Name: visualizing adhesion formation in cells by means of advanced spinning disk-total internal reflection fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy at JoVE.com

אנו מודים מאוד הקהילה המדעית של אוניברסיטת רפואי במרכז המבורג-גלאים לתמיכה אותנו עם דגימות להערכה. כלומר, אנחנו תודה סבין Windhorst תאי NIH3T3, אנדריאה Mordhorst עבור YFP-Vinculin ו- Maren רודולף עבור RFP-Lifeact.

1. הכנת תאים
<ol><li>יומיים לפני הניסוי, זרע תאים 3 * 105 הלה או NIH3T3 2 מ של מדיום הגידול מלא בכל טוב של צלחת 6-ובכן תא-תרבות. ודא כי התאים מתבצע במסגרת תא למינארי לאורך כל פרוטוקול זה.</li>
	<li>יום אחד לפני הניסוי, הכן את ריאגנטים תרביות תאים על פי ההמלצות של היצרן או פרוטוקול מדעית נחוש, למשל:<o...

<ol>
	<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Zobiak, B., Failla, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+spinning+disk-TIRF+microscopy+for+faster+imaging+of+the+cell+interior+and+the+plasma+membrane.">Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).</li><li>Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+vesicle+behaviour+assessed+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy.+present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy.">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).</li><li>Trache, A., Lim, S. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells.">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).</li><li>Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+protein+dynamics+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Partridge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+attachment+and+generation+of+mature+focal+adhesions+by+integrin-containing+filopodia+in+cell+spreading.">Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+analysis+of+cell+spreading+on+matrix-coated+surfaces+reveals+two+distinct+cell+states+and+STEPs.">Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+&#945;-actinin+orchestrate+the+assembly+and+maturation+of+nascent+adhesions+in+a+myosin+II+motor-independent+manner.">Actin and &#945;-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner.</a> Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).</li><li>Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-associated+complexes+form+hierarchically+with+variable+stoichiometry+in+nascent+adhesions.">Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions.</a> Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).</li><li>Sun, Z., Guo, S. S., F&#228;ssler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+mechanotransduction.">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li><li>Chen, B. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li><li>Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+superresolution+via+multiangle+TIRF+microscopy+with+sequential+imaging+and+photobleaching.">Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).</li><li>Boulanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+high-resolution+3D+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+by+incidence+angle+scanning+and+azimuthal+averaging.">Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).</li></ol>

נייר זה הוצג יישומו המוצלח הראשון של מיקרוסקופיית SD ו- TIRF תצורה מתאים לביצוע ניסויים הדמיה התא בשידור חי, כלומר רכישה גבוהה המחירים כגון 2 SD-TIRF אוספי תמונות לדקה בשלב שונה 3 עמדות, המקביל סך של מסגרות 168 (בסביבות 3 מסגרות לשנייה), נרכשו. מיקרוסקופים SD-TIRF כמה שהיו שתוארה לעיל12<s...

הימים שלנו, מיקרוסקופ אור טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה/סופר ב קבוע מתן הדגימה החיה מפתחים במהירות. סופר-רזולוציה טכניקות כגון גירוי פליטה דלדול (STED), הבנוי תאורה מיקרוסקופ (SIM), צילום-הפעלת מיקרוסקופ לוקליזציה (דקל) או מיקרוסקופית ישירה סטוכסטי שחזור אופטי (סערה), בהתאמה, הם זמינים מסחרית ולאפשר הדמיה של מבנים subcellular מציג פרטים כמעט על סולם מולקולרית1,2,3,4,5,6. עם זאת, גישות אלה עדיין מוגבלת הישימות לניסויים הדמיה בשידור חי, שבו צריך כמויות גדולות, ניתן לאבחן עם מספר מסגרות לכל השני מהירות הרכישה. סוגים שונים של תהליכים דינאמיים מאוד מוסדרים דרך קרום פלזמה, למשל אנדו- / אקסוציטוזה, הדבקות, העברה או איתות, מתרחשות במהירות גבוהה תוך תאית בנפחים גדולים. לאחרונה, על מנת למלא את הפער הזה, טכניקה משולבת מיקרוסקופ היה המוצע ספינינג שנקרא דיסק-TIRF (SD-TIRF)7. בפירוט, מיקרוסקופ TIRF היתרי במיוחד לבודד, בתרגום של קרום פלזמה8,9, בעוד SD מיקרוסקופ הוא אחד של רגיש ביותר ומהיר לחיות טכניקות הדמיה הדמיה ומעקב של organelles subcellular10,הציטופלסמה11. השילוב של שתי טכניקות הדמיה בכיוונון יחידה כבר כבר הבנתי את העבר12,13, לעומת זאת, המיקרוסקופ המובאת כאן (איור 1) סוף סוף עונה על הקריטריונים כדי לבצע ניסויים SD-TIRF הדמיה בשידור חי התהליכים הנ ל- 3 מסגרות לכל השני מהירות. מאז מיקרוסקופ זה זמין מסחרית, המטרה של כתב יד זה היא לתאר בפרטים ולספק כלי קוד פתוח ופרוטוקולים ייבוא תמונות, רישום של ויזואליזציה הקשורים עם מיקרוסקופ SD-TIRF.
הגדרת מבוסס על מיקרוסקופ הפוכה מחוברת סריקה שתי יחידות באמצעות יציאות עצמאיות - הנמל שמאל קשורה יחידת SD והנמל בחזרה את יחידת הסורק עבור TIRF וצילום-הפעלה/הלבנת-ניסויים. עד 6 לייזרים (405/445/488/515/561/640 ננומטר) יכול לשמש עירור. עבור עירור וזיהוי של האות פלורסצנטיות, או 100 x / NA1.45 שמן או 60 x / NA1.49 שמן TIRF המטרה, בהתאמה, יש כבר מועסקים. האור הנפלט הוא מפוצל על ידי מראה ודיקרואיק זוהר (561 nm פס ארוך או לונג nm 514-מעבר...), מסוננים על ידי הלהקה לעבור מסננים שונים (55 ננומטר רחב מרוכז בכל 525 nm, 54 nm רחב מרוכז בכל 609 ננומטר על ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק ואדום, בהתאמה) הניח לפני EM-CCD מצלמת שני תקופות. הינכם מתבקשים לשים לב כי לקבלת פרטים טכניים נוספים אודות הגדרת רשומים Zobiak. et al. 7. בתצורה TIRF, יחידת SD עזב את נתיב האור בתוך בערך 0.5 s כך שתי מצלמות אותו יכול לשמש לצורך זיהוי, ומאפשר מעבר מהיר יותר בין שתי שיטות הדמיה בהשוואה בסביבות 1 s שדווח בעבר13 < /c2 >. תכונה זו מאפשרת רכישה סימולטני ערוץ כפול, ובכך 4 ערוצי SD-TIRF הדמיה ב בעבר לא תואמות מהירות, דיוק יכול להתבצע. יתר על כן, יישור בין תמונות SD ו- TIRF אינה נחוצה. יישור תמונה בין שתי מצלמות, אך יש לבדוק לפני תחילת הניסוי, תוקן במידת הצורך. בפרוטוקול הבא, שיגרה תיקון הרישום בוצע במאקרו ImageJ עצמית בכתב. יתר על כן, המאקרו בעיקר נועדה לאפשר ויזואליזציה סימולטני של SD, TIRF datasets למרות שלהם dimensionality שונים. רכישת התוכנה עצמה לא סיפקו תכונות אלה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Microscope and accessories</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SD-TIRF microscope</td>
			<td >Visitron Systems</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ti with perfect focus system</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td>Inverted microscope stand</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CSU-W1 T2</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td ></td>
			<td>Spinning disk unit in dual-camera configuration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iLAS2&#160;</td>
			<td >Roper Scientific</td>
			<td ></td>
			<td>TIRF/FRAP scanner</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Evolve&#160;</td>
			<td >Photometrix</td>
			<td ></td>
			<td>EM-CCD cameras</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PiezoZ stage</td>
			<td >Ludl Electronic Products</td>
			<td ></td>
			<td>Motorized Z stage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bioprecision2 XY stage</td>
			<td >Ludl Electronic Products</td>
			<td ></td>
			<td>Motorized XY stage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stage top incubation chamber</td>
			<td >Okolab</td>
			<td >Bold Line</td>
			<td>Temperature, CO2 and humidity supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cervical cancer cells</td>
			<td >DSMZ</td>
			<td >ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NIH3T3 fibroblasts</td>
			<td >DSMZ</td>
			<td >ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OptiMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TurboFect</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >R0531</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ascorbic acid (AA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well cell culture plate</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bottom dishes</td>
			<td >MatTek</td>
			<td >P35G-1.5-10-C</td>
			<td>35mm, 0.17mm glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin, bovine plasma</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer improved chamber</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck beads</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasmids</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RFP-Lifeact</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >YFP-Vinculin</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software and plugins</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VisiView</td>
			<td >Visitron Systems</td>
			<td ></td>
			<td>Version 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Version 1.52c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Turboreg plugin</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Macro &#34;SD-TIRF_helper_JoVE.ijm&#34;</td>
			<td >this publication</td>
			<td ></td>
			<td>https://github.com/bzobiak/ImageJ</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Volocity</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td >Version 6.2.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing adhesion formation in cells by means of advanced spinning disk-total internal reflection fluorescence microscopy

בתאים חיים, תהליכים כגון היווצרות אדהזיה כרוך ביצוע שינויים מבניים נרחב קרום פלזמה ואת החלק הפנימי של התא. על מנת להמחיש את האירועים דינמי מאוד, חברו יחד שתי שיטות משלימות מיקרוסקופ אור לאפשר הדמיה מהיר של דגימות בשידור חי: ספינינג דיסק מיקרוסקופ (אס די) עבור ברזולוציה גבוהה ומהירה נפח הקלטה של החזרה גמורה מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) עבור לוקליזציה מדויק והדמיה של קרום פלזמה. פרוטוקול דימות מקיף ושלם יוצג עבור המנחה דרך הכנת הדוגמא, מיקרוסקופ כיול, התמונה היווצרות ורכישה, וכתוצאה מכך צבע רב SD-TIRF בשידור חי סדרת הדמיה עם רזולוציה גבוהה-עתיים. כל השלבים עיבוד דפוס תמונה נחוץ ליצירת רב ממדית datasets הדמיה בשידור חי, כלומר רישום ושילוב של והערוצים, ניתנים במאקרו עצמית בכתב עבור תוכנת קוד פתוח ImageJ. ההדמיה של חלבונים פלורסנט במהלך החניכה, ההבשלה של מתחמי אדהזיה, כמו גם היווצרות של הרשת cytoskeletal אקטין, שימש הוכחה של עיקרון עבור גישה חדשנית זו. השילוב של מיקרוסקופיית תלת-ממד ברזולוציה גבוהה TIRF סיפק תיאור מפורט של התהליכים המורכבים האלה בתוך הסביבה התאית, באותו הזמן, לוקליזציה מדויק של מולקולות ממברנה-הקשורים מזוהה עם גבוה יחס אות-כדי-ברקע.

כדי להראות הפוטנציאל של SD-TIRF הדמיה, שוזמינותו פותחה זה לחשוף את הארגון-עתיים תא מטריצה אדהזיה מתחמי והאינטראקציה שלהם עם שלד התא במהלך אדהזיה הסלולר. לכן, מחסידי הלה או, לחילופין, NIH3T3 התאים היו transfected עם YFP-Vinculin ו- RFP-Lifeact עבור ה' 18-24, trypsinized, נזרע על גבי זכוכית מצופים fibronectin התח...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

מיקרוסקופיה TIRF דיסק מסתובב יכול להיות כלי שימושי לחקר התפקיד של חלבון במהלך היווצרות רשת cytoskeletal. טכניקה זו אפשרה הדמיה תלת מימדית של גישות תאיות מהירות המתרחשות בתא ובה בעת ובעונה אחת לוקליזציה מדויקת של מולקולת פלואורסצנטיות המוצבת בקרום הפלזמה. שיטה זו יכולה לספק תובנה לתחומי מחקר כמו מיקרוביולוגיה, ביולוגיה של התא, וכל הענפים שבהם חשוב לחקור את האינטראקציה בין קרום הפלזמה לסביבה התאית.שיטה זו יכולה להיות מורחבת לאותם ניסויי הדמיה חיים שבהם חשוב לוקליזציה של המבנים בממברנת הפלזמה והיכן שאתה גם רוצה לשמור על רזולוציה גבוהה של נפח התא הנותר. הדברים הקריטיים שיש לקחת בחשבון הם הבחירה של קו התא הנכון כדי להגדיר את תאורת TIRF ואת הפרמטרים הדמיה אחרים כדי למצוא את המוקד של תאים מנוקד. ההדגמה החזותית של פרוטוקול זה בהחלט תסייע למנוע בעיות בטיפול בתאים במהלך רכישת תמונה.יומיים לפני הניסוי, זרע 3, 000 HELA או NIH 3T3 תאים בשני מיליליטר של מדיום צמיחה מלאה לתוך כל באר של צלחת תאים שש באר. למחרת, הכינו את הריג'נטים הטרנס-אדביקים. ראשית, לדלל מיקרוגרם אחד של RFP Livact ומיקרוגרם אחד של YFP וינקולין בסך הכל 200 microliters של מדיום סרום מופחת.וורטקס הטרנסג'נט בקצרה. לאחר מכן מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של התערובת ל-200 מיקרוליטרים של דנ"א. Vortex reagents שוב ולאחר מכן להחריג את תערובת transfection במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, מוסיפים את כל תערובת ההיפוגה ישירות לתאים. מערבבים את בארות על ידי טלטול הצלחת ולאחר מכן למקם בחזרה לתוך החממה. ביום הניסוי, להכין את המדגם להדמיה חיה על ידי ציפוי הראשון צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר עם פתרון 10 מיקרוגרם למיליליטר של פיברונצין ב PBS.השאירו את הפתרון על משטח הזכוכית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואז הסירו אותו ותנו לאוויר המנה להתייבש. לאחר מכן, לדלל תווי חרוזים רב-פלואורסצנטיים בקוטר 0.1 מיקרון לצפיפות של 1.8 מיליארד חלקיקים למיליליטר במים מזוקקים. הוסיפו את הפתרון למשטח הזכוכית מצופה הפיברונאטין למשך 30 עד 60 שניות.לאחר מכן להסיר את הפתרון ולתת את האוויר צלחת להתייבש. צבוע מראש של הכלים עם קדימות פלואורסצנטיות נחוץ רק משתי סיבות, תחילה אם אתה רוצה למצוא את המטוס TIRF לפני זריעת התאים או לרכוש תמונת חרוזים דו צבעונית לרישום תמונה. עכשיו להכין מדיום צמיחה נגד חמצון על ידי הוספת 0.1 תווי חומצה אסקורבית טוחנת בריכוז הסופי של 0.1 מילימולר במדיום הצמיחה.לפני המלחמה התקשורת על ידי הצבתו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS ולהוסיף 250 microliters של טריפסין EDTA לכל באר של הצלחת. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ולחכות שתיים עד שלוש דקות עד התאים מנותקים לחלוטין.תוסיפו את התאים בזהירות למיליליטר אחד של מדיום צמיחה נגד חמצון לפני המלחמה ותוסיפו אותם לארבעה מיליליטר נוספים של המדיום בצינור תרבות תאים של 15 מיליליטר. מניחים את ההשעיה התא עם מכסה פתוח מעט באינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס אגירה עם 5% פחמן דו חמצני. כדי להתחיל, להתחיל את השליטה הסביבתית של המיקרוסקופ כדי להשיג תנאי תרבות תאים יציבים.לאחר מכן מניחים את המנה התחתונה זכוכית המכילה מיליליטר אחד של מדיום צמיחה נגד חמצון מראש לתוך מחזיק המדגם של מיקרוסקופ שחומם מראש. לאחר מכן, בתוכנת ההדמיה, הגדר את הגדרות הרכישה במיקרוסקופ. הגדר את מרווח זמן הרכישה ל- 30 שניות ואת משך הזמן בין 60 ל- 90 דקות.כמו כן, הפעל את פונקציית הפוקוס האוטומטי של הפוקוס האוטומטי המבוסס על חומרה עבור כל נקודת זמן על-ידי הגדרת הערך לנקודה אחת. כעת כווננו את החשיפה למצלמה ל-200 אלפיות שנייה, את רמת ההעליה ל-500 ואת עוצמת הלייזר ל-20% עבור כל ערוץ. רמות רווח גבוהות, זמן חשיפה נמוך וכוח לייזר נמוך מומלץ להפחית פוטוטוקסיות.לאחר מכן, הגדר את מחסנית ה- Z עבור ערוצי הדיסק המסתובב ל- 10 מיקרון עם מרווח של 0.4 מיקרון ולאחר מכן הגדר את ההיסט התחתון לאפס כך שהמישור הנמוך ביותר יהיה מיקום המוקד של פוקוס אוטומטי של החומרה ויהשבית את ערימות ה- Z עבור ערוצי TIRF. לבסוף, הפעל את מיקומי שלב הפונקציות מרובות הנקודות. פעולה זו תאפשר עד שלוש עמדות להירשם על פני מרווח של 30 שניות.עכשיו למצוא את חרוזים פלואורסצנטיים עם תאורה epifluorescent, להפעיל ערוץ TIRF אחד ולהגדיר את זווית התאורה לערך המציין תאורת TIRF. לאחר מכן, הפעילו את הפוקוס האוטומטי על-ידי לחיצה על הלחצן בלוח המיקרוסקופ והתאימים את המוקד באמצעות גלגל ההיסט. לאחר ההתמקדות, רכוש ערכת נתונים דו-צבעית באמצעות TIRF 488 ו- TIRF 561 לרישום תמונה מבוסס חרוזים עוקב.מוציאים את התאים מהאינקובטור ומערבבים את מתלי התא על ידי היפוך הצינור הסגור פעמיים עד שלוש פעמים. לאחר מכן להחיל מיליליטר אחד של התאים על צלחת ההדמיה. מצא במהירות תאים מדבקים כפולים עם תאורת אפיפלורסנט ברמה נמוכה.לאחר שנמצא, מרכז את התאים בתצוגה המקדימה של המצלמה החיה באמצעות תאורת שדה בהיר וסמן את המיקום. לאחר מכן למצוא עוד אחת עד שתי נקודות עניין, לשמור אותם לרשימת הפוזיציות ולהתחיל רכישת נתונים על ידי לחיצה על כפתור הרצף. בהתחלה, התאים יכולים להתנתק בקלות עקב תנועת הבמה ולכן עדיף להגדיר ארבע עד חמש עמדות ומאוחר יותר להשליך אחד או שניים.על מנת ליצור היפרסטאק ללא רישום בפיג'י, הורד תחילה ושמור את הקובץ שסופק SD-TIRF_helper_jove. ijm בפקודות המאקרו של תיקיית המשנה של פיג'י. הפעל את המאקרו על-ידי לחיצה על פקודת התפריט החל בתוספים ולאחר מכן פקודות מאקרו ולבסוף הפעלה.אם ערוצי הצבע זקוקים לתיקון רישום, בחרו באפשרות וצורו הפניה חדשה לרישום מבוססת חרוזים הידועה כקובץ ציון דרך. לאחר מכן, יבא את הנתונים עם יבואן הביופורמאטים ובחר בהיפרסטאק כאפשרות צפייה. טען את ערכת נתוני התמונה, בחר את סדרת הדיסקים המסתובבים בשלב הראשון ואת סדרת TIRF בשלב השני.בשלב זה, פיג'י תציג את הנתונים ממוינים לפי ערוץ ומיקום במה. החל את תיקון הרישום על הערוצים המתאימים על-ידי טעינת קובץ ציון הדרך המוגדר מראש. לאחר מכן בחר את טבלת בדיקת המידע הרצויה עבור כל דיסק מסתובב וערוץ TIRF ומזג אותם לתוך מערכת-יתר רב-מימדית אחת.במהלך העיבוד של תמונות TIRF, מספר מטוסי zed מתווספים למישור התחתון ומספר זה תואם למספר המישורים בערכות הנתונים של הדיסק המסתובב. זה מאוד חשוב לייצוג החזותי של ההיפרסטאק האחרון. באמצעות ההתקנה המתוארת בסרטון זה, נבחרו תאים מבטאי YFP ו- RFP ותהליך ההיתוך שלהם נצפה במהלך 60 דקות של timelapse.כצפוי, התאים היו עגולים בצורתם ורק חסידים חלשים בהתחלה עם בלטים ממברנה חשים את הסביבה וצורים קשר עם המצע. מגע מטריצת התא התחזק במהירות עם היווצרות של מה שנקרא הידבקויות המתהווה. במהלך הזמן, מתחמי הידבקות מוגדלים והתבגרו להיתיקים מוקדיים.מבנים מוארכים אלה ניכרו בעיקר בשולי התא. זה נבע כוחות שהופעלו על ידי סיבי actomyosin אשר גרמו לחיזוק הידבקויות מטריצת התא, כמו גם את הצרור של סיבי actin. התא השתטח גם כתוצאה מהיווצרות רשת Actin.מהירות הרכישה תלויה בפרמטרים הבאים, במרווח הזמן, בזמן החשיפה, במספר מטוסי zed ובמספר המיקומים. ולכן חשוב מאוד לייעל פרמטרים אלה עבור שיעורי רכישה גבוהים. הטמעת טכנולוגיית הדיסק המסתובבת החדשה ביותר תהפוך מיקרוסקופיה TIRF של דיסק מסתובב לטכניקת מיקרוסקופיה חדשה ברזולוציית-על שתאפשר הדמיה בקצבי זמן גבוהים.מיקרוסקופ דיסק מסתובב היא טכניקה חזקה מאוד לחקר תהליכים המתרחשים בין פנים התא לבין קרום התא. הוכחנו שאנחנו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה של עניין על ידי רכישת ערימות תמונה גדולות מאוד בתוך שניות ספורות. אור לייזר נאסף מסוכן לעיניים.לעולם אל תסתכל ישירות לתוך הקרן ולהשתמש באמצעי הבטיחות של המכשיר, כדי למנוע חשיפה ישירה לאור.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה&quot;כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

בתרבית של חלוקת התא במטריצות תלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונאפוקלית כמותיים

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...