Name: flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par un financement de Optimeos Sciences de la vie, la National Science Foundation (CBET 1605816), la Bill et Melinda Gates Foundation (Melinda Gates, OPP1150755) et la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures (DGE-1656466) attribué à K.D.R.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’encapsulation des composés hydrophobes tels que la vitamine E, comme dans l’étape 1 du protocole, a été largement décrit9,14,28. Relativement monodispersés particules sont produites parce que l’échelle de temps pour le mélange est plus courte que l’échelle de temps pour l’agrégation et la croissance des particules. Plus précisément, la mélange solvant/antisolvent de solution rapidement devient homogène, qui permet de nucléation se produire uniformément. Assemblée du copolymère bloc à la surface de la particule puis fournit la stabilisation stérique qui stoppe la croissance de particules5. Temps de mélange dans la chambre (turbulence) étant une fonction des débits d’entrée à la CIJ ou le MIVM, il y a un taux d’admission, qui se produit après le passage à un mélange turbulent, où la taille des particules est essentiellement constante13. Cela donne une robustesse supplémentaire au processus comme certains lot de variation dans le débit d’aspiration (c.-à-d., la vitesse de dépression seringue) pouvant être tolérée sans impact significatif de la taille finale du NP, comme on le voit dans la Figure 3. Vitesses d’aspiration plus lent ou irrégulier peuvent entraîner des particules plus grandes ou plus polydispersés distributions, comme on le voit par l’exemple de ratés. FNP a également été étendue pour encapsuler des composés hydrophiles de nanoparticules par inverse Nanoprécipitation Flash. Ces inversé des nanoparticules peuvent ensuite être utilisés pour créer des microparticules ou être recouvert de PEG pour créer des nanoparticules eau-dispersible25. Les principes sous-jacents de l’Assemblée restent les mêmes, bien qu’il y a la complexité supplémentaire de réticulation le noyau de la particule. Cela est nécessaire pour la stabilisation de la particule dans un milieu aqueux. En général, un rapport de 1:1 charge par rapport au bloc polyacide est suffisant, même si les interactions ioniques peuvent être promues par l’ajustement du pH par l’ajout d’une base de19. Dans ce protocole, que la première étape de processus de forme inversée NPs a été décrite.
En plus de mélange rapide, formulation réussie par les FNP ou iFNP est limitée aux cas où plusieurs conditions peuvent être remplies9,14. Tout d’abord, tous les flux entrées doivent être miscibles. Alors que les émulsions ont servi à produire le NPs, FNP demande une phase de solution uniforme dans le mélangeur. Deuxièmement, la composante de base doit être quasiment insoluble dans les conditions de solvants dans la table de mixage (par la CIJ, un mélange 50/50 par volume) pour piloter la nucléation rapide. Dans le cas contraire, une grande partie restera capsulée ou précipitera après dilution supplémentaire avec antisolvent. Le MIVM permettent à teneur plus élevée en antisolvent dans la chambre de mélange de répondre aux principales matières solubilité limites. Il est souvent utile générer des courbes de sursaturation de données de solubilité en fonction de la composition du solvant pour guider le processus de conception9. La figure 6 montre les courbes représentatives des deux composés. Sursaturation basses aux conditions chambre mélange mérite fonctionnant à des compositions différentes, généralement à l’aide de la MIVM. Sursaturation plus élevée favorise la nucléation de la composante de base sur la croissance des particules mais un décalage dans le temps de montage du matériel du noyau et le stabilisateur peut entraîner des grands agrégats de la thérapeutique. D'Addio et Prud'homme ont examiné l’application de ces courbes de sursaturation en détail9. Enfin, le BCP doit être dissous moléculairement dans le flux de solvant et le flux d’antisolvent doit être sélectif pour un pâté de maisons. Le BCP doit être suffisamment amphiphile pour fournir les deux un solvophobic moteur du bloc effondré pour ancrer le stabilisateur sur la surface de la particule et pour le bloc solvatés conférer une stabilité stérique de la particule. Solvants autres que celles décrites dans le protocole peuvent être utilisés pour autant qu’ils respectent ces contraintes.
Pratique fonctionnement manuel seringue peut améliorer le taux de réussite au cours de l’examen préalable. Tel que noté ci-dessus, opération au-dessus de la transition à des conditions de mélange homogènes et turbulentes signifie que de faibles variations de débit sont tolérées dans le processus de28. Intensification des résultats de flux axées sur la pompe, contrôlé par ordinateur des gains encore plus en cohérence en raison les débits d’entrée reproductible. A tout moment pendant le post-traitement des particules, examen visuel ou analyse des listes de distribution peut-être indiquer la présence de gros agrégats qui peuvent être dus à l’instabilité de poussières ou particules fortuite. Lorsque cela est nécessaire, le flux peut être filtré avec une taille de pore de filtre approprié. En l’absence d’agrégats, nous avons constaté que moins de 5 % masse disparaît généralement lorsque vous filtrez des nanoparticules PEG-enduit si la taille du filtre nominale est supérieure à la distribution granulométrique. Lorsque vous filtrez des agrégats, détermination expérimentale de la masse perdue au cours du processus est nécessaire. Quantification de la perte de masse est réalisable dans l’une des deux façons suivantes. La masse de solides totaux dans un volume donné peut être déterminée par analyse thermogravimétrique avant et après la filtration pour identifier l’ampleur du changement (voir Complément d’Information , article 2). Sinon, les particules peuvent être récupérées (par exemple, par lyophilisation) et dissous dans un solvant bon. La concentration du matériel du noyau peut ensuite directement mesurée par une technique appropriée telle que la spectrophotométrie UV-visible ou chromatographie en phase.
Pour les FNP, résiduel 10 vol % solvant organique (par exemple, THF) doit être enlevé de la dispersion aqueuse. Cela peut être fait par distillation par évaporation14,29, dialyse30ou tangentiels filtration31,32. Des considérations pratiques pour chaque étape de traitement sont décrites dans les citations fournies. Pour la dialyse, membranes typiques sont kDa 3,5 ou 6-8 kDa seuils, bien que les grandes options sont disponibles. Ce seuil de poids moléculaire est suffisante pour l’enlèvement de solvant lorsque dialysée pendant 24 h à l’aide de plusieurs changements de salle de bain. L’utilisation de filtration à flux tangentiel entraîne certains processus de développement qu’il faut pour éviter d’induire l’agrégation en raison de la polarisation de concentration à la surface de la membrane. Nous avons trouvé que réduire la composition du solvant organique au-dessous d’une valeur dépendant du système, généralement 2 à 10 % en volume, élimine l’agrégation à la surface de la membrane. Après le traitement, la concentration de nanoparticules est facilement déterminée par analyse thermogravimétrique (voir Complément d’Information , article 2). Il est souvent souhaitable de transporter ou de stocker des particules dans une forme très stable. Dispersions aqueuses peuvent simplement être congelées rapidement en utilisant un mélange de glace et d’acétone et puis stockées à-80 ° C. Alternativement, les poudres sèches peuvent être obtenus par lyophilisation33,34 ou pulvériser séchage24. Fréquemment, un cryoprotecteur doit être ajouté pour réduire l’agrégation de nanoparticules au cours de la congélation ou le séchage. Sucres (saccharose, tréhalose, etc.), poly(ethylene glycol) ou cyclodextrines peuvent projeté pour une efficacité sur une gamme de concentrations en contrôlant la taille par DLS35,36,37, 38. Des problèmes de stabilité NP communs au cours du traitement sont souvent associées à la séparation de phase ou la solubilité dans le noyau résultant dans le réarrangement vers un état d’énergie plus faible dans des conditions où la mobilité est augmentée. Utilisation de matériaux d’âme co, stabilisateurs alternatifs ou mis à jour le solution externe composition peut aider à améliorer la stabilité14,16,17,39,40, 41.
Tel que noté ci-dessus, le MIVM permet à teneur plus élevée en antisolvent dans la chambre de mélange lorsque requis atteint sursaturation haute. Il peut également permettre la séparation physique des espèces dans plus de deux cours d’eau lorsque les contraintes de réactivité ou de la solubilité dans l’exigent. Un exemple est la formation de nanoparticules de zein protéine-stabilisé de l' antibiotique clofazimine24. La clofazimine hydrophobe est introduit dans un flux de l’acétone ; Zein est introduit dans un flux aqueux solution éthanolique de 60 % ; caséine, quels complexes avec zein, est porté avec un flux de mémoire tampon aqueux, et le quatrième flux est un tampon supplémentaire pour augmenter le rapport de l’eau à l’acétone et l’éthanol. Deux flux de solvants sont tenus clofazimine et zein n’étant pas solubles dans un solvant. Ce processus ne pourrait être achevée dans une table de mixage deux jet CIJ. Cette formulation stabilisée protéine montre également que le PNF n’est pas limitée aux stabilisateurs BCP. Particules de Janus ont été produites sans stabilisateur42 et une gamme de stabilisateurs de faible coût ont été démontrés pour les demandes orales24. Notamment, copolymères tels que hydroxypropylméthylcellulose peuvent être utilisés en remplacement de copolymères bloc24. Matériaux d’âme peuvent faire plus hydrophobes par un certain nombre de techniques. Appariement d’ions hydrophobes a été appliqué pour encapsuler un large éventail de composés qui ont la solubilité intermédiaire43,44,45. Promédicaments extrêmement hydrophobes ont été générés et ensuite encapsulé46. Acides nucléiques ont été encapsulées par complexation avec les lipides cationiques47. Ce qui est important, ces études ont montré que les FNP peut produire une gamme des chimies surface de particules. Stabilisateurs en outre, mixtes, contenant une fraction de BCP qui a été modifié avec un ligand de ciblage sur l’extrémité de la chaîne ont été utilisés. Cela permet un contrôle précis sur le contenu du ligand sur la surface puisque la composition des particules reflète les flux d’entrée composition23,48. De même, il est possible d’insérer plusieurs éléments de base, y compris les colorants et les nanoparticules inorganiques3,8.
Nanoprécipitation flash est une approche évolutive aux nanoparticules polymériques, composés d’un noyau hydrophile ou un hydrophobe. Si les critères énumérés ci-dessus sont remplies, généralement plus 95 % du matériel du noyau se résume à une fraction massique élevée dans la particule. Les trois exemples présentés ici ont été réalisées à l’échelle de banc, nécessitant quelques milligrammes de matière et environ 0,5 mL dans chaque ruisseau tributaire. Cela permet un dépistage rapide des conditions de particules pour l’optimisation de la formulation. Intensification des formulations de plomb pour les grandes tailles de lot est une question de l’exécution du processus pendant plus longtemps, qui peut être facilement accompli par l’utilisation de pompes à seringue ou régulateurs de débit. En revanche, l’intensification des nanoprécipitation ajout en bloc fait face à des défis bien documentés dans le maintien de micromélange suffisant au moment de l’addition et de comptabilité pour effet de modifier la géométrie de navire49. Il s’agit d’un obstacle de taille, car il est crucial pour la fabrication de particules de façon cohérente pour répondre aux exigences de FDA50. Microfluidique techniques peuvent également produire des nanoparticules uniformes et reproductibles, mais seulement permettre la production de l’ordre du milligramme. Par exemple, Karnik et coll. ont signalé des taux de production de 0,25 mg/min pour une libération du médicament étudient51. Nouvelle intensification consiste généralement à parallélisation à12du coût en capital élevé. Avec le PNF, c’est simple obtenir 1 gramme de nanoparticules à 600 mg/min avec un pousse-seringue et quelques accessoires pour se connecter aux entrées du mitigeur. Par conséquent, FNP représente un outil de dépistage laboratoire accessible tant une approche évolutive pour production de NP pour travail translationnelle.

Depuis la fin des années 1990, il y a eu une augmentation constante du nombre d’essais cliniques utilisant des nanomatériaux1,2. L’intérêt grandissant reflète la promesse des nanomatériaux pour améliorer la biodisponibilité des médicaments hydrophobes et pour activer le ciblage préférentiel au sein du corps3. Les nanoparticules polymériques (dénommés nanoparticules ou NPs ici) représentent une proportion croissante de cette classe de matériaux2. SNP ont suscité d’intérêt parce qu’ils ont des propriétés hautement accordables comme taille, composition et fonctionnalisation de surface4. Lorsqu’il est appliqué à l’administration de médicaments peu solubles, NPs ont souvent une structure de noyau-enveloppe où la thérapeutique est encapsulé dans le noyau hydrophobe et la coquille se compose d’une brosse de polymère hydrophile. Un moyen simple de générer cette structure emploie un copolymère à deux blocs amphiphiles (BCP) consistant en un bloc hydrophobe dégradable, qui s’inscrit dans le noyau de la particule, et bloquer un poly(ethylene glycol) hydrophile (PEG), qui constitue la brosse de polymère et confère une stabilisation stérique4,5.
Nanoprécipitation est une technique courante de fabrication de nanoparticules polymériques parce qu’il est simple et pas d’énergie intensif6. Dans sa forme la plus simple, nanoprécipitation comporte ajout de composants de NP dans un solvant organique comme l’acétone pour un excès de volume d’eau brassé à l’aide d’une pipette. Le changement dans un solvant d’une solution aqueuse diluée provoque la précipitation de la composante de base insoluble. Le stabilisateur assemble sur cette surface de particules croissant, réalisé par adsorption du bloc hydrophobe effondré7,8,9,10. Une granulométrie uniforme est obtenue lorsque le solvant et l’eau mélangent rapidement pour former une solution homogène. Mélange qui est plus lent que la nucléation et Assemblée des composants résultats dans un plus grand, plus polydispersés population de particules. Bien que facilement accessible pour un simple test, l’approche de lot agité se traduit par une grande variabilité en raison de l’incohérence de mélange et n’est pas favorable à l’intensification6,11. Microfluidique est apparus comme une autre voie à la production de NP qui peut être exécutée en continu. Ce mode de production a été récemment examiné par Ding et al. 11 . Une approche commune utilise mise au point pour réduire l’échelle de longueur solvant aux valeurs Sub-micronique à flux laminaire. Mélange de l’antisolvent ne se produit par diffusion, dimensions de faible débit sont essentielles assurer des particules uniformes11,12. Parallélisation des chambres multiples de microfluidique pour l’intensification est problématique pour les volumes de production de grande taille.
Les conditions de mélange rapides qui favorisent la nanoprécipitation uniforme en microfluidique alternativement peuvent être produites en clos, écoulements turbulents. Flash Nanoprécipitation (FNP) emploie des géométries mélange spéciales pour atteindre ces conditions dans des débits volumétriques supérieurs que possible avec la microfluidique. Flux d’entrée entrer dans une chambre de mélange dans des conditions turbulentes qui mènent à la génération de tourbillons, afin que les lamelles de solvant/anti-solvent se forment sur l’échelle de la longueur de diffusion11,13. Ainsi, un mélange homogène sur une échelle de temps plus courte que la nucléation et la croissance de la thérapeutique est atteint. La géométrie confinée de la table de mixage ne permet pas de stream contournant la région où dissipation d’énergie turbulent se produit et l’ensemble du système subit le même processus histoire13. Nucléation se produit uniformément dans la chambre de mélange et croissance des particules produit jusqu'à arrêtée par l’Assemblée de la BCP sur la surface9,14. Le flux mixte contenant des particules stables peut-être ensuite être dilué avec antisolvent supplémentaire pour réprimer Ostwald maturation des particules15,16,17.
Un mélangeur à jet (CIJ) incidente confiné est la conception la plus simple table de mixage pour les FNP et permet le mélange des deux cours d’eau de façon continue et évolutive, comme le montre la Figure 1 a13. Un vortex d’entrée multiples (MIVM) a été développé pour permettre jusqu'à quatre entrées de différents cours d’eau tout en permettant le micromélange rapide requis pour la formation de particules uniformes, comme illustré à la Figure 1 b18. FNP permet le dépistage de formulation simple qui peut facilement être traduit à la production à l’échelle commerciale. En raison du caractère continu du processus, grandes tailles de lot ne nécessitent pas de nouveaux navires mais plutôt durées, permettant une traduction simple de production à l’échelle kilogramme dans le même train de matériel.
Des composés hydrophiles tels que des peptides et des protéines (« produits biologiques ») peuvent également être encapsulés dans un processus appelé inverse Flash Nanoprécipitation (iFNP). La technique nécessite un amphiphiles BCP où un pâté de maisons est hydrophobe et l’autre est un polyacide19. La première étape implique un mélange rapide de stream diméthyl sulfoxyde (DMSO) contenant du biologique et du BCP contre un solvant lipophile comme le dichlorométhane ou le chloroforme. Cela se traduit par la formation de particules stabilisées avec le pinceau de bloc hydrophobe. Ici, une telle architecture sera qualifier une NP « inversé ». Le noyau contient le polyacide, qui est ensuite ioniquement réticulé en utilisant une cations multivalentes. Cela stabilise les particules à la transformation en milieu aqueux sous forme de microparticules ou PEG-enduit de nanoparticules par des techniques qui ont été signalés dans la littérature19,20,21.
Ce protocole peut être utilisé pour la production de laboratoire de nanoparticules de noyau-enveloppe polymères encapsulation composés hydrophobes ou hydrophiles. Les sous-sections du protocole fournissent des instructions sur l’utilisation des deux classes de mélangeur - la CIJ et la MIVM. Le lecteur doit être en mesure d’adapter le protocole pour les composants de base roman et reproductible générer des nanoparticules d’une taille désirée à l’aide de la table de mixage appropriée pour les entrées de flux. Trois formulations d’exemple à l’aide des FNP et iFNP sont présentées ci-dessous. Deux emploient le mélangeur de la CIJ et on exige le MIVM15,22. La première formulation montre encapsulation d’un modèle hydrophobe composé par les FNP. La deuxième formulation montre encapsulation d’un modèle hydrophile composé par iFNP dans un mélangeur de la CIJ. La formulation finale fournit un exemple d’encapsulation de protéine par iFNP utilisant un MIVM. Le protocole pour cette troisième formulation décrit l’utilisation d’un MIVM à petite échelle, poche, appelé le « μMIVM ». La conception de la table de mixage est plus petite afin de permettre le dépistage formulation simplifiée, mais le comportement de mise à l’échelle est bien compris et le mixeur n’est pas un dispositif de microfluidique22. La section finale du protocole inclut quelques notes sur l’intensification des formulations de plomb identifiés au préalable. Ces formules sont destinées à fournir des points d’accès pour le processus d’apprentissage et par conséquent utiliser non dégradables poly (styrène)-base de polymères. Stabilisateurs alternatifs ont été décrits dans la littérature, avec un certain nombre d’options commerciales biocompatible disponible14,23,24.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confined Impinging Jets Mixer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-604</td>
			<td>Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-309</td>
			<td>Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-205</td>
			<td>Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet ferrule - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>1517</td>
			<td>Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn&#39;t protrodue into mixing chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T425-4</td>
			<td>Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norm-ject syringe (3 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53548-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E (&#945;-tocopherol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90669-50G-F</td>
			<td>Store cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P13141-SEO</td>
			<td>Other block sizes acceptable depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene)1.8k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P2275-S</td>
			<td>Example hydrophobic core material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vial</td>
			<td>DWK Lifesciences</td>
			<td>74504-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk)</td>
			<td>National</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltodextrin DE 4-7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>419672-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P5917-SAA</td>
			<td>Other block sizes acceptable depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihdyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506-25G</td>
			<td>Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Inlet Vortex Mixer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - MIVM</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-942</td>
			<td>Combination with ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - MIVM</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Fit to ferrule ID.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (MIVM)</td>
			<td>C.E. Conover</td>
			<td>MM1.5 35.50 V75</td>
			<td>Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer stand</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See Markwalter &#38; Prud&#39;homme for design.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles

La formulation d’un composé thérapeutique en nanoparticules (NPs) peut conférer des propriétés uniques. Pour les médicaments faiblement solubles dans l’eau, les formulations de NP peuvent améliorer la biodisponibilité et modifier la distribution des médicaments dans le corps. Pour les médicaments hydrophiles comme les peptides ou protéines, encapsulation STPN peut également fournir protection de mécanismes de dégagement naturel. Il existe peu de techniques pour la production de polymères NPs qui sont évolutives. Flash Nanoprécipitation (FNP) est un procédé qui utilise sous mélange géométries pour produire NPs avec les distributions de taille étroite et tailles réglables entre 30 et 400 nm. Ce protocole fournit des instructions sur la production de laboratoire de nanoparticules polymériques noyau-enveloppe d’une taille de cible à l’aide des FNP. Le protocole peut être implémenté pour encapsuler des composés hydrophiles ou hydrophobes avec seulement quelques légères modifications. La technique peut être facilement utilisée en laboratoire à l’échelle de milligramme aux formulations de l’écran. Hits de plomb peuvent directement être transposés à l’échelle gramme et kilogramme. Comme un processus continu, intensification implique plus de mélange temps de processus d’exécution plutôt que de traduction aux bateaux neufs de processus. SNP produites par des FNP est très chargées avec thérapeutique, disposent d’une brosse de polymère stabilisante dense et ont une reproductibilité de la taille de ± 6 %.

Dépistage des formulations NP avec FNP est rapide et nécessite de petites quantités de matières (l’ordre de 1 à 10 mg). Le protocole des FNP pour encapsuler des composés hydrophobes tels que de la vitamine E (étape 1) entraîne une dispersion de NP stable, claire ou légèrement opalescente. Diffusion dynamique de la lumière (DLS) fournit un moyen robuste pour caractériser la taille des particules. Comme illustré à la Figure 3, le processus produit NPs avec une faible polydispersité de façon reproductible. L’indice de polydispersité typique (PDI) est inférieur à 0,20, indiquant une relativement monodisperses population. Le PDI est obtenu à partir de la fonction d’autocorrélation et est souvent implémenté dans le logiciel de l’instrument. C’est un ratio du second au premier moment, où les valeurs de 0,1 sont généralement obtenues pour monodispersés particules26. Pour les quatre vitamine E/p-b-PEG formulation réplicats signalés, la valeur est 0,12 ± 0,02 et le diamètre moyen était de 107 nm ± 7. Un typique « ratés » en raison soit dépression inégale des seringues ou vitesse lente de la dépression sont également signalé à la Figure 3. La polydispersité n’est pas affectée, mais la taille est légèrement plus grande (135 nm). Cet exemple, les nouvelles mesures pour la taille des particules sont 113 ± 14 nm. Une raté se traduit par une période où la chambre contient uniquement un type de flux unique. Il est important que l’intégralité du flux subit la même histoire de processus et les volumes relatifs des flux organiques et aqueuses dans le mélangeur. Sans stabilisateur, une solution opaque avec agrégats visibles est produite. La fonction d’autocorrélation DLS pour cet exemple est non monotone et délabre pas en douceur, comme on le voit dans l’encart de la Figure 3 .
Contrôle de taille de particule de FNP est illustrée dans la Figure 4, où les relatives des quantités variables de moignons – poly(styrene)1,8 k dans ce cas – et PS -b-PEG stabilisateur a donné lieu à des tailles de particules allant de 49-152 nm. Ces tailles de particules ont été générés avec des flux THF contenant une concentration de masse totale du noyau et stabilisateur de 20 mg/mL, où 25 %, 50 % ou 75 % de la masse était le matériel de noyau de poly(styrene). La polydispersité des nanoparticules a toujours été inférieur à 0,15. On trouvera une discussion approfondie des effets des paramètres sur la taille des particules produites par les FNP dans la littérature10. Le chargement peut être réglé en maintenant constantes les volume de solvant et en variant le volume relatif des solutions stocks principales et le stabilisateur. De même, la concentration massique totale peut varier par la préparation des solutions mères à des valeurs autres que 10 mg/mL. Sous certaines conditions, il est possible d’observer une population de micelle vide par DLS27. Cela n’a pas un effet préjudiciable, autres que l’élargissement de la distribution granulométrique mesurée. Lorsque les tailles sont similaires, cela peut se manifester comme un pic large unique plutôt que deux sommets distincts.
La table de mixage même CIJ permet également d’encapsuler des composés hydrophiles par iFNP, illustré à l’étape 2 du protocole. Les particules produites lors de la formulation signalée sont environ 65 nm avec une faible polydispersité de 0,08. La granulométrie peut être vu dans la Figure 5 a (lignes pointillées). L’effet de la réticulation, les résidus d’acide carboxylique AAP sur la stabilité des particules est démontrée par l’analyse des listes de distribution dans un solvant fort comme le DMSO, tel qu’illustré à la Figure 5 b. La fonction d’autocorrélation de puits-réticulé de particules devrait commencer près d’une valeur de 1 et de la chute brusquement à 0 à la fois caractéristique liée à la taille des particules (trait plein). Particules qui gonflent largement ou dissolvent sont pas réticulé et signal minimal d’autocorrélation (ligne pointillée). Pour iFNP, essais ayant échouées manifestent de façon semblable comme pour le FNP ci-dessus. Agrégats visibles peuvent être vu ou mauvaise forme de fonction DLS autocorrélation peut être observée. Le MIVM peut être utilisé pour les FNP ou iFNP lorsque plus de deux flux d’entrée sont nécessaires en raison des contraintes du système comme la solubilité ou incompatibilité chimique. Une version à petite échelle de la MIVM (la μMIVM) avec son stand de mixage est montrée à la Figure 2. Comme avec la CIJ, cette table de mixage peut être utilisé pour encapsuler les composés hydrophobes ou hydrophiles22. À l’étape 3, un protocole pour l’encapsulation d’une protéine hydrophile, ovules, par iFNP a été décrite. La granulométrie est montrée dans la Figure 5 a (trait plein). La taille est d’environ 125 nm avec un PDI de 0,16. Un protocole général pour le fonctionnement de la pompe seringue à grande échelle est fourni à l’étape 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig1.jpg"> Figure 1 : Assemblée de mélangeur et écoulements internes motif schémas. (A) le clos empiétant jets (CIJ) mélangeur avec des seringues ci-joint est positionné au-dessus du bain de trempe. Ne pas sur la photo sont un bar de remuer dans le flacon de bain de trempe et d’une plaque de remuer. La mélange de la géométrie est représentée dans la vue développée montrant les entrées de deux cours d’eau qui empiètent dans le centre de la chambre. (B) une multi-entrée agitateur vortex (le μMIVM) est montré avec des seringues de verre et positionné dans le stand au-dessus d’un bain de trempe. La plaque mobile et des butées mécaniques ont été coupées de l’image. La vue développée montre schématiquement la chambre vortex et les canaux d’entrée. (C) une représentation schématique du noyau-enveloppe NPs produites par les FNP. Sphères rouges représentent la thérapeutique qui, combiné avec le bloc bleu de polymère s’est effondré, constituent le noyau de la NP. Le bloc de polymère jaune constitue la couche de brosse conférant la stabilisation stérique à la SNM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig2.jpg"> Figure 2 : μMIVM terminologie et composants pour l’assemblage. La μMIVM exige un stand mixer pour permettre une dépression uniforme des quatre seringues. Dans ce cas, les hauteurs de piston de seringue doivent tous être uniformes pour assurer un mélange uniforme. Alternativement, il peut être utilisé à l’aide de pompes à seringue. Le stand de mixage avec composants marqués est indiqué à gauche de la figure. Sur la droite est le mélangeur démonté avec le joint torique en place sur le disque mélange de géométrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig3.jpg"> Figure 3 : Particle size distribution des nanoparticules polymériques contenant un noyau de vitamine E et stabilisé par PS -b-PEG. Diffusion dynamique de la lumière (DLS) prévoit des distributions de taille intensité pondérée qui indiquent la distribution des diamètres NP. Les courbes sont la moyenne des analyses en triple pour chaque essai et ont été redimensionnés pour produire des hauteurs maximales identiques. Les quatre réplicats (lignes pleines) indiquent la grande reproductibilité de la méthode (écart-type = 7 nm). Représentante raté (ligne pointillée), tels que la vitesse plus lente de seringue ou de dépression inégale des deux seringues, qui se traduit par le plus grand diamètre de particules est également inclus. La déviation standard de la taille de NP, y compris les ratés d’allumage a été de 14 nm. (En médaillon) Sans le PS -b-stabilisateur de cheville, grands agrégats à l’échelle du micron (ou gouttelettes, dans le cas d’une huile comme la vitamine E) sont formés. La fonction d’autocorrélation DLS d’un parcours sans le stabilisateur (ligne pointillée) est illustrée avec une autocorrélation représentative d’un réplicat de nanoparticules (trait plein). La fonction d’autocorrélation montre un certain nombre d’échelles de temps caractéristiques pour l’échantillon de contrôle, ce qui indique une population de polydispersité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig4.jpg"> Figure 4 : contrôle de la particule taille de FNP à travers différents ratios relatives du matériau à stabilisateur core. Les distributions de taille intensité pondérée en fonction des trois formulations avec un noyau poly(styrene) stabilisé par PS -b-PEG sont représentés. La concentration massique totale dans le THF était de 20 mg/mL et l’antisolvent avait de l’eau. Les formulations ont été préparées dans un mélangeur de la CIJ. La fraction de la masse composée du matériel du noyau est répertoriée dans la légende. Par exemple, l’échantillon 25 % contenue 5 mg/mL poly(styrene) et 15 mg/mL PS -b-PEG. La taille moyenne de 25 % (ligne continue), 50 % (ligne pointillée) et 75 % (ligne pointillée mixte) charges de base était 49 nm, 96 nm et 152 nm, respectivement. Toutes les valeurs PDI étaient inférieurs à 0,15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig5.jpg"> Figure 5 : caractérisation de NPs inversés dans un mélangeur de la CIJ ou μMIVM. (A), DLS courbes sont la moyenne des analyses en triple pour chaque formulation. La ligne pointillée indique la distribution granulométrique des particules de MD k 3 fait dans le mélangeur de la CIJ, tandis que la ligne continue est la distribution granulométrique des particules d’ovules dans le μMIVM. (B) la force de la réticulation peut être évaluée par DLS utilisant le DMSO comme le diluant. La fonction d’autocorrélation DLS indique la force de réticulation par le biais de la valeur initiale d’autocorrélation et l’observation d’une transition propre à une valeur de zéro. La ligne pointillée représente la fonction d’autocorrélation pour une particule avec aucun reticulation montrant un faible signal initial et un temps de décroissance large. La ligne continue représente l’autocorrélation après addition d’une forte reticulation (dans ce cas, tétraéthylènepentamine), qui montre un fort signal initial et une échelle de temps de désintégration définis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig6.jpg"> Figure 6 : sursaturation, S, en fonction des relatives rapports de mélange de solvants organiques dans l’eau. (A) comparaison du plus haute atteignable sursaturation pour (○) boscalid, un pesticide et (■) le peptide B, un peptide de sept résidus modèle. Le flux organique contient boscalid à une concentration de 230 mg/mL et le peptide B à 200 mg/mL, leur concentration de saturation. Il y a une sursaturation maximale qui dépend de chaque ingrédients pharmaceutiques actifs (API) / solvant système. (B) lorsque la concentration de boscalid dans le flux organique est diminuée de 20 fois, les conditions au cours de laquelle la sursaturation et nanoprécipitation sont atteints deviennent limitées. Ce chiffre est reproduit avec la permission de Elsevier9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash Nanoprécipitation (FNP) est une approche évolutive pour produire des nanoparticules polymériques de noyau-enveloppe. Préparations de laboratoire pour l’encapsulation de produits thérapeutiques hydrophobes ou hydrophiles sont décrites.

Flash Nanoprécipitation pour l’Encapsulation des composés hydrophobes et hydrophiles en nanoparticules polymériques

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

La nanoprécipitation flash, ou techniques FNP démontrées ici offrent une plate-forme évolutive et simple pour encapsuler les composés hydrophobes ou hydrophiles à l’intérieur des nanoparticules polymériques. Pour plus de clarté, la technique utilisée pour encapsuler les produits biologiques est appelée nanoprécipitation flash inverse, ou IFNP. Les principes sous-jacents sont inchangés, mais la structure des nanoparticules qui en résulte est différente.En général, les nouveaux utilisateurs ont besoin de pratique pour faire fonctionner systématiquement les seringues d’entrée lorsqu’ils font manuellement de petits lots de nanoparticules. De plus grands volumes peuvent être produits avec des pompes à seringues contrôlées par ordinateur. Notre protocole fournit également des détails concernant le post-traitement des solutions de nanoparticules, ce qui est souvent essentiel à la réussite de l’application d’une formulation.Avant de commencer le processus, vérifiez les raccords du mélangeur CIJ et assurez-vous que le tube de sortie n’est pas serti. Ensuite, remplissez deux seringues sans polypropylène en caoutchouc Luer de cinq millilitres avec deux à trois millilitres d’acétone, ou un autre solvant nettoyant. Verrouillez les seringues dans les adaptateurs d’entrée et réglez l’assemblage sur un conteneur à déchets.Déprimez régulièrement les pistons pour envoyer le solvant à travers la chambre de mélange pendant quelques secondes. Ensuite, retirez les seringues et séchez le mélange avec un jet de gaz azoté. Ensuite, pour commencer à préparer le flux d’entrée de solvants, pipette 0,25 millilitres d’une solution de 10 milligrammes par millilitre de vitamine E, dans le tétrahydrofuran libre stabilisateur, dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Ensuite, pipette 0,25 millilitres d’une solution de 10 milligrammes par millilitre d’un stabilisateur de copolymère bloc dans THF dans le même tube. Vortex le mélange pendant cinq à 10 secondes, puis le centrifuger à mille G pendant cinq à 10 secondes pour récupérer le liquide adhérant au bouchon. Préparez un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 0,525 millilitres d’eau déionisée comme antisolvant.Puis, pipette quatre millilitres d’eau déionisée dans un flacon de scintillation de 20 millilitres pour faire le bain étanche. Placer un petit bar à remous dans le flacon. Placer le mélangeur CIJ propre sur le bain étanche dans une grille ou un bloc de tube à essai sur une plaque à remuer.Commencez à remuer le bain étanche à environ 75% de la vitesse maximale possible. Ensuite, adaptez une aiguille à pointe émoussée à une seringue sans caoutchouc polypropylène d’un millilitre et tracez l’antisolvant. Expulsez soigneusement les bulles d’air de la seringue, puis retirez et jetez l’aiguille.Ajustez le piston de sorte que le liquide arrive juste à l’extrémité de la seringue. Ensuite, attachez la seringue à l’une des entrées du CIJ. Dessiner le mélange de solvants dans une deuxième seringue de la même manière, et l’attacher à l’autre entrée.Pour former les nanoparticules, déprimez simultanément les deux pistons avec un mouvement uniforme lisse en moins de 0,5 seconde. Il est essentiel de déprimer les seringues rapidement, uniformément et en douceur. Vous ne devriez pas frapper soudainement les seringues, mais devriez commencer le mouvement déjà en contact avec le dessus des seringues.Ensuite, placez le mélangeur CIJ sur le conteneur à déchets, sans enlever les seringues pour s’assurer que le volume de hold-up ne s’écoule pas dans la dispersion. Retirer la barre de remue-remuer du flacon de scintillation et la capuchon. Ensuite, retirez et jetez les seringues solvantes et anti-solvants.Nettoyez le mélangeur avant le prochain essai de nanoprécipation flash. Pour préparer un échantillon à l’analyse dynamique de la diffusion de la lumière, pipette 100 microlitres de la dispersion en cuvette. Ajouter 900 microlitres de solvant de bain étanche, et bien mélanger par pipetting avant de commencer l’analyse de l’échantillon.Pour commencer à assembler le micro MIVM, placez l’anneau O dans le disque de géométrie de mélange. Alignez les trous dans le disque de mélange avec les chevilles sur le disque supérieur, et adaptez-les ensemble, en prenant soin de ne pas déplacer l’anneau O. Desserrez le raccord de tube de sortie dans le récepteur inférieur, puis vissez les disques connectés dans le récepteur.Adapter une clé de clé aux chevilles du disque supérieur et serrer l’assemblage. Serrez le raccord de tube de sortie de sorte qu’il se repose fermement contre la face inférieure du disque de géométrie de mélange. Assurez-vous que les raccords de seringue sur le disque supérieur sont bien ajustés.Soulevez la plaque mobile sur le support du mélangeur pour la garder à l’extérieur, puis placez le mélangeur assemblé sur le support, avec le tube de sortie fileté à travers la plaque de soutien. Ensuite, placez un tube centrifugeuse de 15 millilitres contenant 5,25 millilitres de chloroforme comme bain étanche sous le tube de sortie. Puis, dessiner 0,75 millilitres de solution A, qui est une solution de cinq milligrammes par millilitre d’ovalbumine dans le sulfure de diméthyle dans 10% d’eau par volume, dans une seringue de verrouillage Luer étanche à un millilitre de gaz avec une aiguille à pointes émoussées.Expulsez soigneusement les bulles d’air, retirez l’aiguille et amorcez la solution à l’extrémité du raccord Luer. Connectez la seringue à une entrée de mélangeur. Répétez ce processus avec 0,75 millilitres chacun de la solution B, qui est de six milligrammes par millilitre de stabilisateur de copolymère bloc dans DMSO, et la solution C, qui est THF.Connectez les seringues aux entrées du mélangeur dans le sens des aiguilles d’une montre, par ordre alphabétique. Préparez une seringue étanche au gaz de 2,5 millilitres contenant 1,85 millilitres de solution D, qui est chloroforme, et connectez-la à la quatrième entrée. Confirmez qu’il n’y a pas de différence significative dans la hauteur des seringues.Ensuite, saisissez soigneusement le boîtier de roulement de chaque côté de la plaque mobile, et abaissez lentement la plaque jusqu’à ce qu’elle repose à peine uniformément sur les seringues. Pour produire les nanoparticules, déprimez régulièrement et en douceur la plaque en environ 0,5 à une seconde. Ensuite, retirez et plafonnez le tube de bain étanche.Démonter et nettoyer le mélangeur une fois terminé. Pour travailler avec de plus grands volumes, chargez les solutions dans des seringues étanches au gaz et connectez des tubes en polytétrafluoroéthylène avec des raccords Luer aux seringues. Prime les solutions aux extrémités du tube.Serrez les seringues dans des pompes à seringues et attachez le tube aux entrées de mélangeurs appropriées. Placez un petit flacon de déchets sous le tube de sortie pour la collecte du volume de démarrage. Préparez le bain étanche et gardez-le à proximité.Simultanément, démarrez les pompes et laissez couler environ cinq millilitres d’effluents dans le flacon de déchets. Ensuite, commencer à recueillir les nanoparticules dans le bain étanche comme d’habitude. Une plaque à remuer peut être utilisée pour mélanger le bain étanche si désiré.Quatre répliques de FNP des nanoparticules polymériques avec un noyau hydrophobe, préparées dans le mélangeur de CIJ, ont montré la réplicabilité élevée, et étaient relativement monodisperse, avec un diamètre moyen de 107 nanomètres. Un raté représentatif de la dépression de seringue lente ou inégale, a produit des particules légèrement plus grandes, tandis que la polydispersité n’a pas été affectée dans cet exemple, les ratés peuvent avoir comme conséquence plus de distributions de polydisperse. La fonction d’auto-corrélation DLS s’est détériorée en douceur pour un échantillon représentatif de nanoparticules polymériques.Cette décomposition lisse n’a pas été observée quand la formulation a été essayée sans le stabilisateur de copolymère de bloc, qui a produit des gouttelettes d’huile à l’échelle de micron à la place. La quantité relative de matériau de base au stabilisateur contrôlait la taille des particules, comme on le voit ici, dans les nanoparticules avec un noyau de polystyrène. Le PDI était inférieur à 0,15 dans chaque formulation.Nanoparticules avec des noyaux hydrophiles où produit par IFNP. Les particules avec un noyau de maltodextrine, préparées dans le mélangeur de CIJ, étaient environ 65 nanomètres de diamètre, et ont eu un PDI de 0.08. Les particules avec un noyau ovale préparé dans le micro MIVM étaient d’environ 125 nanomètres de diamètre, et avaient un PDI de 0,16.FNP et IFNP sont des outils puissants pour le traitement des molécules et des nanoparticules. Avant d’effectuer l’une ou l’autre technique, assurez-vous de tenir compte des solubilités de chaque composant dans tous les solvants, ou mélanges de solvants, afin d’assurer une saturation super élevée pendant le mélange. La technique de base est simple, mais la maîtrise des étapes de dépression seringue prend une certaine pratique.Si vous avez des problèmes avec cela, envisager d’utiliser une configuration de pompe seringue comme celle montrée dans cette vidéo pour améliorer la cohérence. Pour les molécules hydrophiles chargées, ou molécules avec la solubilité intermédiaire, FNP peut être combiné avec l’appariement hydrophobe d’ion pour permettre l’encapsulation efficace. FNP peut également être utilisé pour encapsuler plusieurs composés dans le même noyau de nanoparticules.Consultez le texte et d’autres ressources de la littérature pour apprendre à éliminer au mieux les solvants organiques des dispersions de nanoparticules dans votre application désirée. Il existe également une gamme de techniques de stabilisation des nanoparticules pendant le stockage.

Research

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The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

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Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

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