Name: visualizing adhesion formation in cells by means of advanced spinning disk-total internal reflection fluorescence microscopy
Uploaded: 2019-01-21T14:00:00
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Agradecemos enormemente a la comunidad científica de la Universidad médica Center Hamburg-Eppendorf para apoyarnos con las muestras para evaluación. Es decir, agradecemos Sabine Windhorst células NIH3T3, Andrea Mordhorst de YFP-vinculina y Maren Rudolph de RFP-Lifeact.

1. preparación de las células
<ol><li>Dos días antes del experimento, la semilla 3 * 105 HeLa o NIH3T3 células en 2 mL de medio de cultivo completo por pozo de una placa de cultivo celular de 6 pozos. Asegúrese de que las células se manejan en una campana de flujo laminar a lo largo de este protocolo.</li>
	<li>Un día antes del experimento, preparar los reactivos de transfección según las recomendaciones del fabricante o un protocolo determinado empíricamente, por ejemplo:<ol>
<li>Diluir 1...

<ol>
	<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Zobiak, B., Failla, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+spinning+disk-TIRF+microscopy+for+faster+imaging+of+the+cell+interior+and+the+plasma+membrane.">Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).</li><li>Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytotic+vesicle+behaviour+assessed+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy.+present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li><li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy.">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).</li><li>Trache, A., Lim, S. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells.">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).</li><li>Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+protein+dynamics+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Partridge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+attachment+and+generation+of+mature+focal+adhesions+by+integrin-containing+filopodia+in+cell+spreading.">Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+analysis+of+cell+spreading+on+matrix-coated+surfaces+reveals+two+distinct+cell+states+and+STEPs.">Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+&#945;-actinin+orchestrate+the+assembly+and+maturation+of+nascent+adhesions+in+a+myosin+II+motor-independent+manner.">Actin and &#945;-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner.</a> Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).</li><li>Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-associated+complexes+form+hierarchically+with+variable+stoichiometry+in+nascent+adhesions.">Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions.</a> Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).</li><li>Sun, Z., Guo, S. S., F&#228;ssler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+mechanotransduction.">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li><li>Chen, B. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li><li>Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axial+superresolution+via+multiangle+TIRF+microscopy+with+sequential+imaging+and+photobleaching.">Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).</li><li>Boulanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+high-resolution+3D+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+by+incidence+angle+scanning+and+azimuthal+averaging.">Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).</li></ol>

En este trabajo se presentó la primera aplicación exitosa de la SD y TIRF microscopia en una configuración conveniente para llevar a cabo experimentos imágenes de células vivas, es decir, las tasas de adquisición alto como 2 pilas de imagen de SD-TIRF por minuto a 3 alturas diferentes posiciones, correspondientes a un total de 168 marcos (alrededor de 3 fotogramas por segundo), fueron adquiridas. Algunos microscopios TIRF SD que fueron describen12,13</su...

Nuestros días, técnicas de microscopía de luz proporciona la proyección de imagen estupendo de alta resolución en fijo y vida ejemplar están desarrollando rápidamente. Técnicas de súper-resolución como estimularon emisión microscopía de iluminación de agotamiento (STED), estructurado (SIM) y microscopía de localización de foto activación (PALM) o microscopía directa reconstrucción óptica estocástica (tormenta), respectivamente, son disponible en el mercado y permiten la proyección de imagen de estructuras subcelulares que muestra detalles casi en la escala molecular1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques todavía han limitado aplicabilidad para los experimentos de imagen vivo en que grandes volúmenes deben visualizarse con varios fotogramas por segundo la velocidad de adquisición. Variedades de procesos altamente dinámicos regulados a través de la membrana plasmática, por ejemplo, endo- / exocitosis, adherencia, migración o señalización, se producen con alta velocidad dentro de grandes volúmenes celulares. Recientemente, con el fin de llenar este vacío, una técnica de microscopía integrado fue propuesto llamado spinning disco-TIRF (SD-TIRF)7. En detalle, microscopía TIRF permite específicamente aislar y localizar la membrana del plasma8,9, mientras que la microscopia SD es uno de los más sensibles y rápidas en vivo las técnicas de imagen para la visualización y seguimiento de orgánulos subcelulares en el citoplasma10,11. La combinación de ambas técnicas de imagen en una sola configuración ya se ha realizado en los últimos12,13, sin embargo, el microscopio (Figura 1) presentan finalmente cumple con los criterios para realizar experimentos de SD-TIRF imagen vivo de dichos procesos a 3 fotogramas por segundo la velocidad. Puesto que este microscopio está comercialmente disponible, el objetivo de este manuscrito debe describir en detalle y proporcionar herramientas de código abierto y protocolos de adquisición de imágenes, registro y visualización asociadas con microscopía TIRF de SD.
La configuración se basa en un microscopio invertido conectado a unidades de exploración de dos vía puertos independientes - el puerto izquierdo está vinculado a la unidad de la SD y el puerto posterior a la unidad de escáner para TIRF y foto activación/blanqueamiento experimentos. Hasta 6 láseres (405/445/488/515/561/640 nm) puede ser utilizado para la excitación. De excitación y detección de la señal de fluorescencia, ya sea un 100 x / NA1.45 de aceite o 60 x / NA1.49 aceite objetivo TIRF, respectivamente, han sido empleados. La luz emitida es dividida por un espejo dicroico (561 nm largo-pase o 514 nm largo-) y filtrada por diversos filtros band-pass (55 nm amplia centrada en 525 nm, 54 nm amplia centrada en 609 nm para fluorescencia verde y roja, respectivamente) colocado delante de la cam EM-CCD dos eras. Tenga en cuenta que más técnica acerca de la configuración se detalla en Zobiak et al. 7. en la configuración de la TIRF, la unidad de la SD se mueve fuera de la trayectoria de la luz dentro de alrededor de 0.5 s para que el mismo dos cámaras pueden utilizarse para la detección, lo que permite una conmutación más rápida entre las dos modalidades de proyección de imagen en comparación con alrededor de 1 s que fue divulgado en el pasado13 < /C2 >. Esta característica permite la adquisición simultánea de dos canales, 4 canales SD-TIRF imágenes en previamente incomparable velocidad y precisión se puede realizar. Por otra parte, la alineación entre imágenes SD y TIRF es innecesaria. Alineación de la imagen entre las dos cámaras, sin embargo, tiene que ser revisado antes de iniciar el experimento y corregida si es necesario. En el siguiente protocolo, se implementó una rutina de corrección de registro en una macro ImageJ uno mismo-escrita. Por otra parte, la macro principalmente fue diseñada para permitir una visualización simultánea de conjuntos de datos TIRF a pesar de su diferente dimensionalidad y SD. El software de adquisición no presentó estas características.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Microscope and accessories</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SD-TIRF microscope</td>
			<td >Visitron Systems</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ti with perfect focus system</td>
			<td >Nikon</td>
			<td ></td>
			<td>Inverted microscope stand</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CSU-W1 T2</td>
			<td >Yokogawa</td>
			<td ></td>
			<td>Spinning disk unit in dual-camera configuration</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iLAS2&#160;</td>
			<td >Roper Scientific</td>
			<td ></td>
			<td>TIRF/FRAP scanner</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Evolve&#160;</td>
			<td >Photometrix</td>
			<td ></td>
			<td>EM-CCD cameras</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PiezoZ stage</td>
			<td >Ludl Electronic Products</td>
			<td ></td>
			<td>Motorized Z stage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bioprecision2 XY stage</td>
			<td >Ludl Electronic Products</td>
			<td ></td>
			<td>Motorized XY stage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stage top incubation chamber</td>
			<td >Okolab</td>
			<td >Bold Line</td>
			<td>Temperature, CO2 and humidity supply</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell culture</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cervical cancer cells</td>
			<td >DSMZ</td>
			<td >ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NIH3T3 fibroblasts</td>
			<td >DSMZ</td>
			<td >ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OptiMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31985070</td>
			<td>Reduced serum medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (PenStrep)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TurboFect</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >R0531</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ascorbic acid (AA)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A544-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well cell culture plate</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bottom dishes</td>
			<td >MatTek</td>
			<td >P35G-1.5-10-C</td>
			<td>35mm, 0.17mm glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fibronectin, bovine plasma</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >33010018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer improved chamber</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck beads</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plasmids</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RFP-Lifeact</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >YFP-Vinculin</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Software and plugins</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >VisiView</td>
			<td >Visitron Systems</td>
			<td ></td>
			<td>Version 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>Version 1.52c</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Turboreg plugin</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Macro &#34;SD-TIRF_helper_JoVE.ijm&#34;</td>
			<td >this publication</td>
			<td ></td>
			<td>https://github.com/bzobiak/ImageJ</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Volocity</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td >Version 6.2.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing adhesion formation in cells by means of advanced spinning disk-total internal reflection fluorescence microscopy

En las células vivas, procesos como la formación de adherencias implican grandes cambios estructurales en la membrana plasmática y el interior de la célula. Para poder visualizar estos eventos altamente dinámicos, se combinaron dos técnicas de microscopía de luz complementarias que permiten la proyección de imagen rápida de muestras vivo: girar a microscopía de disco (SD) para el registro del volumen rápido y de alta resolución y reflexión interna total Microscopía de fluorescencia (TIRF) para localización precisa y la visualización de la membrana plasmática. Aparecerá un protocolo de imagen integral y completado para guiar a través de la preparación de la muestra, calibración de microscopios, formación de la imagen y adquisición, dando por resultado varios color SD-TIRF de serie con alta resolución espacio-temporal. Todos pasos post procesado de imagen necesario para generar multidimensional vivo de conjuntos de datos, es decir, registro y combinación de los canales individuales, se proporcionan en una macro por escrito para el software de código abierto ImageJ. La proyección de imagen de proteínas fluorescentes durante la iniciación y maduración de los complejos de adhesión, así como la formación de la red del citoesqueleto de actina, fue utilizado como una prueba del principio de este nuevo enfoque. La combinación de microscopia de alta resolución 3D y TIRF proporciona una descripción detallada de estos procesos complejos en el entorno celular y, al mismo tiempo, localización precisa de las moléculas asociadas a membrana detectada con una alta relación de señal a fondo.

Para demostrar el potencial de la proyección de imagen de SD-TIRF, que un ensayo fue desarrollado debe revelar la organización espacio-temporal de complejos de adhesión célula-matriz y su interacción con el citoesqueleto durante la adhesión celular. Por lo tanto, adherente HeLa o, alternativamente, NIH3T3 células fueron transfectadas con YFP-vinculina y RFP-Lifeact de 18-24 h, tripsinizaron y semillas en platos de fondo de vidrio recubierto de fibronectina. Estas líneas celulares ...

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Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

Un microscopio avanzado que permite rápido y de alta resolución de imagen de la membrana plasmática aislada y el volumen intracelular circundante, se presentará. La integración de microscopía de fluorescencia de reflexión interna disco y total en una configuración de giro permite energizados experimentos de imagen a precios de adquisición alto hasta 3.5 s por grupo imagen.

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

La microscopía TIRF del disco giratorio puede ser una herramienta útil para estudiar el papel de la proteína durante la formación de la red citoesquelética. Esta técnica permitió la imagen tridimensional de enfoques celulares rápidos que se producen en la célula y al mismo tiempo la localización precisa de la molécula de fluorescencia que se colocan en la membrana plasmática. Este método puede proporcionar información a áreas de investigación como la microbiología, la biología celular y todas aquellas ramas donde es importante estudiar la interacción entre la membrana plasmática y el entorno celular.Este método se puede extender a aquellos experimentos de imágenes en vivo donde es importante localizar las estructuras en la membrana plasmática y donde también desea mantener una alta resolución del volumen celular restante. Las cosas cruciales que uno tiene que considerar son la elección de la línea celular adecuada para configurar la iluminación TIRF y los otros parámetros de imagen y para encontrar el foco de las células trans infectadas. La demostración visual de este protocolo sin duda ayudaría a evitar problemas con el manejo de las celdas durante la adquisición de imágenes.Dos días antes del experimento, siembra 3.000 células HELA o NIH 3T3 en dos mililitros de medio de crecimiento completo en cada pozo de una placa de cultivo celular de seis pozos. Al día siguiente, prepare los reactivos de transfección. En primer lugar, diluir un microgramo de RFP Livact y un microgramo de YFP Vinculin en un total de 200 microlitros de medio sérico reducido.Vórtice el reactivo de transfección brevemente. A continuación, agregue cuatro microlitros de la mezcla a 200 microlitros de ADN. Vórtice los reactivos de nuevo y luego incubar la mezcla de transfección durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente.Después de la incubación, agregue toda la mezcla de transfección directamente a las células. Mezcle los pozos agitando la placa y luego colóquela de nuevo en la incubadora. El día del experimento, prepare la muestra para imágenes en vivo recubriendo primero un plato inferior de vidrio de 35 milímetros con una solución de 10 microgramos por mililitro de Fibronectin en PBS.Dejar la solución sobre la superficie de vidrio durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego retirarla y dejar que el plato se seque al aire. A continuación, diluir una solución de perlas multi fluorescentes de 0,1 micras de diámetro a una densidad de 1.800 millones de partículas por mililitro en agua destilada. Agregue la solución a la superficie de vidrio recubierto de Fibronectina durante 30 a 60 segundos.A continuación, retire la solución y deje que el plato se seque al aire. El recubrimiento previo de los platos con perlas fluorescentes sólo es necesario por dos razones, primero si desea encontrar el plano TIRF antes de sembrar las celdas o adquirir una imagen de cuenta de dos colores para el registro de la imagen. Ahora preparar un medio de crecimiento antioxidante mediante la adición de 0,1 solución de ácido ascórbico molar a una concentración final de 0,1 milimolar en medio de crecimiento.Precalienta los medios colocándolos en un baño de agua celsius de 37 grados. A continuación, lavar las células con dos mililitros de PBS y añadir 250 microlitros de Trypsin EDTA a cada pozo de la placa. Incubar las células a 37 grados centígrados y esperar de dos a tres minutos hasta que las células estén completamente desprendidas.Resuspender cuidadosamente las células en un mililitro de medio de crecimiento antioxidante precalentado y añadirlas a cuatro mililitros adicionales del medio en un tubo de cultivo celular de 15 mililitros. Coloque la suspensión celular con una tapa ligeramente abierta en una incubadora de 37 grados Centígrados amortiguado con un 5% de dióxido de carbono. Para empezar, iniciar el control ambiental del microscopio para lograr condiciones estables de cultivo celular.A continuación, coloque el plato de fondo de vidrio que contiene un mililitro de medio de crecimiento antioxidante precalentado en el soporte de muestra del microscopio precalentado. A continuación, en el software de imágenes, configure los ajustes de adquisición en el microscopio. Establezca el intervalo de tiempo de adquisición en 30 segundos y la duración entre 60 y 90 minutos.Además, active la función de enfoque automático del enfoque automático basado en hardware para cada punto de tiempo estableciendo el valor en uno. Ahora ajuste la exposición de la cámara a 200 milisegundos, el nivel de ganancia a 500 y la potencia del láser al 20% para cada canal. Se recomiendan altos niveles de ganancia, bajo tiempo de exposición y baja potencia láser para reducir la fototoxicidad.A continuación, establezca la pila Z para los canales de disco giratorio en 10 micras con un espaciado de 0,4 micras y, a continuación, establezca el desplazamiento inferior en cero para que el plano más bajo sea la posición de enfoque del enfoque automático de hardware y desactive las pilas Z para los canales TIRF. Por último, active las posiciones de la etapa de función multipunto. Esto permitirá que se registren hasta tres posiciones en un intervalo de 30 segundos.Ahora encuentra las perlas fluorescentes con iluminación epifluorescente, activa un canal TIRF y establece el ángulo de iluminación en un valor que denota iluminación TIRF. A continuación, active el enfoque automático pulsando el botón en el panel del microscopio y ajuste el enfoque con la rueda de desplazamiento. Una vez en el foco, adquiera un conjunto de datos de dos colores utilizando TIRF 488 y TIRF 561 para el posterior registro de imágenes basado en cuentas.Retire las células de la incubadora y mezcle la suspensión celular invirtiendo el tubo cerrado de dos a tres veces. Luego aplique un mililitro de las células en la antena para tomar imágenes. Encuentre rápidamente células trans infectadas dobles con iluminación epifluorescente de bajo nivel.Una vez encontradas, centra las celdas en la vista previa de la cámara en vivo usando la iluminación de campo brillante y marca la posición. A continuación, busque uno o dos puntos de interés adicionales, guárdelos en la lista de posiciones y comience la adquisición de datos haciendo clic en el botón de secuencia. Al principio, las células se pueden separar fácilmente debido al movimiento de la etapa, por lo que es mejor establecer de cuatro a cinco posiciones y más tarde descartar una o dos.Con el fin de generar una hiperpila libre de registro en Fiji, primero descargue y guarde el archivo SD-TIRF_helper_jove proporcionado. ijm en las macros de la subcarpeta Fiji. Ejecute la macro haciendo clic en el comando de menú comenzando con plugins y luego macros y finalmente ejecutar.Si los canales de color necesitan corrección de registro, seleccione la opción y cree una nueva referencia de registro basada en cuentas conocida como archivo de referencia. A continuación, importe los datos con el importador de bioformatos y elija hyperstack como opción de visualización. Cargue el conjunto de datos de imagen, seleccione la serie de discos giratorios en el primer paso y la serie TIRF en el segundo paso.En este punto, Fiji mostrará los datos ordenados por canal y posición de etapa. Aplique la corrección de registro a los canales respectivos cargando el archivo de referencia predeterminado. A continuación, seleccione la tabla de búsqueda de color deseada para cada disco giratorio y canal TIRF y combínelos en una sola hiperapilación multidimensional.Durante el procesamiento de las imágenes TIRF, se añade un número de planos zed al plano inferior y este número coincide con el número de planos de los conjuntos de datos de disco giratorio. Eso es muy importante para la representación visual de la hiperpilar final. Usando la configuración descrita en este video, se seleccionaron las células de expresión de YFP y RFP y su proceso de adhesión se observó durante un timelapse de 60 minutos.Como era de esperar, las células tenían forma redonda y sólo eran débilmente adherentes al principio con protuberancias de membrana que detectaban el medio ambiente y hacían contacto con el sustrato. El contacto de la matriz celular se fortaleció rápidamente tras la formación de las llamadas adhesiones nacientes. Con el paso del tiempo, los complejos de adhesión se agrandan y maduran a adherencias focales.Estas estructuras alargadas eran predominantemente evidentes en la periferia de la célula. Esto fue el resultado de las fuerzas que fueron ejercidas por las fibras de actomiosina que indujeron el fortalecimiento de las adherencias de la matriz celular, así como la agrupación de fibras de actina. La célula también se aplanó como resultado de la formación de la red actin.La velocidad de adquisición depende de los siguientes parámetros, el intervalo de tiempo, el tiempo de exposición, el número de planos zed y el número de posiciones. Por lo tanto, es muy importante optimizar estos parámetros para altas tasas de adquisición. La implementación de la nueva tecnología de disco giratorio convertirá la microscopía TIRF de disco giratorio en una nueva técnica de microscopía de super resolución que permitirá la toma de imágenes a altas velocidades temporales.La microscopía de disco giratorio es una técnica muy poderosa para estudiar los procesos que se producen entre el interior de la célula y la membrana celular. Se ha demostrado que podemos seguir la dinámica de la vesícula adquiriendo pilas de imágenes muy grandes en pocos segundos. La luz láser colisionada es peligrosa para los ojos.Nunca mire directamente a la viga y utilice las precauciones de seguridad del instrumento para evitar la exposición directa a la luz.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualización de las proteínas y complejos macromoleculares de Negative EM Mancha: desde la preparación de la cuadrícula para adquisición de imágenes

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Investigación

Bioingeniería

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

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Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen Óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Utilizando Impedancia Cell-sustrato y imágenes de células vivas para medir los cambios en tiempo real en la adhesión celular y De-adhesión inducidas por Matrix Modificación

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

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División de célula mamífera en Matrices 3D mediante microscopia de reflexión Confocal cuantitativa

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...