Name: visualizing adhesion formation in cells by means of advanced spinning disk-total internal reflection fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-21T14:00:00
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Nous remercions grandement les scientifiques de l’université médicale centre Hamburg-Eppendorf pour nous soutenir avec des échantillons pour évaluation. À savoir, nous remercions Sabine Windhorst de cellules NIH3T3, Andrea Mordhorst pour YFP-Vinculine et Maren Rudolph pour DP-Lifeact.

1. préparation des cellules
<ol><li>Deux jours avant l’expérience, les semences 3 * 105 HeLa ou NIH3T3 cellules dans 2 mL de milieu de culture complet / puits d’une plaque de 6 puits culture cellulaire. Veiller à ce que les cellules sont traitées dans une hotte à flux laminaire tout au long de ce protocole.</li>
	<li>Un jour avant l’expérience, préparer les réactifs de transfection selon les recommandations du fabricant ou un protocole déterminé empiriquement, par exemple:<ol>
<li>Di...

<ol>
	<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Zobiak, B., Failla, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+spinning+disk-TIRF+microscopy+for+faster+imaging+of+the+cell+interior+and+the+plasma+membrane.">Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).</li><li>Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+vesicle+behaviour+assessed+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy.+present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy.">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).</li><li>Trache, A., Lim, S. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells.">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).</li><li>Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+protein+dynamics+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Partridge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+attachment+and+generation+of+mature+focal+adhesions+by+integrin-containing+filopodia+in+cell+spreading.">Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+analysis+of+cell+spreading+on+matrix-coated+surfaces+reveals+two+distinct+cell+states+and+STEPs.">Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+&#945;-actinin+orchestrate+the+assembly+and+maturation+of+nascent+adhesions+in+a+myosin+II+motor-independent+manner.">Actin and &#945;-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner.</a> Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).</li><li>Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-associated+complexes+form+hierarchically+with+variable+stoichiometry+in+nascent+adhesions.">Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions.</a> Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).</li><li>Sun, Z., Guo, S. S., F&#228;ssler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+mechanotransduction.">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li><li>Chen, B. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li><li>Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+superresolution+via+multiangle+TIRF+microscopy+with+sequential+imaging+and+photobleaching.">Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).</li><li>Boulanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+high-resolution+3D+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+by+incidence+angle+scanning+and+azimuthal+averaging.">Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).</li></ol>

Dans le présent document a été présenté la première mise en œuvre réussie de la SD et TIRF microscopie dans une configuration adaptée pour réaliser des expériences d’imagerie de cellules vivantes, c'est-à-dire taux d’acquisition élevée tels que 2 cheminées d’image SD-FRBR / minute à 3 différents stade postes, correspondant à un total de 168 images (environ 3 images par seconde), ont été acquises. Les microscopes de SD-FRBR quelques qui ont été décrits précédemment...

Nos jours, les techniques de microscopie optique fournissant l’imagerie haute/super résolution en fixe et spécimen vivant sont développent rapidement. Techniques de super-résolution telles que stimulent d’émission microscopie d’illumination épuisement (STED), structuré (SIM) et la microscopie de photoactivation localisation (PALM) ou microscopie directes de reconstruction stochastique optique (STORM), respectivement, sont disponible dans le commerce et permettent l’imagerie des structures subcellulaires, montrant des détails presque à l’échelle moléculaire1,2,3,4,5,6. Cependant, ces approches ont toujours limité applicabilité pour des expériences d’imagerie live dont grands volumes doivent être visualisés avec plusieurs frames par seconde vitesse d’acquisition. Variétés des processus hautement dynamiques régies par l’intermédiaire de la membrane plasmique, par exemple , endo- / exocytose, d’adhérence, de migration ou de signalisation, se déroulent à haute vitesse dans les grands volumes cellulaires. Récemment, afin de combler cette lacune, une technique de microscopie intégrée a été proposée filature appelé disque-FRBR (SD-FRBR)7. En détail, microscope TIRF permet spécifiquement isoler et localiser la membrane plasmique8,9, tandis que la microscopie SD est parmi les plus sensibles et rapide vivent des techniques d’imagerie pour la visualisation et le suivi des organites subcellulaires dans le cytoplasme10,11. La combinaison des deux techniques d’imagerie en une seule configuration ont déjà été réalisée dans les dernières12,13, cependant, le microscope présenté ici (Figure 1) enfin répond aux critères pour effectuer des expériences de SD-FRBR imageries live des processus susmentionnés à 3 images par seconde vitesse. Ce microscope étant disponible dans le commerce, l’objectif de ce manuscrit est de décrire dans le détail et offrir des outils open source et des protocoles d’acquisition d’images, enregistrement et visualisation associée à la microscopie SD-FRBR.
La configuration est basée sur un microscope inversé raccordé à balayage deux appareils via les ports indépendants - le port gauche est lié à l’unité de la SD et le port arrière pour unité scanner pour FRBR et photo-activation/blanchiment des expériences. Jusqu'à 6 lasers (405/445/488/515/561/640 nm) peut être utilisée pour l’excitation. Pour l’excitation et la détection du signal de fluorescence, soit un 100 x / NA1.45 huile ou x 60 / NA1.49 huile objectif FRBR, respectivement, ont été employées. La lumière émise est divisée par un miroir dichroïque (561 nm de long-pass ou 514 nm de long-pass) et filtrée par divers filtres passe-bande (55 nm de large centrée à 525 nm, 54 nm de large centrée à 609 nm pour la fluorescence verte et rouge, respectivement) placés devant les deux cam EM-CCD enchères électroniques inversées. Veuillez noter que des détails plus techniques sur le programme d’installation sont répertoriés dans Zobiak et al. 7. dans la configuration de la FRBR, l’unité de la SD est déplacée hors du trajet optique dans environ 0,5 s afin que les deux caméras mêmes peuvent être utilisés pour la détection, ce qui permet une commutation plus rapide entre les deux modalités d’imagerie comparées à environ 1 s qui a été rapporté dans le passé13 < /C2 >. Cette fonction permet l’acquisition simultanée de deux canaux, donc 4 canaux SD-FRBR imagerie à précédemment vitesse inégalée et exactitude peut être effectuée. Par ailleurs, l’alignement entre les images SD et FRBR est inutile. Alignement de l’image entre les deux caméras, toutefois, doit être vérifié avant de commencer l’expérience et corrigé si nécessaire. Dans le protocole suivant, une routine de correction d’enregistrement a été mis en œuvre dans une macro autonome écrite d’ImageJ. En outre, la macro a été principalement conçue pour permettre une visualisation simultanée de SD - et datasets FRBR malgré leur dimensionnalité différente. Le logiciel d’acquisition elle-même n’a pas fourni ces fonctionnalités.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Microscope and accessories</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SD-TIRF microscope</td>
			<td >Visitron Systems</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ti with perfect focus system</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td>Inverted microscope stand</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CSU-W1 T2</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td ></td>
			<td>Spinning disk unit in dual-camera configuration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iLAS2&#160;</td>
			<td >Roper Scientific</td>
			<td ></td>
			<td>TIRF/FRAP scanner</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Evolve&#160;</td>
			<td >Photometrix</td>
			<td ></td>
			<td>EM-CCD cameras</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PiezoZ stage</td>
			<td >Ludl Electronic Products</td>
			<td ></td>
			<td>Motorized Z stage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bioprecision2 XY stage</td>
			<td >Ludl Electronic Products</td>
			<td ></td>
			<td>Motorized XY stage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stage top incubation chamber</td>
			<td >Okolab</td>
			<td >Bold Line</td>
			<td>Temperature, CO2 and humidity supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cervical cancer cells</td>
			<td >DSMZ</td>
			<td >ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NIH3T3 fibroblasts</td>
			<td >DSMZ</td>
			<td >ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OptiMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TurboFect</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >R0531</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ascorbic acid (AA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well cell culture plate</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bottom dishes</td>
			<td >MatTek</td>
			<td >P35G-1.5-10-C</td>
			<td>35mm, 0.17mm glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin, bovine plasma</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer improved chamber</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck beads</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasmids</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RFP-Lifeact</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >YFP-Vinculin</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software and plugins</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VisiView</td>
			<td >Visitron Systems</td>
			<td ></td>
			<td>Version 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Version 1.52c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Turboreg plugin</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Macro &#34;SD-TIRF_helper_JoVE.ijm&#34;</td>
			<td >this publication</td>
			<td ></td>
			<td>https://github.com/bzobiak/ImageJ</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Volocity</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td >Version 6.2.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing adhesion formation in cells by means of advanced spinning disk-total internal reflection fluorescence microscopy

Dans les cellules vivantes, les processus tels que la formation d’adhérences impliquent des changements structurels importants dans la membrane plasmique et l’intérieur de la cellule. Afin de visualiser ces événements très dynamiques, on a combiné les deux techniques de microscopie optique complémentaire permettant l’imagerie rapide des échantillons vivants : filature de la microscopie (SD) de disque pour l’enregistrement de volume rapide et haute résolution et de la réflexion totale interne microscopie de fluorescence (FRBR) pour la localisation précise et visualisation de la membrane plasmique. Un protocole d’imagerie complète et s’affichera pour les guider dans la préparation de l’échantillon, l’étalonnage de microscope, formation d’images et acquisition, résultant en une série d’imagerie live avec haute résolution spatio-temporelle du SD-FRBR multicolore. Toutes les étapes de post-traitement image nécessaire pour générer multidimensionnelle datasets imagerie direct, c'est-à-dire l’enregistrement et la combinaison des canaux individuels, sont fournis dans une macro autonome écrite pour le logiciel open source ImageJ. L’imagerie des protéines fluorescentes au cours de l’initiation et la maturation des complexes de l’adhérence, ainsi que la formation du réseau d’actine du cytosquelette, a été utilisé comme une preuve de principe pour cette approche originale. La combinaison de la microscopie 3D de haute résolution et de la FRBR a fourni une description détaillée de ces processus complexes dans l’environnement cellulaire et, en même temps, une localisation précise des molécules associées aux membranes détecté avec une haute rapport de signal-à-fond.

Afin de montrer le potentiel de l’imagerie de SD-FRBR, qu'un essai a été développé qui devrait révéler l’organisation spatio-temporelle des complexes d’adhérence cellule-matrice et leur interaction avec le cytosquelette au cours de l’adhésion cellulaire. Par conséquent, adhérent HeLa ou, alternativement, NIH3T3 cellules ont été transfectées avec YFP-Vinculine et DP-Lifeact pendant 18 à 24 heures, trypsinisées et boutonnée sur plats bas de verre enduit de la fibrone...

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Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Un microscope perfectionné permettant de rapides et de haute résolution d’imagerie de la membrane plasmique isolée et le volume intracellulaire environnant, est présenté. L’intégration de la filature de microscopie de fluorescence de réflexion interne disque et total dans un seul montage permet de vivre des expériences d’imagerie à des vitesses d’acquisition élevée jusqu'à 3,5 s par la pile de l’image.

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

La microscopie TIRF à disque filature peut être un outil utile pour étudier le rôle des protéines pendant la formation du réseau cytosquelettique. Cette technique a permis l’imagerie tridimensionnelle des approches cellulaires rapides qui se produisent dans la cellule et en même temps la localisation précise de la molécule de fluorescence qui sont placées à la membrane plasmatique. Cette méthode peut donner un aperçu de domaines de recherche comme la microbiologie, la biologie cellulaire et toutes les branches où il est important d’étudier l’interaction entre la membrane plasmatique et l’environnement cellulaire.Cette méthode peut être étendue à ces expériences d’imagerie en direct où il est important de localiser les structures de la membrane plasmatique et où vous voulez également maintenir une haute résolution du volume cellulaire restant. Les choses cruciales que l’on doit considérer sont le choix de la ligne cellulaire appropriée pour configurer l’éclairage TIRF et les autres paramètres d’imagerie et de trouver l’accent des cellules transfectées. La démonstration visuelle de ce protocole permettrait certainement d’éviter les problèmes de manipulation des cellules lors de l’acquisition d’images.Deux jours avant l’expérience, les graines 3000 cellules HELA ou NIH 3T3 en deux millilitres de milieu de croissance complète dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de six puits. Le lendemain, préparez les reagents transfection. Tout d’abord, diluer un microgramme de DP Livact et un microgramme de vinculine YFP dans un total de 200 microlitres de milieu sérique réduit.Vortex le reagent transfection brièvement. Ajouter ensuite quatre microlitres du mélange à 200 microlitres d’ADN. Vortex les reagents à nouveau, puis incuber le mélange de transfection pendant 15 à 20 minutes à température ambiante.Après l’incubation, ajouter l’ensemble du mélange de transfection directement aux cellules. Mélanger les puits en secouant la plaque, puis remettre dans l’incubateur. Le jour de l’expérience, préparez l’échantillon pour l’imagerie en direct en enduire d’abord un plat de fond en verre de 35 millimètres avec une solution de 10 microgrammes par millilitre de fibronectine dans PBS.Laisser la solution sur la surface vitrée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l’enlever et laisser sécher l’air du plat. Ensuite, diluer une solution de perles multi-fluorescentes de 0,1 micron de diamètre à une densité de 1,8 milliard de particules par millilitre dans l’eau distillée. Ajoutez la solution à la surface en verre enduit de fibronectine pendant 30 à 60 secondes.Retirez ensuite la solution et laissez sécher l’air du plat. La précoating des plats avec des perles fluorescentes n’est nécessaire que pour deux raisons, d’abord si vous voulez trouver le plan TIRF avant d’ensemencer les cellules ou d’acquérir une image de perle bicolore pour l’enregistrement de l’image. Maintenant, préparez un milieu de croissance anti-oxydant en ajoutant 0,1 solution d’acide ascorbique molaire à une concentration finale de 0,1 millimolaire dans le milieu de croissance.Préjuyons les médias en le plaçant dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules avec deux millilitres de PBS et ajoutez 250 microlitres de Trypsin EDTA à chaque puits de la plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et attendre deux à trois minutes jusqu’à ce que les cellules soient complètement détachées.Resuspendez soigneusement les cellules en un millilitre de milieu de croissance anti-oxydant préchauré et ajoutez-les à quatre millilitres supplémentaires du milieu dans un tube de culture cellulaire de 15 millilitres. Placez la suspension cellulaire avec un couvercle légèrement ouvert dans un incubateur fixé à 37 degrés Celsius tamponné avec 5% de dioxyde de carbone. Pour commencer, commencer le contrôle environnemental du microscope pour atteindre des conditions stables de culture cellulaire.Placez ensuite le plat de fond en verre contenant un millilitre de milieu de croissance anti-oxydant préchauffé dans le porte-échantillon du microscope préchauffé. Ensuite, dans le logiciel d’imagerie, configurer les paramètres d’acquisition au microscope. Réglez l’intervalle de temps d’acquisition à 30 secondes et la durée entre 60 et 90 minutes.En outre, activez la fonction d’autofocus de l’autofocus basé sur le matériel pour chaque point de temps en fixant la valeur à un. Réglez maintenant l’exposition de la caméra à 200 millisecondes, le niveau de gain à 500, et la puissance laser à 20% pour chaque canal. Des niveaux de gain élevés, un faible temps d’exposition et une faible puissance laser sont recommandés pour réduire la phototoxicité.Ensuite, réglez la pile Z pour les canaux de disque filature à 10 microns avec espacement de 0,4 micron, puis réglez le décalage inférieur à zéro de sorte que le plan le plus bas sera la position de mise au point du matériel autofocus et désactiver les piles Z pour les canaux TIRF. Enfin, activez les positions de l’étape de fonction multi-points. Cela permettra d’enregistrer jusqu’à trois positions sur un intervalle de 30 secondes.Maintenant, trouvez les perles fluorescentes avec éclairage épifluorescent, activez un canal TIRF et réglez l’angle d’éclairage à une valeur qui dénote l’éclairage TIRF. Ensuite, activez l’autofocus en appuyant sur le bouton du panneau de microscope et ajustez la mise au point avec la roue offset. Une fois au point, acquérir un ensemble de données bicolores à l’aide de TIRF 488 et TIRF 561 pour l’enregistrement d’image basé sur les perles ultérieures.Retirer les cellules de l’incubateur et mélanger la suspension cellulaire en inversant le tube fermé deux à trois fois. Appliquez ensuite un millilitre des cellules sur le plat d’imagerie. Trouvez rapidement des cellules doublement transfectées avec un éclairage épifluorescent de faible niveau.Une fois trouvés, centrez les cellules dans l’aperçu de la caméra en direct à l’aide de l’éclairage du champ lumineux et marquez la position. Ensuite, trouvez un à deux points d’intérêt supplémentaires, enregistrez-les sur la liste des positions et commencez l’acquisition de données en cliquant sur le bouton séquence. Au début, les cellules peuvent facilement se détacher en raison du mouvement de la scène, il est donc préférable de définir quatre à cinq positions et plus tard jeter une ou deux.Afin de générer une hyperstack sans inscription aux Fidji, téléchargez et enregistrez d’abord le fichier fourni SD-TIRF_helper_jove. ijm dans les macros subfolder Fidji. Exécutez la macro en cliquant sur la commande de menu en commençant par les plugins puis les macros et enfin exécuter.Si les canaux de couleur ont besoin d’une correction d’enregistrement, sélectionnez l’option et créez une nouvelle référence d’enregistrement basée sur les perles connue sous le nom de fichier historique. Ensuite, importez les données avec l’importateur de bioformats et choisissez hyperstack comme option de visualisation. Chargez l’ensemble de données d’image, sélectionnez la série de disques filatures dans la première étape et la série TIRF dans la deuxième étape.À ce stade, les Fidji afficheront les données triées par canal et position scénique. Appliquez la correction d’enregistrement aux canaux respectifs en chargeant le fichier historique prédéterminé. Sélectionnez ensuite la table de recherche de couleurs désirée pour chaque disque de filature et canal TIRF et fusionnez-les en une seule hyperstack multidimensionnelle.Pendant le traitement des images TIRF, un certain nombre d’avions zed sont ajoutés au plan inférieur et ce nombre correspond au nombre d’avions dans les ensembles de données de disque filature. C’est très important pour la représentation visuelle de l’hyperstack final. À l’aide de la configuration décrite dans cette vidéo, les cellules exprimant la DP et la DP ont été sélectionnées et leur processus d’adhérence a été observé pendant un timelapse de 60 minutes.Comme prévu, les cellules étaient de forme ronde et n’adhéraient que faiblement au début avec des saillies membranaires sentant l’environnement et prenant contact avec le substrat. Le contact de matrice cellulaire s’est renforcé rapidement lors de la formation des adhérences dites naissantes. Au fil du temps, les complexes d’adhérence ont agrandi et mûri aux adhérences focales.Ces structures allongées étaient principalement apparentes à la périphérie de la cellule. Ceci a résulté des forces qui ont été exercées par des fibres d’actomyosin qui ont induit le renforcement des adhérences de matrice cellulaire aussi bien que le regroupement des fibres d’actine. La cellule s’est également aplatie à la suite de la formation du réseau d’actine.La vitesse d’acquisition dépend des paramètres suivants, de l’intervalle de temps, du temps d’exposition, du nombre d’avions zed et du nombre de positions. Il est donc très important d’optimiser ces paramètres pour des taux d’acquisition élevés. La mise en œuvre de la nouvelle technologie de disque de filature transformera la microscopie tirf de disque de rotation en nouvelle technique de microscopie de super résolution qui permettra l’imagerie à des taux temporels élevés.La microscopie à disque filature est une technique très puissante pour étudier les processus qui se produisent entre l’intérieur cellulaire et la membrane cellulaire. On nous a montré que nous pouvons suivre la dynamique de la vésicule en acquérant de très grandes piles d’images en quelques secondes. La lumière laser collimée est dangereuse pour les yeux.Ne jamais regarder directement dans le faisceau et utiliser les précautions de sécurité de l’instrument pour éviter l’exposition directe à la lumière.

Research

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