Name: flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (CBET 1605816), Bill og Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) og National Science Foundation Graduate forskning fellesskap (DGE-1656466) tildelt K.D.R.

Forfatterne ikke avsløre.

Innkapsling av hydrofobe forbindelser som vitamin E, som i trinn 1 av protokollen, har vært mye beskrevet9,14,28. Relativt er monodisperse partikler produsert fordi tidsskalaen for miksing er kortere enn tidsskalaen for aggregering og vekst av partikler. Spesielt blir blandet løsemiddel/antisolvent løsningen raskt homogen, som gjør at nucleation å skje jevnt. Montering av blokk copolymer til partikkel overflaten deretter gir steric stabilisering som stopper partikkel vekst5. Siden blande tid i kammeret (turbulens) er en funksjon av strømningshastigheter innløpet til CIJ eller MIVM, er det en vik, som oppstår etter overgangen til turbulente miksing, hvor partikkelstørrelse er i hovedsak konstant13. Dette gir mer robusthet til prosessen som noen parti til parti variasjon i innløpet strømningshastighet (dvs., sprøyte depresjon fart) kan tolereres uten betydelig innvirkning på den endelige NP størrelsen sett fra Figur 3. Tregere eller ujevn innløp hastigheter kan resultere i større partikler eller mer polydisperse distribusjoner, som for eksempel klikke. FNP har også blitt utvidet for å kapsle hydrofile forbindelser i nanopartikler av inverse Flash NanoPrecipitation. Disse invertert nanopartikler kan deretter brukes til å opprette microparticles eller være belagt med PEG opprette vann-dispergerbare nanopartikler25. De underliggende prinsippene for montering forblir den samme, men det er ekstra kompleksitet crosslinking partikkel kjernen. Dette er nødvendig for stabilisering av partikkel i vandig miljø. Generelt, er en 1:1 gratis forhold sammenlignet polyacid blokken tilstrekkelig, men ioniske interaksjoner kan fremmes ved pH justering gjennom tillegg av en base19. I denne protokollen, har bare første prosesstrinnet til skjemaet invertert NPs blitt beskrevet.
I tillegg til rask miksing er vellykket formulering av FNP eller iFNP der flere vilkår kan være møtte9,14. Først hele strømmen innganger må blandbar. Mens emulsjoner blir brukt til å produsere NPs krever FNP en enhetlig løsning fase i mikseren. Andre må kjernen være nesten uløselig på løsemiddel betingelsene i mikseren (for CIJ, en 50/50 blanding av volumet) å kjøre rask nucleation. Ellers, en betydelig del blir unencapsulated eller fremskynde etter ytterligere fortynning med antisolvent. MIVM kan aktivere høyere antisolvent innhold i miksing kammeret til adressen kjernen materiale løselighet begrensninger. Det er ofte nyttig å generere supersaturation kurver fra løselighet data som en funksjon av løsemiddel sammensetning å lede prosessen design9. Figur 6 viser representant kurver for to forbindelser. Lav supersaturation på blande kammer forhold fortjeneste ved forskjellige komposisjoner, vanligvis ved hjelp av MIVM. Høyere supersaturation favoriserer nucleation av kjernen komponenten partikkel vekst men en konflikt i samlingen kjernemateriale og stabilisatoren kan resultere i store mengder av den terapeutiske. D'Addio og Prud'homme har gjennomgått anvendelsen av slike supersaturation kurver i detalj9. Endelig BCP må molecularly oppløst i løsemidler strømmen og antisolvent strømmen må være selektiv for en blokk. BCP må være tilstrekkelig amphiphilic til å gi både en solvophobic drivkraft fra skjulte blokken å forankre stabilisator på partikkel overflaten og solvated blokken å formidle steric stabilitet partikkel. Løsemidler utenom det som er beskrevet i protokollen kan brukes så lenge de oppfyller disse betingelsene.
Praksis med manuell sprøyte operasjonen kan forbedre suksessrate under screening. Som nevnt ovenfor, betyr drift over overgangen til homogen, turbulente blanding forhold at små variasjoner i infusjonshastigheten er tolerert i prosessen28. Skalere opp til pumpen-drevet, datastyrt flyter gir enda større gevinster i konsistensen på grunn av reproduserbar innløp flow priser. Når som helst under etterbehandling av partikler, kan visuell inspeksjon eller DLS analyse indikere tilstedeværelse av store mengder som kan skyldes tilfeldig støv eller partikkel ustabilitet. Ved behov kan strømmen filtreres med en riktig filter porestørrelse. I fravær av aggregater, har vi funnet at mindre enn 5% er vanligvis tapt ved filtrering PEG-belagt nanopartikler hvis nominell filter er større enn størrelsesDistribusjon partikkel. Når du filtrerer aggregater, er eksperimentell bestemmelse av masse tapt under prosessen nødvendig. Kvantifisering av masse tapet kan utføres på to måter. Totalt tørrstoff massen i et gitt volum kan bestemmes av thermogravimetric analyse før og etter filtrering å identifisere omfanget av endring (se Tilleggsinformasjon delen 2). Alternativt partikler kan være gjenopprettet (f.eksav lyophilization) og oppløst i et godt løsningsmiddel. Konsentrasjonen av kjernemateriale kan deretter direkte måles ved en passende teknikk som UV-synlig spectrophotometry eller kromatografi.
For FNP, må de resterende 10 vol % organisk løsemiddelet (f.eksTHF) fjernes fra vandig spredning. Dette kan gjøres etter fordamping destillasjon14,29, dialyse30eller tangentiell flyt filtrering31,32. Praktiske hensyn for hvert er beskrevet i sitatene gitt. For dialyse er typisk membraner 3,5 kDa eller 6-8 kDa konsentrasjon, om større alternativer er tilgjengelig. Denne molekylvekt cutoff er tilstrekkelig for fjerning når dialyzed 24 h bruker flere bad endringer. Bruk av tangentiell flyt filtrering innebærer noen Prosessutvikling som må være forsiktig å unngå inducing samling på grunn av konsentrasjon polarisering på membran overflaten. Vi har funnet at å redusere den organiske løsemidler sammensetningen under en system-avhengige verdi, vanligvis 2-10 vol %, eliminerer samling på membran overflaten. Etter bearbeiding, konsentrasjonen av nanopartikler bestemmes lett av thermogravimetric analyse (se Tilleggsinformasjon delen 2). Er det ofte ønskelig å transport eller lagre partikler i en svært stabil form. Aqueous dispersions kan bare være frosset raskt bruke en tørris/aceton blanding og deretter lagret på-80 ° C. Alternativt, tørt pulver kan fås ved lyophilization33,34 eller spray tørking24. Ofte legges en kryoprotektant til redusere hydrogenion aggregering under frysing eller tørke. Sukker (sucrose, trehalose, etc.), poly(ethylene glycol) eller syklodekstriner kan bli vist for effektivitet over en rekke konsentrasjoner av overvåking størrelse av DLS35,36,37, 38. Vanlige NP stabilitetsproblemer under behandlingen er ofte knyttet til løselighet eller fase separasjon i kjernen resulterer i omorganisering mot en lavere energi tilstand under forhold der mobilitet er økt. Bruk av co kjernen materialer, alternativ stabilisatorer eller endret eksternt løsning komposisjon kan forbedre stabilitet14,16,17,39,40, 41.
Som nevnt ovenfor, kan MIVM høyere antisolvent innhold i miksing kammeret når må oppnådde høy supersaturation. Det kan også gi fysiske segregering av arter i mer enn to bekker når reaktivitet eller løselighet betingelser krever det.. Et eksempel er dannelsen av zein protein-stabilisert nanopartikler antibiotika clofazimine24. Den hydrofobe clofazimine er innført i en aceton strøm; Zein er innført i en 60% ethanolic vandig strøm; kasein, hvilke komplekser med zein, er med en vandig buffer strøm, og den fjerde er ekstra buffer for å øke andelen vann aceton og etanol. To løsemiddel bekker er nødvendig siden clofazimine og zein ikke er løselig i et felles løsemiddel. Denne prosessen kan ikke gjøres i en to-jet CIJ blandebatteri. Denne protein-stabilisert formulering demonstrerer også at FNP ikke er begrenset til BCP stabilisatorer. Janus partikler har vært produsert uten stabilisator42 og en rekke rimelige stabilisatorer er blitt demonstrert for muntlig programmer24. Spesielt kan copolymers som hydroksypropylcellulose methylcellulose brukes i stedet for blokk copolymers24. Kjernen materialer kan gjøres mer hydrofobe av en rekke teknikker. Hydrofobe ion sammenkobling er brukt for å kapsle en rekke forbindelser som har middels løselighet43,44,45. Ekstremt hydrofobe prodrugs har blitt generert og deretter innkapslet46. Nukleinsyrer har vært innkapslet gjennom complexation med kationisk lipider47. Viktigere, har disse studier vist at FNP kan produsere en rekke partikkel overflaten kjemikalier. Videre, blandet stabilisatorer som inneholder en brøkdel av BCP som er endret med en målretting ligand på hele kjeden har blitt brukt. Dette gjør nøyaktig kontroll over ligand innhold på overflaten siden partikkel sammensetningen gjenspeiler Inndataflyten komposisjon23,48. Tilsvarende er det mulig å bruke flere kjernekomponentene også, inkludert fargestoffer og uorganisk nanopartikler3,8.
Flash NanoPrecipitation er en skalerbar tilnærming til polymere nanopartikler består av enten en hydrofobe eller en hydrofile kjerne. Hvis kriteriene som foreskrives ovenfor er oppfylt, er vanligvis over 95% av kjernemateriale innkapslet med høy masse brøk i partikkel. De tre eksemplene presenteres her ble utført på benken skala, krever noen milligram og ca 0,5 mL i hver vik stream. Dette gir rask screening av partikkel betingelser for formulering optimalisering. Skalere opp bly formuleringer større satsvise størrelser er et spørsmål om kjører prosessen for lenger, som kan lett oppnås gjennom bruk av sprøyten pumper eller Strømningsreguleringsutstyr. Derimot overfor skalere opp av bulk tillegg nanoprecipitation veldokumenterte utfordringer i å opprettholde tilstrekkelig micromixing på tillegg og regnskap for effekten av skiftende fartøyet geometri49. Dette er en stor barriere, siden det er avgjørende å produsere partikler på en konsekvent måte å møte FDA krav50. MicroFluidics teknikker kan også produsere uniform, reproduserbare nanopartikler, men bare gjør produksjonen i området mg. For eksempel rapportert Karnik et al. produksjon priser på 0,25 mg/min for en narkotika-versjon studere51. Ytterligere skalere opp vanligvis innebærer parallelization høy Capital som koster12. Med FNP er det enkelt å produsere 1 gram nanopartikler på 600 mg/min med en sprøytepumpe og noen tilbehør til å koble til mikseren viker. Følgelig representerer FNP både en tilgjengelig lab skala screening verktøyet samt en skalerbar tilnærming til NP produksjon for translasjonsforskning arbeid.

Siden 1990, har det vært en jevn økning i antall kliniske studier ansette nanomaterialer1,2. Den stigende interessen gjenspeiler løfte om nanomaterialer å forbedre biotilgjengeligheten av hydrofobe narkotika og aktivere fortrinnsrett målretting i kroppen3. Polymere nanopartikler (referert til som nanopartikler eller NPs her) representerer en økende andel av denne klassen av materialer2. NPs har fått interesse fordi de har svært tunable egenskaper som størrelse, sammensetning og overflate functionalization4. Når påføres av dårlig vannløselige stoffer, har NPs ofte en kjerne-shell struktur der terapeutisk er innkapslet i hydrofobe kjernen og skallet består av en hydrofile polymer pensel. En enkel måte å generere denne strukturen har en amphiphilic diblock copolymer (BCP) som består av en nedbrytbar hydrofobe blokk, som er en del av partikkel kjernen, og en hydrofile poly(ethylene glycol) (PEG) blokkere, som danner polymer penselen og formidler steric stabilisering4,5.
Nanoprecipitation er en vanlig fabrikasjon teknikk for polymere nanopartikler fordi det er enkelt og ikke energi intensiv6. I sin enkleste form innebærer nanoprecipitation tillegg av Pipetter NP komponenter i en organisk løsemiddel som aceton til et overflødig volum rørt vann. Endringen i løsningsmiddel til en fortynnet vannoppløsning resulterer i nedbør av uløselig kjernen. Stabilisatoren samler på denne voksende partikkel overflaten, regissert av adsorpsjon av skjulte hydrofobe blokk7,8,9,10. En uniform partikkel størrelsesDistribusjon oppnås når løsemiddel og vann raskt bland til en homogen løsning. Blanding som er tregere enn nucleation og montering av komponenter resulterer i et større, mer polydisperse partikkel befolkningen. Om lett tilgjengelig for en enkel test, rørt satsvise tilnærmingen gir bred variasjon på grunn av miksing inkonsekvens og er ikke mottakelig for skala-up6,11. MicroFluidics har dukket opp som en annen avenue til NP produksjon som kan kjøres kontinuerlig. Denne produksjonsmidlene har nylig gjennomgått av Ding et al. 11 . En felles tilnærming bruker laminær strømning fokus for å redusere størrelsen løsemiddel lengde sub-mikron verdier. Blanding av antisolvent skjer ved diffusjon, så liten flyt er avgjørende for å sikre ensartet partikler11,12. Parallelization av flere microfluidic kamre for skala-up er problematisk for store produksjonsvolumer.
Rask blande betingelsene som favoriserer ensartet nanoprecipitation i microfluidics kan vekselvis produseres i trange, turbulente. Flash NanoPrecipitation (FNP) benytter spesielle blanding geometrier for å oppnå disse vilkårene høyere volumetriske flowrates enn mulig med microfluidics. Vik bekker angi en blanding kammer under turbulent forhold som fører til generasjon av virvlene, slik at løsemiddel/anti-solvent lamellae danner lengde størrelsesorden diffusjon11,13. Dermed oppnås uniform blande på en tidsskala som er kortere enn nucleation og vekst av terapeutisk. Begrenset geometrien av blandebatteri tillater ikke strømmen omgåelsen i regionen hvor turbulente energi ødsling oppstår og hele systemet opplever den samme prosess historie13. Nucleation oppstår jevnt i miksing kammeret og partikkel veksten fortsetter til stoppet av forsamlingen av BCP på overflaten9,14. Blandet strømmen som inneholder stabil partikler kan deretter fortynnes med flere antisolvent å undertrykke Ostwald modning partikler15,16,17.
En begrenset impinging jet (CIJ) blandebatteri er den enkleste mixer designen for FNP og tillater blanding av to bekker på en skalerbar og kontinuerlig måte, som vist i figur 1A13. En multi innløp vortex mikser (MIVM) ble utviklet for å muliggjøre opptil fire forskjellige strømmen innganger mens fortsatt oppnå rask micromixing kreves for uniform partikkel formasjon, som vist i figur 1B18. FNP kan enkelt formulering screening som kan lett oversettes til kommersiell skala produksjon. På grunn av kontinuerlig natur prosessen krever ikke større satsvise størrelser nye fartøyer men heller lenger kjøre ganger, muliggjør enkel oversettelse til kilo skala produksjon i samme utstyret toget.
Hydrofile forbindelser som peptider og proteiner ('biologiske') kan også være innkapslet i en prosess betegnes inverse Flash NanoPrecipitation (iFNP). Teknikken krever en amphiphilic BCP der en blokk er hydrofobe og den andre er en polyacid19. Det første trinnet innebærer rask blanding av en dimethyl sulfoxide (DMSO) stream inneholder den biologiske og BCP mot et lipofile løsemiddel som diklormetan eller kloroform. Dette resulterer i dannelsen av partikler stabilisert med hydrofobe blokk pensel. Her, skal slik en arkitektur kalles en "omvendt" NP. Kjernen inneholder polyacid, som er så ionically krysskoblet bruker en multivalent kation. Dette stabiliserer partikler for behandling i en vandig miljø i form av microparticles eller PEG-belagt nanopartikler av teknikker som er rapportert i litteraturen19,20,21.
Denne protokollen kan anvendes for lab-skala produksjon av polymere core-shell nanopartikler innkapsle hydrofobe eller hydrofile forbindelser. Underdeler av protokollen inneholder instruksjoner for bruk av begge blandebatteri klasser - CIJ og MIVM. Leseren skal kunne tilpasse protokollen for romanen kjernekomponenter og reproduserbar generere nanopartikler ønsket størrelse bruker riktig blandebatteri for strømmen innganger. Tre eksempel formuleringer FNP og iFNP presenteres nedenfor. To benytter CIJ blandebatteri og krever MIVM15,22. Den første formuleringen demonstrerer innkapsling av en modell hydrofobe sammensatt av FNP. Andre formulering demonstrerer innkapsling av en modell hydrofile sammensatt av iFNP i en CIJ blandebatteri. Siste utformingen gir et eksempel på protein innkapsling av iFNP med en MIVM. Protokoll for denne tredje formulering beskriver bruken av en småskala, håndholdte MIVM kalt "μMIVM." Blandebatteri er mindre å tillate forenklet formulering screening, men skalering virkemåten er godt forstått og blandebatteri er ikke en microfluidic enhet22. Den siste delen av protokollen inkluderer noen notater på skalaen opp av bly formuleringer i screening. Disse formuleringene er ment å gi tilgangspunkter for å lære prosessen og dermed bruke ikke-nedbrytbare poly (styren)-baserte polymerer. Alternative stabilisatorer har blitt beskrevet i litteraturen, med en rekke biokompatible kommersielle alternativer tilgjengelig14,23,24.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confined Impinging Jets Mixer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-604</td>
			<td>Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-309</td>
			<td>Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-205</td>
			<td>Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet ferrule - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>1517</td>
			<td>Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn&#39;t protrodue into mixing chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T425-4</td>
			<td>Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norm-ject syringe (3 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53548-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E (&#945;-tocopherol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90669-50G-F</td>
			<td>Store cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P13141-SEO</td>
			<td>Other block sizes acceptable depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene)1.8k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P2275-S</td>
			<td>Example hydrophobic core material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vial</td>
			<td>DWK Lifesciences</td>
			<td>74504-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk)</td>
			<td>National</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltodextrin DE 4-7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>419672-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P5917-SAA</td>
			<td>Other block sizes acceptable depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihdyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506-25G</td>
			<td>Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Inlet Vortex Mixer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - MIVM</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-942</td>
			<td>Combination with ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - MIVM</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Fit to ferrule ID.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (MIVM)</td>
			<td>C.E. Conover</td>
			<td>MM1.5 35.50 V75</td>
			<td>Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer stand</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See Markwalter &#38; Prud&#39;homme for design.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles

Utformingen av en terapeutisk blanding i nanopartikler (NPs) kan gi unike egenskaper. For dårlig vannløselige stoffer, kan NP formuleringer forbedre biotilgjengelighet og endre distribusjon i kroppen. For hydrofile stoffer som peptider eller proteiner, kan innkapsling i NPs også gi beskyttelse mot naturlig klaring mekanismer. Det er noen teknikker for produksjon av polymere NPs som er skalerbare. Flash NanoPrecipitation (FNP) er en prosess som bruker utviklet blanding geometrier å produsere NPs med smale størrelse distribusjoner og tunable størrelser mellom 30 og 400 nm. Denne protokollen gir instruksjoner på laboratoriet skala produksjon av kjerne-shell polymere nanopartikler målet størrelse bruker FNP. Protokollen kan implementeres for å kapsle enten hydrofile eller hydrofobe forbindelser med kun mindre modifikasjoner. Teknikken kan lett brukes i laboratorier ved mg skala til skjermen formuleringer. Bly treff kan direkte skaleres til gram og kilo-skala. Som en kontinuerlig prosess innebærer skalere opp lenger miksing prosess kjører i stedet for oversettelse til nye prosessen fartøyer. NPs produsert av FNP er svært lastet med terapeutiske, har en tett stabiliserende polymer pensel, og har en størrelse reproduserbarhet ± 6%.

Screening av NP formuleringer med FNP er rask og krever små mengder materiale (på 1-10 mg). FNP protokollen å kapsle hydrofobe forbindelser som vitamin E (trinn 1) gir en stabil, klar eller lett opaliserende NP spredning. Dynamisk lysspredning (DLS) gir en robust betyr å karakterisere partikkelstørrelse. Som vist i Figur 3, produserer prosessen NPs med en lav polydispersity på en reproduserbar måte. Typisk polydispersity indeksen (PDI) er mindre enn 0,20, som indikerer en relativt monodisperse befolkningen. PDI hentes fra funksjonen autokorrelasjon og ofte implementert i instrumentet programvare. Det er et forhold mellom andre til første øyeblikk, der verdiene i 0,1 hentes vanligvis for monodisperse partikler26. For fire vitamin E/PS-b-PEG formulering gjentak rapportert, verdien var 0,12 ± 0,02 og gjennomsnittlig diameter var 107 ± 7 nm. En typisk "ubeskyttede" på grunn av enten ujevne depresjon av sprøyter eller langsommere depresjon er også rapportert i Figur 3. Polydispersity var upåvirket, men størrelsen var litt større (135 nm). Inkludert dette eksemplet er de nye beregningene for partikkelstørrelse 113 ± 14 nm. En klikke resulterer i perioder hvor kammeret inneholder bare en enkelt strømmen. Det er viktig at hele strømmen opplever de samme historikk og relativ mengder organisk og vandig bekkene i mikseren. Uten en stabilisator produseres en ugjennomsiktig løsning med synlige aggregat. Funksjonen DLS autokorrelasjon for dette eksemplet er ikke-monotoniske og råtner ikke jevnt, som vist i Figur 3 rammemargen.
Partikkel størrelse-kontrollen av FNP er vist i Figur 4, hvor varierende de relative mengdene av kjernemateriale-poly(styrene)1.8 k i dette tilfellet- og PS -b-PEG stabilisator resulterte i partikler størrelser som varierte fra 49-152 nm. Disse partikkelstørrelser ble generert med THF strømmer som inneholder en totale masse konsentrasjon av kjernen og stabilisator av 20 mg/mL, hvor 25%, 50% og 75% av var kjernemateriale poly(styrene). Polydispersity av nanopartikler var alltid mindre enn 0,15. Omfattende diskusjon av parameteren effekter på partikkelstørrelse produsert av FNP kan finnes i litteratur10. Lasting stilles ved å holde løsemiddel volum konstant og varierende forhold volumene av kjernen og stabilisator lager løsninger. Tilsvarende kan den totale masse konsentrasjonen endres ved å forberede lager løsninger på verdier enn 10 mg/mL. Under visse forhold er det mulig å observere en tom micelle befolkning av DLS27. Dette har ikke noen skadelig effekt enn utvide størrelsesDistribusjon målt partikkel. Når størrelsen er like, kan dette manifestere som en enkelt bred topp i stedet for to separate toppene.
Samme CIJ blandebatteri kan også brukes til å kapsle hydrofile forbindelser ved iFNP, som eksemplifisert i trinn 2 av protokollen. Partiklene produsert i rapporterte utformingen er rundt 65 nm med en lav polydispersity av 0,08. StørrelsesDistribusjon kan ses i figur 5A (stiplet linje). Effekten av crosslinking PAA karboksylsyre rester på partikkel stabilitet er demonstrert av DLS analyse i en sterke løsemidler som DMSO, som vist i figur 5B. Funksjonen autokorrelasjon for godt-krysskoblet partikler bør starte nær verdien 1 og slipp kraftig 0 om gangen karakteristiske som er knyttet til partikkelstørrelse (heltrukket linje). Partikler som svulmer mye eller løses ikke krysskoblet og Vis minimal autokorrelasjon signal (stiplet linje). For iFNP manifestere mislykkede forsøk på lignende måter som FNP ovenfor. Synlig aggregater kan bli sett eller dårlig DLS autokorrelasjon funksjonen form kan observeres. MIVM kan brukes for FNP eller iFNP når mer enn to innløp bekker på grunn av systemet begrensninger som løselighet eller kjemiske inkompatibilitet. En mindre versjon av MIVM (μMIVM) med sin stand blandebatteri er vist i figur 2. Som med CIJ, kan denne blandebatteri brukes til å kapsle hydrofobe eller hydrofile forbindelser22. En protokoll for innkapsling av en hydrofile protein, egg, av iFNP ble beskrevet i trinn 3. Partikkel størrelsesDistribusjon vises i figur 5A (heltrukket linje). Størrelsen er rundt 125 nm med en PDI av 0,16. En generell protokoll for sprøyten pumpe drift ved større skala er gitt i trinn 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig1.jpg"> Figur 1: blandebatteri assembly og intern flyt mønster skjemaer. (A) den trange impinging jetfly (CIJ) mikser med vedlagte sprøyter er plassert over undertrykking av badekaret. Ikke avbildet er en rør bar i quench bad ampullen og røre plate. Blande geometrien er avbildet i utvidet visning viser de to strømmen sundene som impinge midt i kammeret. (B) en multi innløp vortex blandebatteri (μMIVM) er vist med glass sprøyter og plassert i stå ovenfor en quench bad. Mobile platen og mekanisk stopper har blitt beskåret fra bildet. Utvidet visning viser vortex kammeret og inntak kanaler skjematisk. (C) en skjematisk fremstilling av kjerne-shell NPs produsert av FNP. Rød kuler representerer den terapeutiske som, kombinert med blå skjult polymer blokken, utgjør kjernen NP. Gul polymer blokken danner pensel lag formidle steric stabilisering med NPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig2.jpg"> Figur 2: μMIVM terminologi og komponenter for assembly. ΜMIVM krever en mikser stå å aktivere uniform depresjonen i fire sprøyter. I dette tilfellet må sprøyte stempelet høydene alle være ensartet å sikre konsekvent miksing. Det kan også brukes med sprøyte pumper. Standen blandebatteri med merket komponenter vises til venstre i figuren. Til høyre er demontert blandebatteri med O-ring på plass på blande geometri disken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig3.jpg"> Figur 3: Partikkel størrelse distribusjon av polymere nanopartikler som inneholder en kjerne av vitamin E og stabilisert av PS -b-PEG. Dynamisk lysspredning (DLS) gir intensitet-vektet størrelse distribusjoner som angir NP diameter fordelingen. Kurver er gjennomsnittet av tre eksemplarer analyser for hvert forsøk og har vært skala for å produsere identiske maksimal topp høyder. De fire replikat (heltrukket linje) indikerer den høye reproduserbarhet metoden (standardavvik = 7 nm). Også inkludert er en representant klikke (stiplet linje), som sprøyte langsommere eller ujevn depresjonen i to sprøyter, som resulterer i større partikkel diameter. Standardavviket av NP inkludert klikke var 14 nm. (Innsatt) Uten PS -b-PEG stabilisator, store mikron skala aggregater (eller dråper, i tilfelle av en olje som vitamin E) er dannet. Funksjonen DLS autokorrelasjon rensing uten stabilisator (stiplet linje) vises sammen med en representant autokorrelasjon fra en hydrogenion gjenskape (heltrukket linje). Funksjonen autokorrelasjon viser en rekke karakteristiske tidsrammer for kontroll prøven, som angir polydisperse innbyggere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig4.jpg"> Figur 4: partikkel størrelse-kontrollen av FNP gjennom varierende relative prosenter av materialet til stabilisator. Intensitet-vektet størrelse distribusjonen av tre formuleringer med en poly(styrene) kjerne stabilisert av PS -b-PEG er avbildet. Den totale masse konsentrasjonen i THF var 20 mg/mL av antisolvent var vann. Formuleringene ble utarbeidet i en CIJ mikser. Brøkdel av massen består av kjernemateriale vises i forklaringen. For eksempel 25% kjernen utvalget inneholder 5 mg/mL poly(styrene) og 15 mg/mL PS -b-pinne. De gjennomsnittlige størrelsene for 25% (heltrukket linje), 50% (stiplet linje) og 75% (blandet dash linje) core belastninger var 49 nm, 96 nm og 152 nm, henholdsvis. Alle PDI verdier var mindre enn 0,15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig5.jpg"> Figur 5: karakterisering av invertert NPs i en CIJ mikser eller μMIVM. (A) DLS kurver er gjennomsnittet av tre eksemplarer analyser for hver formulering. Den stiplede linjen angir størrelsesDistribusjon av 3 k MD partikler gjort i CIJ mikseren mens den heltrukne linjen er størrelsesDistribusjon av OVA partikler i μMIVM. (B) styrke crosslinking kan vurderes av DLS med DMSO som fortynningsmiddel. Funksjonen DLS autokorrelasjon angir styrken på crosslinking gjennom første autokorrelasjon verdien og observasjon av en ryddig overgang til en verdi på null. Den stiplede linjen viser autokorrelasjon funksjonen for en partikkel med ingen crosslinker viser et svakt første signal og en bred nedbrytning tiden. Den heltrukne linjen viser autokorrelasjon etter en sterk crosslinker (i dette tilfellet tetraethylenepentamine), som viser et sterkt signal om første og en definert forfall tidsskala. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig6.jpg"> Figur 6: Supersaturation, S, som en funksjon av de relative blandingsforhold organisk løsemiddel vann. (A) sammenligning av høyeste oppnåelige supersaturation for (○) boscalid, plantevernmidler og (■) peptid B, en syv-rester modell peptid. Organisk strømmen inneholder boscalid i en konsentrasjon av 230 mg/mL og peptid B på 200 mg/mL, konsentrasjonene metning. Det er en maksimal supersaturation som avhenger av hver aktive farmasøytiske ingrediens (API) / løsemiddel systemet. (B) når konsentrasjonen av boscalid i organisk strømmen er redusert 20-fold, forholdene som supersaturation og nanoprecipitation er oppnådd blir begrenset. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Elsevier9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles at JoVE.com

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash NanoPrecipitation (FNP) er en skalerbar tilnærming til å produsere polymere core-shell nanopartikler. Lab-skala formuleringer for innkapsling av hydrofobe eller hydrofile therapeutics er beskrevet.

Flash NanoPrecipitation for innkapsling av hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Flash nanoprecipitation, eller FNP teknikker demonstrert her tilbyr en skalerbar og grei plattform for innkapsling hydrofobe eller hydrofile forbindelser inne polymere nanopartikler. For klarhet kalles teknikken som brukes til å innkapsle biologer inverse flash nanoprecipitation, eller IFNP. De underliggende prinsippene er uendret, men den resulterende nanopartikkelstrukturen er forskjellig.Vanligvis trenger nye brukere praksis for å konsekvent betjene innløpssprøytene når de manuelt lager små nanopartikkelpartiviser. Større volumer kan produseres med datastyrte sprøytepumper. Vår protokoll gir også detaljer om etterbehandling av nanopartikkelløsninger, noe som ofte er avgjørende for vellykket anvendelse av en formulering.Før du starter prosessen, må du kontrollere CIJ-mikserbeslagene, og forsikre deg om at utløpsslangen ikke krympes. Deretter fyller du to fem milliliter polypropylen gummifrie Luer-låsesprøyter med to til tre milliliter aceton, eller et annet rengjøringsmiddel. Lås sprøytene inn i innløpsadapterne, og sett enheten over en avfallsbeholder.Trykk jevnt ned stempelene for å sende løsningsmidlet gjennom blandekammeret i løpet av noen få sekunder. Fjern deretter sprøytene og tørk blandingen med en strøm av nitrogengass. Deretter, for å begynne å forberede løsningsmiddelinngangsstrømmen, pipette 0,25 milliliter av en 10 milligram per milliliter løsning av vitamin E, i stabilisatorfri tetrahydrofuran, inn i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Deretter pipette 0,25 milliliter av en 10 milligram per milliliter løsning av en blokk copolymer stabilisator i THF inn i samme rør. Vortex blandingen i fem til 10 sekunder, og sentrifuger den deretter på tusen G i fem til 10 sekunder for å gjenopprette væske som følge av hetten. Forbered et 1,5 milliliter sentrifugerør som inneholder 0,525 milliliter av deionisert vann som anti-løsningsmiddel.Deretter pipette fire milliliter av deionisert vann i en 20 milliliter scintillation hetteglass for å gjøre slukket bad. Plasser en liten rørestang i hetteglasset. Plasser den rene CIJ-mikseren over slukkebadet i et stativ eller en reagensrørblokk på en røreplate.Begynn å røre slukkebadet med ca. 75 % av maksimal mulig hastighet. Deretter monterer du en stump spiss nål til en en milliliter polypropylen gummifri sprøyte, og trekk opp anti-løsemiddelet. Utvis luftbobler forsiktig fra sprøyten, og fjern og kast deretter kanylen.Juster stempelet slik at væsken kommer rett til enden av sprøyten. Deretter fester du sprøyten til et av CIJ-viker. Trekk løsningsmiddelblandingen inn i en annen sprøyte på samme måte, og fest den til den andre innløpet.For å danne nanopartiklene, trykk samtidig på begge stempelene med en jevn jevn bevegelse på mindre enn 0,5 sekunder. Det er viktig å trykke ned sprøytene raskt, jevnt og jevnt. Du bør ikke plutselig slå sprøytene, men bør starte bevegelsen allerede i kontakt med toppen av sprøytene.Deretter setter du CIJ-mikseren over avfallsbeholderen, uten å fjerne sprøytene for å sikre at holdupvolumet ikke dreneres inn i spredningen. Fjern rørestangen fra scintillation hetteglasset, og cap den. Deretter fjerner og kaster du løsemiddel- og væskesprøytene.Rengjør mikseren før neste blits nanoforutståelsesstudie. For å forberede en prøve for dynamisk lysspredningsanalyse, pipette 100 mikroliter av spredningen til en cuvette. Tilsett 900 mikroliter slukket bad løsemiddel, og bland godt ved å pipettering før du starter prøveanalysen.For å begynne å montere mikroMIVM, plasser O-ringen i blandegeometriskiven. Juster hullene i blandeskiven etter tappene på toppskiven, og monter dem sammen, vær forsiktig så du ikke fortrenger O-ringen. Løsne utløpsslangen i den nederste mottakeren, og skru deretter de tilkoblede platene inn i mottakeren.Monter en skiftenøkkel til tappene på toppskiven, og stram til enheten. Trekk til utløpsslangen slik at den sitter godt mot bunnen av blandegeometriskiven. Kontroller at sprøytebeslagene på toppskiven er tettsittende.Hev den mobile platen på mikserstativet for å holde den ute av veien, og plasser deretter den monterte mikseren på stativet, med utløpsslangen gjenget gjennom støtteplaten. Deretter plasserer du et 15 milliliter sentrifugerør som inneholder 5,25 milliliter kloroform som slukkebadet under utløpsslangen. Deretter trekker du 0,75 milliliter oppløsning A, som er et fem mg per milliliter oppløsning av ovalbumin i dimetylsulfoksid i 10% vann i volum, inn i en ett milliliter gasstett Luer låsesprøyte med en stump tippet nål.Utvis forsiktig luftbobler, fjern nålen og prime løsningen til enden av Luer-monteringen. Koble sprøyten til et mikserinntak. Gjenta denne prosessen med 0,75 milliliter hver løsning B, som er seks milligram per milliliter blokkkopolymerstabilisator i DMSO, og løsning C, som er THF.Koble sprøytene til mikserinntakene med klokken, i alfabetisk rekkefølge. Forbered en 2,5 milliliter gasstett sprøyte som inneholder 1,85 milliliter oppløsning D, som er kloroform, og koble den til fjerde innløp. Kontroller at det ikke er noen signifikant forskjell i sprøytehøydene.Deretter griper du forsiktig lagerhuset på hver side av den mobile platen, og senk platen sakte til den bare knapt hviler jevnt på toppen av sprøytene. For å generere nanopartikler, jevnt og jevnt trykk platen i ca 0,5 til ett sekund. Deretter fjerner og cap slukke baderøret.Demonter og rengjør mikseren når den er ferdig. For å arbeide med større volumer, last oppløsningene i gasstette sprøyter og koble polytetrafluoretylenrør med Luer-beslag til sprøytene. Prime løsningene til endene av slangen.Klem sprøytene fast i sprøytepumper, og fest slangen til de aktuelle mikserinntakene. Plasser et lite hetteglass under utløpsslangen for oppsamling av oppstartsvolumet. Forbered slukkebadet og hold det i nærheten.Samtidig starter du pumpene, og la omtrent fem milliliter av avløpsvann strømme inn i hetteglasset med avfall. Deretter begynner du å samle nanopartiklene i slukkebadet som vanlig. En røreplate kan brukes til å blande slukkebadet om ønskelig.Fire replikeringer av FNP av polymere nanopartikler med en hydrofob kjerne, tilberedt i CIJ-mikseren, viste høy replikabilitet, og var relativt monodisperse, med en gjennomsnittlig diameter på 107 nanometer. En representativ feilbrann fra langsom eller ujevn sprøytedepresjon, produsert litt større partikler, mens polydispersitet var upåvirket i dette eksemplet, kan feilbranner resultere i mer polydisperse fordelinger. DLS autokorrelasjonsfunksjon forfalt jevnt for en representativ polymer nanopartikkelprøve.Denne glatte forfallet ble ikke observert da formuleringen ble forsøkt uten blokkkopolymerstabilisatoren, som produserte mikronskala oljedråper i stedet. Den relative mengden kjernemateriale til stabilisator kontrollerte partikkelstørrelsen, som vist her, i nanopartikler med en polystyrenkjerne. PDI var under 0,15 i hver formulering.Nanopartikler med hydrofile kjerner hvor produsert av IFNP. Partikler med maltodektriner kjerne, tilberedt i CIJ-mikseren, var omtrent 65 nanometer i diameter, og hadde en PDI på 0,08. Partikler med en ovalbuminkjerne tilberedt i mikroMIVM var ca. 125 nanometer i diameter, og hadde en PDI på 0,16.FNP og IFNP er kraftige verktøy for behandling av molekyler og nanopartikler. Før du utfører en av teknikkene, må du vurdere løselighetene til hver komponent i alle løsemidler, eller løsemiddelblandinger, for å sikre høy supermetning under blanding. Den grunnleggende teknikken er grei, men å mestre sprøytedepresjonstrinnene tar litt praksis.Hvis du har problemer med dette, bør du vurdere å bruke et sprøytepumpeoppsett som det som vises i denne videoen for å forbedre konsistensen. For ladede hydrofile molekyler, eller molekyler med mellomliggende løselighet, kan FNP kombineres med hydrofobe ionparing for å muliggjøre effektiv innkapsling. FNP kan også brukes til å innkapsle flere forbindelser i samme nanopartikkelkjerne.Se teksten og andre litteraturressurser for å lære hvordan du best kan fjerne organiske løsemidler fra nanopartikkeldispersjonene i ønsket applikasjon. Det finnes også en rekke teknikker for å stabilisere nanopartikler under lagring.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmering stamceller for Therapeutic Angiogenese Bruke biologisk nedbrytbart Polymer Nanopartikler

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanopartikler (SLNs) for Intracellulær målretting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produksjon av metall nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et verktøy for å studere de antibakterielle egenskapene til nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...