ мРНК (4 КБ) приводит к расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) выражение, в то время как выражение mRNA сращивания (2 kb) приведет к выражению флуоресцентный белок Discosoma sp. красный (DsRed). Вкратце мы использовали флуоресцентный протеин сплавливания Env-EGFP, gp140unc. EGFP, где кодирующая последовательность EGFP был помещен в рамку с ООН рассеченного и усеченной форме конверта (Env). Изменения были введены к удалять сайт расщепления, предотвращая диссоциации Env в gp120 и gp41-EGFP и усечение гп160 белка до трансмембранного домена, создание растворимых Env аналог, который облегчает правильно складывать и выражение EGFP. Выражение в ячейке, Rev локализуется в ядро, где она является посредником при ядерной цитоплазматического экспорта 4 КБ env мРНК через взаимодействие с элементом гибкой rev (RRE). Усечение Env не компромисс RRE, который лежит между gp120 и gp41 и A7 3' сращивания сайта. В этой системе, сплайсинга ВИЧ-1 сращивания доноров 4 (SD4) и сращивания акцептора 7 (SA7) результатов в производстве 2 КБ мРНК кодирования нефункциональные Rev белка, усечены в аминокислоту 38 сливается с DsRed флуоресцентный белок, RevΔ38-DsRed. Вкратце DsRed был вставлен в 2-го экзона Rev на аминокислоты 38 путем перекрытия расширение18. Чтобы облегчить ядерного экспорта unspliced мРНК, млекопитающих выражение вектор кодирования Rev (NL4.3pCMV-Rev) была совместно transfected с помощью флуоресцентных репортер конструкции (рис. 2). Этот уникальный репортер конструкции, описанный здесь полезен в высок объём оценки ВИЧ транскрипции и сращивания, без необходимости использования вирусных векторов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Origin Australia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I (1x) reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi</td>
			<td>Marcherey-Nagel</td>
			<td>740414.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-N1 plasmid</td>
			<td>Clontech (TaKaRa)</td>
			<td>6085-1</td>
			<td>Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDsRed-Express-N1</td>
			<td>Clontech (TaKaRa)</td>
			<td>632429</td>
			<td>Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-RevNL4.3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>115777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JQ1(+)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11187</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JQ1(-)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11232</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol Myristate Acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16561-29-8</td>
			<td>Stock at 100 &#956;g/mL in DMSO; working concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohaemagglutinin (PHA)</td>
			<td>Remel</td>
			<td>HA15/R30852701</td>
			<td>Stock at 1 &#956;g/&#956;L in PBS; working concentration 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vorinostat (VOR)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10009929</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panobinostat (PAN)</td>
			<td>TRC</td>
			<td>P180500</td>
			<td>Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>63581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venor GeM Classic</td>
			<td>Minerva Biolabs</td>
			<td>11-1100</td>
			<td>Mycoplasma Detection Kit, PCR-based</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34976</td>
			<td>Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M pH8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution 37/10 (37%)</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>FA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Diva CS&#38;T Research Beads</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td>Calibration beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559123</td>
			<td>3.0 - 3.4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath solution</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>SA046</td>
			<td>90 g NaCl in 10 L water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAZ-Tabs</td>
			<td>Guest Medical</td>
			<td>H8801</td>
			<td>Chlorine release tablets for disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon 90</td>
			<td>Decon Laboratories Limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)</td>
			<td>Labco</td>
			<td>SODHYPO-5L</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7x</td>
			<td>MPBio</td>
			<td>IM76670</td>
			<td>Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (10 mL)</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.9924.284</td>
			<td>100x16 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>CellStar</td>
			<td>227261</td>
			<td>30x115 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Corning Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (25 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4489-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (10 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4488-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette (5 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4487-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL), sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4470-200EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>12 x 75 mm style, 70 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh</td>
			<td>SEFAR</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titertube Micro test tubes, bulk</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>2239391</td>
			<td>microfacs tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352008</td>
			<td>12x75 mm style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>SVZ4NIOU</td>
			<td>3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (Menzel-Gl&#228;ser)</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>HCS2026</td>
			<td>20 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon TMS</td>
			<td>310528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000487</td>
			<td>with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Diva</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo 10.4.2</td>
			<td>Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>FLUOstar multi-user reader control, version 5.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omega - Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>MARS</td>
			<td>FLUOstar data analysis, version 3.20R2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel:mac 2011</td>
			<td>version 14.0.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Prism 7</td>
			<td>version 7.0c</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput in vitro assessment of latency reversing agents on hiv transcription and splicing

ВИЧ остается неизлечимой вследствие существования водохранилища клетки, который затаивает стабильной и скрытая форма вируса, который остается невидимым для иммунной системы и не является объектом текущего антиретровирусной терапии (корзину). Было показано, что транскрипция и сплайсинга укрепить задержки ВИЧ-1 в отдыха CD4 + Т-клеток. Реверсирование задержки с помощью задержки разворота агентов (МРВ) в «шока и убить» подход подробно изучена в попытке очистить этот водоем, но показал таким образом далеко не любой успех в клинических испытаниях из-за отсутствия развития адекватного малых молекул, которые могут эффективно возмущают это водохранилище. Представленные здесь протокол предоставляет метод для надежно и эффективно оценки задержка разворота агентов (МРВ) на транскрипцию ВИЧ и сплайсинга. Этот подход основан на использовании LTR-driven двойной цвет репортер, который может одновременно измерить эффект ЛРА на транскрипции и сплайсинга проточной цитометрии. Протокол, описанные здесь является адекватным для адэрентных клеток, а также клеток в суспензии. Это полезно для тестирования большое количество наркотиков в высокой пропускной способности системы. Метод является технически простой для выполнения и экономически эффективным. Кроме того использование проточной цитометрии позволяет оценить жизнеспособность клеток и таким образом наркотиков токсичности в то же время.

Представитель результаты показаны на рисунке 5 выражение ВИЧ-1 unspliced (EGFP) и сращивания продуктов (DsRed) после лечения с bromodomain ингибитор СВ1. JQ1(+) и ТАТ значительно увеличилась доля клеток, выражая EGFP (2.18 и 4.13 ФК над ДМСО соответственно; n = 3) свидетельствует о u...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing at JoVE.com

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

Высокая пропускная способность в Vitro оценки задержки вспять агентов на ВИЧ транскрипции и сращивания

Высокая пропускная способность протокол для функциональной оценки ВИЧ эффективного возобновления и распродажа скрытой proviruses описано и применяется тестирование воздействия мероприятий по ВИЧ транскрипции и сплайсинга. Представитель результаты эффекта задержки вспять агентов по инициативе LTR транскрипции и сплайсинга предоставляются.

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Общая цель этой процедуры заключается в оценке in vitro, влияния реверсивных агентов задержки на обработку ВИЧ-мРНК. Протокол обеспечивает простой эффективный и надежный метод оценки, одновременное влияние ЛРА на транскрипцию ВИЧ и сращивание. Этот метод дал представление о способности ЛРВ вызывать реактивацию вируса и расчистку скрытого резервуара.После культивирования клеток поместите 20 000 из них в 100 микролитров среды DMEM, дополненных 10%FBS, и без антибиотиков в колодцах 96-хорошо плоской нижней пластины в течение 24 часов. На следующий день разбавить двойной цвет репортер построить. Tat и Rev ДНК в 50 микролитров сыворотки свободной среды, и смешать осторожно.Аккуратно смешайте липидный реагент, а затем разбавьте 0,65 микролитров его на реакцию в 50 микролитров сыворотки свободной среды. Смешайте осторожно и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Смешайте разбавленный липидный реагент с разбавленной ДНК и аккуратно перемешайте.Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем, обойтись 100 микролитров этого липидного реагента ДНК комплекс падение мудрым, на вершине клеток в каждой хорошо. Рок пластины мягко вперед и назад, чтобы смешать.И инкубировать пластину во влажном инкубаторе, при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение пяти часов. После этого, transfect дополнительные скважины с 100 нанограммов CMV приводом EGFP и DsRed экспресс ДНК плазмид для компенсационных целей. Для начала разбавляют каждую задержку реверсивным агентом в соответствующее рабочее состояние со средой роста.Используя многоканарновую головку трубы, тщательно аспирировать трансфектную среду и заменить ее 100 микролитров среды, содержащих соответствующий реверсивный агент задержки. Инкубация во влажном инкубаторе при 37%celsius с 5%carbon dioxide в течение 48 часов. Чтобы начать окрашивание клеток, используйте многоканарную головку трубы, чтобы добавить 100 микролитров PBS к каждой хорошо.Аккуратно труба голову вверх и вниз примерно в пять раз. Хотя убедившись, чтобы избежать вспенивания, чтобы отделить клетки в средствах массовой информации. Затем перенесите клетки в колодцы 96-ну V-нижней пластины.Центрифуга при 500-времени гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать среды и PBS, не касаясь клеток. Вымойте клетки по крайней мере один раз с 200 микролитров белка и сыворотки свободной PBS.Центрифуга при 500-времени гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Наклоните пластину, чтобы отбросить супернатант и удалить буфер мытья, не касаясь клеток. После этого разбавить фиксированный краситель жизнеспособности в белке и сыворотке свободной PBS в соотношении от 1 до 1000, чтобы подготовить рабочий раствор.Добавить 50 микролитров разбавленного красителя к каждой хорошо, и труба голову вверх и вниз, чтобы смешать. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию. В то время как защищены от света с помощью фольги в течение 10 до 15 минут.Затем мыть клетки один или два раза с 150 микролитров мыть буфера. После этого центрифугу в 500 раз больше гравитации и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, и отбросим супернатант. Чтобы исправить клетки, добавьте 100 микролитров свежеприготовленного 1%формальдегида и вымойте буфер.И инкубировать при четырех градусах по Цельсию в то время как защищены от света в течение 10 до 15 минут. После этого, мыть клетки один или два раза с 100 микролитров мыть буфера. Центрифуга при 500-времени гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.Отбросьте супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в 70 микролитров буфера стирки. После проверки цитометра настройки производительности и чувствительности путем запуска калибровки бисера, настроить вперед и сбоку рассеяния напряжения с неопледеленным образцом, так что основная популяция находится на экране и четко различимы. Выполните ручную или автоматическую компенсацию с помощью одного окрашенных образцов, обеспечивая минимальное перелив положительной популяции EGFP в детектор DsRed и наоборот.Используя флуоресценцию минус один элемент управления, создайте участки и установите ворота. Далее отрегулируйте напряжение вперед и бокового рассеяния с неопляленной выборкой, так что основная популяция находится на экране и четко различима. Приобретайте и записывая не менее 10 000 жизнеспособных событий ячейки на выборку.После этого используйте программное обеспечение для анализа цитометрий данных потока для анализа данных, изложенных в текстовом протоколе. Репрезентативные результаты экспрессии ВИЧ-1, непликированных и сращивания продуктов, после лечения ингибитором бромодомаина J-1, показывают, что как положительный, так и Tat, значительно увеличивают процент клеток, выражаюющих EGFP. Что свидетельствует о неразлиценные стенограммы.Также наблюдается значительное увеличение доли клеток, выражаюющих DsRed. И увеличить долю сращивания продукта до тех же уровней, как Тат. Это подтверждает способность J'1 положительно включить транскрипцию ВИЧ и сращивание.Тем не менее, лечение с помощью стереоизомера контроля J'1 отрицательный, отменяет положительное влияние J-1 на транскрипцию ВИЧ и сращивания. После освоения, этот метод может быть осуществлен с использованием наркотиков индивидуально или в комбинации. Тестирование на их способность эффективно синхронизировать.Что приведет к снижению дозы препарата и токсичности. После каждого развития, этот метод проложил путь для тестирования эффективных комбинаций наркотиков в первичных моделях задержки в образцах ex vivo пациента.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Определение молекулярной структуры гликопротеинов ВИЧ Конверт использованием крио-электронной томографии и автоматизированных Sub-томограмма усреднения

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

В пробирке раздевания ВИЧ-1 сердечников

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Изображений ВИЧ-1 Envelope-индуцированной Вирусологические Synapse и сигнализации на синтетической Бислои липидов

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Анализ in vitro для оценки влияния иммунорегуляторных Пути на ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток эффекторной функцией

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Быстрого скрининга ВИЧ обратной транскриптазы и ингибиторы интегразы

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Высокая техника Пропускная Флуорометрический по оценке фагоцитоз макрофагов и полимеризации актина

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Высокая пропускная способность измерения внеклеточной ДНК-релиз и количественный NET Формирование в нейтрофилах человека<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Высокая пропускная способность гена Tagging в<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Измерение<em&gt; In Vitro</em&gt; Интеграция активность ВИЧ-1 Preintegration Комплексы

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...