Name: flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (CBET 1605816), af Bill og Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) og den National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) tildeles K.D.R.

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Indkapsling af hydrofobe forbindelser, såsom vitamin E, som i trin 1 i protokollen, har været udførligt beskrevet9,14,28. Relativt er monodisperse partikler produceret for tidshorisonten for blanding er kortere end tidshorisonten for sammenlægning og vækst af partikler. Specifikt bliver blandet opløsningsmiddel/antisolvent løsningen hurtigt homogen, som gør det muligt for Nukleering at forekomme ensartet. Montering af blokcopolymer partikel overflade derefter giver sterisk stabilisering, der stopper partikel vækst5. Da blande tid i salen (turbulens) er en funktion af strømningshastigheder indløb til CIJ eller MIVM, er der et indløb sats, som opstår efter overgangen til turbulent blanding, hvor partikelstørrelse er stort set konstant13. Dette giver yderligere robusthed over for processen som en batch til batch variation i inlet flowhastighed (dvs., sprøjte depression hastighed) kan tolereres uden betydning for den endelige NP størrelse, som det ses af figur 3. Langsommere eller ujævn inlet hastigheder kan resultere i større partikler eller mere polydisperse distributioner, som det ses f.eks fejltænding. Nummerportabilitet er også blevet udvidet for at indkapsle hydrofile forbindelser i nanopartikler af inverse Flash NanoPrecipitation. Disse inverteret nanopartikler kan derefter bruges til at oprette mikropartikler eller være beklædt med PIND til at skabe vand-spredbar nanopartikler25. De underliggende forsamling principper forblive den samme, selv om der er den ekstra kompleksitet af crosslinking partikel core. Dette er nødvendigt for stabilisering af partikel i et vandigt miljø. I almindelighed, er forholdet 1:1 beregning i forhold til polyacid blokken tilstrækkelig, selvom de Ioniske interaktioner kan fremmes ved justering af pH gennem tilsætning af en base19. I denne protokol, er blevet beskrevet kun den første proces skridt til form inverteret NPs.
Ud over hurtig blanding er vellykket formulering af FNP eller iFNP begrænset til tilfælde, hvor flere betingelser kan være mødte9,14. Første, alle strøm indgange skal være blandbar. Mens emulsioner har været brugt til at producere NPs, kræver FNP en ensartet løsning fase i mixeren. For det andet skal den kernekomponent næsten uopløselige i opløsningsmiddel betingelserne i mixer (for CIJ, en 50/50 blanding af volumen) at køre hurtig Nukleering. Ellers, en betydelig del forbliver unencapsulated eller vil bundfald efter yderligere fortynding med antisolvent. MIVM kan aktivere højere antisolvent indhold i blandekammeret adresse core materiale opløselighed begrænsninger. Det er ofte nyttigt at generere supersaturation kurver fra opløselighed data som en funktion af opløsningsmiddel sammensætning til at guide proces design9. Figur 6 viser repræsentative kurver for to forbindelser. Lav supersaturation på de blanding kammer betingelser fortjenester opererer på forskellige kompositioner, typisk ved hjælp af MIVM. Højere supersaturation favoriserer Nukleering af den kernekomponent over partikel vækst men en uoverensstemmelse i forsamlingen tid af kernemateriale og stabilisator kan resultere i store aggregater af den terapeutiske. D'Addio og Prud'homme har gennemgået anvendelsen af sådanne supersaturation kurver i detalje9. Endelig, BCP molekylemæssigt skal opløses i det opløsningsmiddel stream og antisolvent streamen skal være selektiv for én blok. BCP skal være tilstrækkelig amphiphilic til at give både en solvophobic drivkraft fra kollapsede blokken til at forankre stabilisator på partikel overflade og til solvated blok at give sterisk stabilitet til partikel. Opløsningsmidler ikke er beskrevet i protokollen kan anvendes, så længe de opfylder disse betingelser.
Praksis med manuel sprøjte operation kan forbedre succesraten under screening. Som nævnt ovenfor, betyder drift over overgangen til homogen, turbulent blanding betingelser at små variationer i strømningshastigheden er tolereret i processen28. Skala-up til pumpe-drevne, computer-kontrollerede strømme medfører endnu større gevinster i sammenhæng på grund af reproducerbare inlet strømningshastigheder. På ethvert tidspunkt under efterbehandling af partikler, kan visuel inspektion eller DLS analyse indikere tilstedeværelsen af store aggregater, der kan være på grund af hændelige støv eller partikel ustabilitet. Når det er nødvendigt, kan streamen filtreres med en passende filter porestørrelse. I mangel af aggregater, vi har konstateret, at mindre end 5% masse er typisk tabt, når filtrering PIND-belagt nanopartikler, hvis nominelle filter størrelse er større end partikelstørrelsesfordeling. Når filtrering aggregater, er eksperimentel bestemmelse af masse tabt under processen nødvendig. Kvantificering af massetabet kan foretages på to måder. Tørvægt i en given mængde kan bestemmes massen af thermogravimetric analyse før og efter filtrering til at identificere omfanget af forandringer (jf. Supplerende oplysninger afsnit 2). Alternativt, partikler kan være genvundet (f.eks.af ingot) og opløst i et godt opløsningsmiddel. Koncentrationen af kernemateriale kan derefter direkte måles ved en passende teknik såsom ultraviolet-synlige spektrofotometri eller kromatografi.
For FNP, skal de resterende 10 vol % organisk opløsningsmiddel (fxTHF) fjernes fra den vandig dispersion. Dette kan gøres ved fordampning destillation14,29, dialyse30eller tangential flow filtrering31,32. Praktiske overvejelser for hver behandlingstrin er beskrevet i henvisningerne forudsat. Dialyse er typisk membraner 3,5 kDa eller 6-8 kDa cutoffs, selvom der findes større muligheder. Denne molekylvægt cutoff er tilstrækkelig for solvent fjernelse når dialysebehandling i 24 timer ved hjælp af flere bad ændringer. Brugen af tangential flow filtrering indebærer nogle procesudvikling som skal sørges for at undgå inducerende aggregering på grund af koncentrationen polarisering på membranen overflade. Vi har fundet, at reducere de organiske opløsningsmidler sammensætning under et system-afhængige værdi, normalt 2-10 vol %, eliminerer aggregering på membranen overflade. Efter forarbejdning, bestemmes koncentrationen af nanopartikler let ved thermogravimetric analyse (jf. Supplerende oplysninger afsnit 2). Det er ofte ønskeligt at transportere eller opbevare partikler i en yderst stabil form. Vandige dispersioner kan simpelthen være frosset hurtigt ved hjælp af en tør is/acetone blanding og derefter opbevares ved-80 ° C. Alternativt, tørt pulver kan opnås ved ingot33,34 eller spray tørring24. Ofte, skal en kryoprotektant føjes til reducere nanopartikel sammenlægning under frysning eller tørring. Sukker (saccharose, trehalose, osv.), poly(ethylene glycol) eller cyclodextrins kan screenes for effektiviteten over en række koncentrationer af overvågning størrelse af DLS35,36,37, 38. Fælles NP stabilitetsproblemer under behandling er ofte relateret til opløselighed eller fase adskillelse i kernen resulterer i omlejring mod et lavere energi stat på betingelser, hvor mobilitet er øget. Brug af fælles kerne materialer, alternative stabilisatorer eller modificerede eksterne løsning sammensætning kan bidrage til at forbedre stabiliteten14,16,17,39,40, 41.
Som nævnt ovenfor, MIVM giver mulighed for højere antisolvent indhold i blandekammeret når kræves for at opnå høj supersaturation. Det kan også give mulighed for den fysiske adskillelse af arter i mere end to vandløb når reaktivitet eller opløselighed begrænsninger kræver det. Et eksempel er dannelsen af zein protein-stabiliseret nanopartikler af antibiotika clofazimine24. Den hydrofobe clofazimine er indført i en acetone stream; Trine er indført i en 60% ethanoliske vandig strøm; kasein, som komplekser med zein, er bragt ind med en vandig buffer stream, og den fjerde stream er ekstra buffer til at øge forholdet mellem vand til acetone og ethanol. To opløsningsmiddel vandløb er påkrævet, da clofazimine og zein ikke er opløselig i et fælles opløsningsmiddel. Denne proces kan ikke ske i en to-jet CIJ mixer. Dette protein-stabiliseret formulering viser også, at Nummerportabilitet ikke er begrænset til BCP stabilisatorer. Janus partikler er produceret uden stabilisator42 og et sortiment af lavprisselskaber stabilisatorer er blevet påvist til mundtlige ansøgninger24. Navnlig, kan copolymerer såsom hydroxypropyl methylcellulose bruges i stedet for blok copolymerer af24. Core materialer kan gøres mere hydrofobe ved en række teknikker. Hydrofobe ion parring er blevet anvendt til at indkapsle en bred vifte af forbindelser, der har mellemliggende opløselighed43,44,45. Ekstremt hydrofob prodrugs er blevet genereret og derefter indkapslet46. Nukleinsyrer har været indkapslet gennem kompleks med kationiske lipider47. Vigtigere, har disse undersøgelser vist, at Nummerportabilitet kan producere en række partikel overflade kemi. Yderligere, blandet stabilisatorer indeholdende en brøkdel af BCP, der er blevet ændret med en målretning ligand på kæde ende har været brugt. Dette giver præcis kontrol over ligand indhold på overfladen, da partiklen sammensætning afspejler Inputstreamen sammensætning23,48. Tilsvarende er det muligt at inkorporere flere kernekomponenter, herunder farvestoffer og uorganiske nanopartikler3,8.
Flash NanoPrecipitation er en skalerbar tilgang til polymere nanopartikler består af enten en hydrofobe eller en hydrofil kerne. Hvis de kriterier, der er opregnet ovenfor er opfyldt, er generelt over 95% af kernemateriale indkapslet på høj massefraktionen i partikel. De tre eksempler, her blev udført på bænken skala, der kræver et par milligram af materiale og ca. 0,5 mL i hver inlet stream. Dette giver mulighed for hurtig screening af partikel betingelser for formulering optimering. Opskalering af bly formuleringer til større parti størrelser er en sag af løb den oparbejde i længere tid, der kan let ske ved hjælp af sprøjte pumper eller Strømningsregulatorer. Derimod ansigter opskalering af bulk tilsætning nanoprecipitation veldokumenterede udfordringer i at opretholde tilstrækkelig micromixing på tilsætning og tegner sig for effekten af at ændre fartøj geometri49. Dette er en væsentlig hindring, da det er afgørende at fremstille partikler på en ensartet måde at møde FDA krav50. Mikrofluidik teknikker kan også producere ensartet, reproducerbare nanopartikler, men kun aktiverer produktionen i området milligram. For eksempel, rapporterede Karnik et al. produktion satser på 0,25 mg/min. for en drug udgivelse studere51. Yderligere skala-up indebærer typisk parallelization ved høj kapital koste12. Med FNP er det ligetil at producere 1 gram af nanopartikler 600 mg/min. med en sprøjten pumpe og et par beslag til at forbinde til mixeren fjorde. Derfor repræsenterer FNP både en tilgængelig lab-skala screeningsværktøj samt en skalerbar tilgang til NP produktion for Translationel arbejde.

Siden slutningen af 1990 ' erne, har der været en støt stigning i antallet af kliniske forsøg med nanomaterialer1,2. Den stigende interesse afspejler løfte om nanomaterialer at forbedre biotilgængelighed af hydrofobe narkotika og aktivere præferentielle målretning i kroppen3. Polymere nanopartikler (refereret til som nanopartikler eller NPs her) udgør en voksende del af denne klasse af materialer2. NPs har høstet interesse, fordi de har meget afstemmelige egenskaber som størrelse, sammensætning og overflade functionalization4. Når den anvendes til administration af tungtopløselige stoffer, har NPs ofte en kerne-shell struktur hvor den terapeutiske er indkapslet i den hydrofobe kernen og skallen består af en hydrofil polymer pensel. En enkel måde at generere denne struktur beskæftiger en amphiphilic diblock copolymer (BCP) bestående af en nedbrydeligt hydrofobe blok, der indgår i partikel-core, og en hydrofil poly(ethylene glycol) (PEG) blok, der udgør polymer pensel og formidler sterisk stabilisering4,5.
Nanoprecipitation er en fælles fabrikation teknik for polymere nanopartikler, fordi det er simpelt og ikke energi intensive6. I sin enkleste form indebærer nanoprecipitation tilsætning af pipette af NP komponenter i et organisk opløsningsmiddel som acetone til en overskydende mængde stirred vand. Ændringen i opløsningsmiddel til en fortyndet vandig opløsning medfører udfældning af uopløselige kernekomponent. Stabilisatoren samler på denne voksende partikel overflade, instrueret af adsorptionen af kollapsede hydrofobe blok7,8,9,10. En ensartet partikelstørrelsesfordeling opnås når opløsningsmiddel og vand hurtigt blandes til at danne en homogen opløsning. Blanding, er langsommere end Nukleering og samling af komponenter resulterer i en større, mere polydisperse partikel befolkning. Selvom let tilgængelige for en enkel test, stirred batch tilgang resultater i bred variation på grund af blande inkonsekvens og er ikke indstillet til opskalering6,11. Mikrofluidik er dukket op som en anden avenue til NP produktion, der kan køre kontinuerligt. Denne form for produktion har været for nylig gennemgået af Ding et al. 11 . En fælles tilgang bruger laminar flow med fokus for at reducere opløsningsmiddel længde skala til sub micron værdier. Blanding af antisolvent sker ved diffusion, så små flow dimensioner er afgørende for at sikre ensartede partikler11,12. Parallelization af flere mikrofluid kamre for skala-up er problematisk for store produktionsmængder.
De hurtige blanding forhold, der favoriserer ensartet nanoprecipitation i mikrofluidik kan skiftevis fremstilles i begrænset, turbulent strømme. Flash NanoPrecipitation (FNP) beskæftiger særlige blanding geometrier til at opnå disse betingelser højere volumetriske flowhastighed end muligt med mikrofluidik. Indløb streams Angiv et blandingskammer under turbulente forhold, der fører til generation af hvirvler, således at opløsningsmiddel/anti-solvent lamellae danner på længde omfanget af diffusion11,13. Dermed, ensartet blanding på en kortere end Nukleering og væksten i den terapeutiske tidsskala er opnået. Mixeren begrænset geometri tillader ikke stream omgåelse af regionen hvor turbulente energi varmeafledning opstår og hele systemet oplever den samme proces historie13. Nukleering sker ensartet i blandingskammeret og partikel vækst fortsætter indtil stoppet af forsamlingen af BCP på overfladen9,14. Den blandede stream indeholdende stabil partikler kan derefter fortyndes med yderligere antisolvent at undertrykke Ostwald modning af partikler15,16,17.
En begrænset aktiverende jet (CIJ) mixer er den enkleste mixer design for FNP og tillader blanding af to strømme i en skalerbar og kontinuerlig måde, som vist i figur 1A13. En multi inlet vortex mixer (MIVM) blev udviklet for at aktivere op til fire forskellige strøm indgange samtidig stadig opnå den hurtige micromixing kræves til ensartet partikel dannelse, som vist i figur 1B18. FNP muliggør enkel formulering screening, der kan let oversættes til kommerciel-skala produktion. På grund af processen kontinuerlig karakter kræver større parti størrelser ikke nye fartøjer, men snarere længere køre gange, muliggør enkel oversættelse til kilogram-skala produktion i samme udstyr toget.
Hydrofile forbindelser såsom peptider og proteiner ('biologics') kan også være indkapslet i en proces kaldet inverse Flash NanoPrecipitation (iFNP). Teknikken kræver en amphiphilic BCP hvor én blok er hydrofobe og den anden er en polyacid19. Det første skridt indebærer hurtig sammenblanding af en dimethyl sulfoxid (DMSO) stream indeholdende den biologiske og BCP mod en lipofile opløsningsmiddel som dichlormethan eller chloroform. Dette resulterer i dannelse af partikler stabiliseret med hydrofobe blok pensel. Sådan en arkitektur vil her, betegnes som en 'omvendt' NP. Kernen indeholder polyacid, som er så ionically crosslinked ved hjælp af en multivalente kationer. Det stabiliserer partikler til forarbejdning til et vandigt miljø i form af mikropartikler eller PIND-belagt nanopartikler af teknikker, der har været rapporteret i litteraturen19,20,21.
Denne protokol kan anvendes til lab-skala produktion af polymert core-shell nanopartikler indkapsling enten hydrofobe eller hydrofile forbindelser. Undersektioner af protokollen giver anvisninger på brugen af begge mixer klasser - CIJ og MIVM. Læseren bør kunne tilpasse protokollen for romanen kernekomponenter og reproducerbar generere nanopartikler af ønskede størrelse ved hjælp af passende mixeren for strøm indgange. Tre eksempel formuleringer ved hjælp af FNP og iFNP præsenteres nedenfor. To ansætte CIJ mixer og kræver en MIVM15,22. Den første formulering viser indkapsling af en model hydrofobe sammensatte af FNP. Den anden formulering viser indkapsling af en model hydrofile sammensatte af iFNP i en CIJ mixer. Den endelige formulering giver et eksempel på protein indkapsling af iFNP ved hjælp af en MIVM. Protokol for denne tredje formulering beskriver brugen af små, håndholdte MIVM betegnes 'μMIVM.' Mixer design er mindre at give mulighed for forenklede formulering screening, men funktionen skalering er velbeskrevet og mixeren er ikke en mikrofluid enhed22. I det sidste afsnit af protokollen indeholder nogle noter på skala-up af bly formuleringer identificeret i screening. Disse formuleringer er beregnet til at give adgangspunkter for den læringsproces og derfor bruge ikke-nedbrydelige poly (styren)-baserede polymerer. Alternative stabilisatorer er blevet beskrevet i litteraturen, med en række biokompatible kommercielle indstillinger tilgængelige14,23,24.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confined Impinging Jets Mixer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-604</td>
			<td>Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-309</td>
			<td>Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-205</td>
			<td>Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet ferrule - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>1517</td>
			<td>Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn&#39;t protrodue into mixing chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T425-4</td>
			<td>Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norm-ject syringe (3 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53548-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E (&#945;-tocopherol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90669-50G-F</td>
			<td>Store cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P13141-SEO</td>
			<td>Other block sizes acceptable depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene)1.8k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P2275-S</td>
			<td>Example hydrophobic core material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vial</td>
			<td>DWK Lifesciences</td>
			<td>74504-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk)</td>
			<td>National</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltodextrin DE 4-7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>419672-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P5917-SAA</td>
			<td>Other block sizes acceptable depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihdyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506-25G</td>
			<td>Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Inlet Vortex Mixer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - MIVM</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-942</td>
			<td>Combination with ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - MIVM</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Fit to ferrule ID.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (MIVM)</td>
			<td>C.E. Conover</td>
			<td>MM1.5 35.50 V75</td>
			<td>Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer stand</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See Markwalter &#38; Prud&#39;homme for design.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles

Formulering af et terapeutisk sammensatte til nanopartikler (NPs) kan give unikke egenskaber. For dårligt vandopløselige stoffer, kan NP formuleringer forbedre biotilgængelighed og ændre narkotika distribution i kroppen. For hydrofile stoffer som peptider eller proteiner giver indkapsling inden for NPs også beskyttelse mod naturlige clearance mekanismer. Der er nogle teknikker til produktion af polymert NPs, der er skalerbar. Flash NanoPrecipitation (FNP) er en proces, der bruger manipuleret blanding geometrier til at producere NPs med smalle størrelse distributioner og afstemmelige størrelser mellem 30 og 400 nm. Denne protokol indeholder instruktioner om laboratorium-skala produktion af kerne-shell polymere nanopartikler af target størrelse ved hjælp af FNP. Protokollen kan gennemføres for at indkapsle enten hydrofile eller hydrofobe forbindelser med kun mindre ændringer. Teknikken kan let ansat i laboratoriet på milligram skala til skærmen formuleringer. Bly hits kan direkte skaleres op til gram - og kilogram-skala. Som en kontinuerlig proces indebærer skala-up længere blanding køre procestid snarere end oversættelse til nye proces fartøjer. NPs produceret af FNP er højt læsset med terapeutiske, indslag en tætte stabiliserende polymer pensel, og har en størrelse reproducerbarhed ± 6%.

Screening af NP formuleringer med FNP er hurtig og kræver små mængder materiale (størrelsesordenen 1-10 mg). FNP-protokollen til at indkapsle hydrofobe forbindelser, såsom vitamin E (trin 1) medfører en stabil, klart eller let opaliserende NP dispersion. Dynamisk lysspredning (DLS) giver en robust måde at karakterisere partikelstørrelse. Som vist i figur 3, giver processen NPs med et lavt polydispersity på en reproducerbar måde. Det typiske polydispersity indeks (PDI) er mindre end 0,20, der angiver en relativt monodisperse befolkning. PDI er fremstillet af funktionen autokorrelation og gennemføres ofte i instrument software. Det er et forhold på andet til det første øjeblik, hvor værdier af 0,1 fremstilles almindeligvis for monodisperse partikler26. For de fire E-vitamin/PS-b-PIND formulering replikater rapporteret, værdien 0,12 ± 0,02 og den gennemsnitlige diameter var 107 ± 7 nm. En typisk "fejltænding" på grund af enten ujævn depression af sprøjter eller langsommere depression hastighed er også rapporteret i figur 3. Polydispersity var upåvirket, men størrelsen var lidt større (135 nm). Herunder dette eksempel er de nye målinger for partikelstørrelse 113 ± 14 nm. En fejltænding resulterer i perioder hvor salen indeholder kun en enkelt stream type. Det er vigtigt, at hele streamen oplever den samme proces historie og relative mængder af økologiske og vandig streams i mixeren. Uden en stabilisator fremstilles en uigennemsigtig løsning med synlige aggregater. DLS autokorrelation funktion for denne prøve er ikke-monotone og henfalde ikke gnidningsløst, som det ses i figur 3 indsatser.
Partikel størrelse kontrol af FNP er vist i figur 4, hvor forskellige de relative mængder af kernemateriale – poly(styrene)1.8 k i denne sag – og PS -b-PIND stabilisator resulterede i partikler størrelser, der spænder fra 49-152 nm. Disse partikelstørrelser blev genereret med THF streams indeholdende en samlede massekoncentration af kerne og stabilisator af 20 mg/mL, hvor 25%, 50% eller 75% af massen blev poly(styrene) core materiale. Polydispersity af nanopartikler var altid mindre end 0,15. Omfattende diskussion af parameter effekter på partikelstørrelse produceret af FNP kan findes i litteraturen10. Lastning kan indstilles ved at holde opløsningsmiddel volumen konstant og varierende de relative mængder af stamopløsninger kerne og stabilisator. Ligeledes, den samlede massekoncentration kan varieres ved at forberede lager løsninger på andre værdier end 10 mg/mL. Visse betingelser er det muligt at observere en tom micelle befolkning af DLS27. Dette har ikke nogen skadelig virkning end udvide den målte partikelstørrelsesfordeling. Når størrelserne er ens, kan denne kommer til udtryk som en enkelt bred peak snarere end to separate toppe.
Den samme CIJ mixer kan også bruges til at indkapsle hydrofile forbindelser af iFNP, som eksemplificeret i trin 2 i protokollen. Partiklerne produceret i de rapporterede formulering er omkring 65 nm med en lav polydispersity af 0,08. Størrelse fordelingen kan ses i figur 5A (stiplet linje). Effekten af crosslinking PAA carboxylsyre rester på partikel stabilitet fremgår af DLS analyse i en stærk opløsningsmiddel som DMSO, som vist i figur 5B. Funktionen autokorrelation for godt-crosslinked partikler skal starte i nærheden af en værdi på 1 og drop skarpt til 0 på en karakteristisk tid, der er relateret til partikelstørrelse (solid line). Partikler, som svulme ekstensivt eller opløses ikke crosslinked og Vis minimal autokorrelation signal (stiplet linje). For iFNP manifestere mislykkede forsøg på samme måde som beskrevet for FNP ovenfor. Synlige aggregater kan ses eller dårlig DLS autokorrelation funktion figur kan observeres. MIVM kan anvendes til FNP eller iFNP, når mere end to indløb vandløb er påkrævet på grund af systemet begrænsninger såsom opløselighed eller kemiske uforenelighed. En mindre version af MIVM (μMIVM) med stoetteben mixer er vist i figur 2. Som med CIJ, kan denne mixer bruges til at indkapsle hydrofobe eller hydrofile forbindelser22. I trin 3, blev en protokol til indkapsling af en hydrofil protein, æg, af iFNP beskrevet. Partikelstørrelsesfordeling er vist i figur 5A (solid line). Størrelsen er ca 125 nm med en PDI af 0,16. En generel protokol for sprøjten pumpe operation i større målestok er fastsat i trin 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig1.jpg"> Figur 1: Mixer forsamling og intern flow mønster skemaer. (A) den snævre rammer jetfly (CIJ) mixer med vedlagte sprøjter er placeret over dæmpningen bad. Ikke afbilledet er et rør bar i dæmpningen bad hætteglas og en røre pladen. Den blanding geometri er afbildet i den udvidede visning viser to stream fjorde, at gribe ind i midten af salen. (B) en multi inlet vortex mixer (μMIVM) er vist med glas sprøjter og placeret i stå over et dæmpningen bad. Den mobile plade og de mekaniske stop har været beskåret fra billedet. Den udvidede visning viser vortex kammer og inlet kanaler skematisk. (C) en skematisk gengivelse af kerne-shell NPs produceret af FNP. Røde kugler repræsenterer den terapeutiske, hvilket kombineret med den blå kollapsede polymer blok, omfatter NP kerne. Den gule polymer blok udgør pensel lag bibringe sterisk stabilisering til NPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig2.jpg"> Figur 2: μMIVM terminologi og komponenter til assemblyen. ΜMIVM kræver en mixer stå hen til muliggøre ensartede depression af de fire sprøjter. I dette tilfælde skal sprøjte stemplet højder alle være ensartet at sikre konsekvent blanding. Det kan alternativt betjenes ved hjælp af sprøjte pumper. Mixer stå med mærkede komponenter er vist til venstre på figuren. Til højre er den afmonterede mixer med o-ringen på plads på de blande geometri disk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig3.jpg"> Figur 3: Partikel størrelse distribution af polymert nanopartikler der indeholder en kerne af vitamin E og stabiliseret af PS -b-PLØK. Dynamisk lysspredning (DLS) giver intensitet-vægtede størrelse distributioner, der angiver NP diameter distribution. Kurver er gennemsnittet af tredobbelt analyser for hver retssag og har været reskaleres til at producere identiske maksimale tophøjder. De fire flergangsbestemmelser (streger) angiver metoden høj reproducerbarhed (standardafvigelse = 7 nm). Der er også inkluderet en repræsentativ fejltænding (stiplet linje), såsom langsommere sprøjte hastighed eller ujævn depression af de to sprøjter, hvilket resulterer i større partikel diameter. Standardafvigelsen af NP størrelse herunder fejltænding var 14 nm. (Indsat) Uden PS -b-PIND stabilisator, store micron-skala aggregater (eller dråber, i tilfælde af en olie som vitamin E) dannes. DLS autokorrelation funktion af en køre uden stabilisator (stiplet linje) er vist sammen med en repræsentant autokorrelation fra en nanopartikel replikat (solid line). Funktionen autokorrelation viser en række karakteristiske tidsskalaer for kontrolprøve, der angiver en polydisperse befolkning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig4.jpg"> Figur 4: partikel størrelse kontrol af FNP gennem varierende relative nøgletal af core materiale til stabilisator. Intensitet-vægtede størrelse distributioner af tre formuleringer med en poly(styrene) kerne stabiliseret af PS -b-PIND er afbildet. Den samlede massekoncentration i THF var 20 mg/mL og antisolvent vand. Formuleringer blev udarbejdet i en CIJ mixer. Massefraktion af den bestående af kernemateriale er opført i forklaringen. For eksempel 25% core prøven indeholdt 5 mg/mL poly(styrene) og 15 mg/mL PS -b-PLØK. De gennemsnitlige størrelser for 25% (solid line), 50% (stiplet linje) og 75% (blandet dash line) core belastninger var 49 nm, 96 nm, og 152 nm, henholdsvis. Alle PDI værdier var mindre end 0,15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig5.jpg"> Figur 5: karakterisering af inverteret NPs lavet i en CIJ mixer eller μMIVM. (A) DLS kurver er gennemsnittet af tredobbelt analyser for hver formulering. Den stiplede linje angiver størrelse fordelingen af 3 k MD partikler gjort i CIJ mixer, mens den streg er den størrelse fordeling af æg partikler i μMIVM. (B) styrke af crosslinking kan vurderes af DLS bruge DMSO som fortyndingsvæsken. Funktionen DLS autokorrelation angiver styrken af crosslinking gennem den oprindelige autokorrelation værdi og observation af en ren overgang til en værdi på nul. Den stiplede linje afbilder autokorrelation funktion for en partikel med nogen crosslinker, viser en svag indledende signal og en bred henfald tid. Den faste linje skildrer autokorrelation efter tilsætning af en stærk crosslinker (i dette tilfælde, tetraethylenepentamine), som viser en stærk første signal og en defineret henfald tidsskala. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig6.jpg"> Figur 6: Supersaturation, S, som en funktion af de relative blanding forhold mellem organiske opløsningsmidler til vand. (A) sammenligning af højeste opnåelige supersaturation for (○) boscalid, pesticider og (■) peptid B, en syv-rester model peptid. Den økologiske stream indeholder boscalid ved en koncentration på 230 mg/mL og peptid B på 200 mg/mL, deres mætning koncentrationer. Der er en maksimal supersaturation, der afhænger af hver aktive farmaceutiske ingredienser (API) / opløsningsmiddel system. (B) når koncentrationen af boscalid i den økologiske stream er faldet 20-fold, de betingelser, hvormed der opnås supersaturation og nanoprecipitation blive begrænset. Dette tal er genoptrykt med tilladelse fra Elsevier9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles at JoVE.com

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash NanoPrecipitation (FNP) er en skalerbar tilgang til at producere polymere core-shell nanopartikler. Lab-skala formuleringer for indkapsling af hydrofobe eller hydrofile therapeutics er beskrevet.

Flash NanoPrecipitation for indkapsling af hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Flash nanopræcipitation, eller FNP teknikker demonstreret her tilbyder en skalerbar og ligetil platform for indkapsling hydrofobe eller hydrofile forbindelser inde polymere nanopartikler. For klarhedens skyld kaldes den teknik, der anvendes til at indkapsle biologics, omvendt flashnanoplysning eller IFNP. De underliggende principper er uændrede, men den deraf følgende nanopartikelstruktur er anderledes.Generelt har nye brugere brug for praksis for konsekvent at betjene indløbssprøjterne, når de manuelt laver små nanopartikelbatner. Større mængder kan produceres med computerstyrede sprøjtepumper. Vores protokol indeholder også oplysninger om efterbehandling af nanopartikelløsninger, som ofte er afgørende for en vellykket anvendelse af en formulering.Før du starter processen, skal du kontrollere CIJ-mixerbeslagene og sikre, at udløbsslangen ikke krympes. Derefter fyldes to fem milliliter polypropylen gummi fri Luer lås sprøjter med to til tre milliliter acetone, eller en anden rengøring opløsningsmiddel. Lås sprøjterne i indløbsadapterne, og indstil samlingen over en affaldsbeholder.Tryk konstant stemplerne ned for at sende opløsningsmidlet gennem blandekammeret i løbet af nogle få sekunder. Fjern derefter sprøjterne, og tør blandingen med en strøm af nitrogengas. Dernæst, at begynde at forberede opløsningsmiddel input strøm, pipette 0,25 milliliter af en 10 milligram pr milliliter opløsning af E-vitamin, i stabilisator fri tetrahydrofuran, i en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør.Derefter pipette 0,25 milliliter af en 10 mg pr. milliliter opløsning af en blok copolymer stabilisator i THF i samme rør. Vortex blandingen i fem til 10 sekunder, og derefter centrifuge det på tusind G i fem til 10 sekunder for at inddrive væske klæber til hætten. Der klargørs et centrifugerør på 1,5 milliliter, der indeholder 0,525 milliliter deioniseret vand som antiopløsningsmiddel.Derefter pipette fire milliliter deioniseret vand i en 20 milliliter scintillation hætteglas at gøre dæmpning bad. Placer en lille røre bar i hætteglasset. Anstænk den rene CIJ-mixer over dæmpningsbadet i et stativ eller en reagensglasblok på en røreplade.Start omrøring af dæmpning bad på omkring 75% af den maksimale mulige hastighed. Derefter monteres en stump tippet nål på en en milliliter polypropylen gummifri sprøjte, og træk anti-opløsningsmidlet. Bortvis forsigtigt luftboblerne fra sprøjten, og fjern og bortskaf derefter nålen.Juster stemplet, så væsken kommer lige til enden af sprøjten. Sæt derefter sprøjten på en af CIJ-indløbene. Træk opløsningsmiddelblandingen i en anden sprøjte på samme måde, og fastgør den til den anden indløb.For at danne nanopartiklerne, samtidig trykke begge stempler med en jævn ensartet bevægelse i mindre end 0,5 sekunder. Det er vigtigt at trykke sprøjterne hurtigt, jævnt og jævnt. Du bør ikke pludselig ramme sprøjterne, men bør begynde den bevægelse, der allerede er i kontakt med toppen af sprøjterne.Derefter indstilles CIJ-mixeren over affaldsbeholderen uden at fjerne sprøjterne for at sikre, at holderingsvolumenet ikke løber ud i spredningen. Fjern rørebjælken fra scintillationshætteglasset, og hætten. Fjern og kassér derefter opløsningsmiddel- og antiopløsningssprøjterne.Rengør mixeren før det næste flash nanopræcipitationsforsøg. For at forberede en prøve til dynamisk lysspredningsanalyse, pipette 100 mikroliter af dispersionen til en kuvette. Tilsæt 900 mikroliter af dæmpningsbadeopløsningsmiddel, og bland godt ved pipettering, før prøveanalysen påbegyndes.For at begynde at samle mikroMIVM skal O-ringen være placeret i blandegeometriskiven. Juster hullerne i blandeskiven med pløkkerne på den øverste skive, og monter dem sammen, og pas på ikke at fortrænge O-ringen. Løsn udløbsslangen i den nederste modtager, og skru derefter de tilsluttede skiver ind i modtageren.Sæt en skruenøgle på pløkkerne på den øverste skive, og stram samlingen. Stram monteringen af udløbsslangen, så den sidder fast mod blandegeometriskivens nederste side. Sørg for, at sprøjtebeslagene på den øverste skive sidder tæt.Løft den mobile plade på mixeren for at holde den af vejen, og placer derefter den samlede mixer på stativet med udløbsslangen gevind gennem støttepladen. Dernæst anbringes et 15 millilitercentrifugerør med 5,25 milliliter chloroform som dæmpningsbad under udløbsslangen. Derefter tegnes 0,75 milliliter opløsning A, som er en fem milligram pr. milliliteropløsning af ovalbumin i dimethylsulfoxid i 10% vand i volumen, i en en milliliter gastæt Luer-låsesprøjte med en stump spids nål.Fjern forsigtigt luftbobler, fjern nålen, og prime opløsningen til enden af Luer montering. Tilslut sprøjten til et mixerindtag. Gentag denne proces med 0,75 milliliter hver af opløsning B, som er seks milligram pr. milliliter blok copolymer stabilisator i DMSO, og løsning C, som er THF.Tilslut sprøjterne til mixeren med uret i alfabetisk rækkefølge. Der klargøres en 2,5 milliliter gastæt sprøjte med 1,85 milliliter opløsning D, som er chloroform, og den tilsluttes den til den fjerde indløb. Bekræft, at der ikke er nogen signifikant forskel i sprøjtehøjderne.Derefter forsigtigt greb lejehuset på hver side af den mobile plade, og langsomt sænke pladen, indtil det er lige knap hvile jævnt oven på sprøjterne. For at generere nanopartikler, støt og jævnt trykke pladen i omkring 0,5 til et sekund. Fjern derefter og hætten af dæmpningsbaderøret.Demonter og rengør mixeren, når den er færdig. For at arbejde med større mængder skal opløsningerne indlæses i gastætte sprøjter, og polytetrafluorethylenslange forbindes med Luer-fittings til sprøjterne. Prime løsningerne til enderne af slangen.Fastspænd sprøjterne i sprøjtepumper, og fastgør slangen til de relevante mixerindtag. Anlæt et lille affaldshætteglas under udløbsslangen til opsamling af startvolumenet. Forbered dæmpning bad og holde det i nærheden.Samtidig skal du starte pumperne, og lad omkring fem milliliter spildevand flyde ind i affaldshætteglasset. Derefter begynde at indsamle nanopartikler i dæmpning bad som sædvanlig. En røre plade kan bruges til at blande dæmpning bad, hvis det ønskes.Fire replikater af FNP af polymere nanopartikler med en hydrofobe kerne, fremstillet i CIJ mixeren, viste høj replikabilitet, og var relativt monodisperse, med en gennemsnitlig diameter på 107 nanometer. En repræsentativ fejltænding fra langsom eller ujævn sprøjtedepression, produceret lidt større partikler, mens polydispersitet var upåvirket i dette eksempel, fejltændinger kan resultere i mere polydisperse distributioner. DLS autokorrelation funktion henfaldet jævnt for en repræsentativ polymer nanopartikel prøve.Denne glatte henfald blev ikke observeret, når formuleringen blev forsøgt uden blokken copolymer stabilisator, som producerede mikron skala oliedråber i stedet. Den relative mængde kernemateriale til stabilisator kontrollerede partikelstørrelsen, som vist her, i nanopartikler med en polystyrenkerne. PDI var under 0,15 i hver formulering.Nanopartikler med hydrofile kerner, hvor produceret af IFNP. Partikler med en maltodextrinkerne, fremstillet i CIJ-mixeren, var omkring 65 nanometer i diameter og havde en PDI på 0,08. Partikler med en ovalbuminkerne fremstillet i mikroMIVM var omkring 125 nanometer i diameter, og havde en PDI på 0,16.FNP og IFNP er effektive værktøjer til behandling af molekyler og nanopartikler. Før du udfører enten teknik, skal du sørge for at overveje opløseligheder af hver komponent i alle opløsningsmidler, eller opløsningsmiddel blandinger, for at sikre høj super mætning under blanding. Den grundlæggende teknik er ligetil, men mastering sprøjten depression skridt tager nogle praksis.Hvis du har problemer med dette, overveje at bruge en sprøjte pumpe setup som den, der vises i denne video for at forbedre konsistensen. For ladede hydrofile molekyler eller molekyler med mellemopløselighed kan FNP kombineres med hydrofobe ionparring for at muliggøre effektiv indkapsling. FNP kan også bruges til at indkapsle flere forbindelser i samme nanopartikelkerne.Se teksten og andre litteraturressourcer for at lære, hvordan du bedst fjerner organiske opløsningsmidler fra nanopartikelspredningerne i den ønskede applikation. Der er også en række teknikker til stabilisering af nanopartikler under opbevaring.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virale Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering af Polymeric Gene Delivery nanopartikler ved Nanopartikel Tracking Analyse og Højkapacitetsforskning Flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmering stamceller til terapeutiske Angiogenesis Brug Bionedbrydelig Polymere Nanopartikler

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Indkapslingen af ​​Cell-fri Transskription og oversættelse Maskiner Blærer til opførelse af Cellular Efterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidnanopartikler (SLNs) til intracellulær målretning Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Fremstilling af metal nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et værktøj til at studere de antibakterielle egenskaber ved nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...