Name: flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles at JoVE.com

Detta arbete stöds av medel från Optimeos Life Sciences, National Science Foundation (Fortsättningssatsningen 1605816), av Bill och Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) och National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) tilldelas K.D.R.

Författarna har något att avslöja.

Inkapsling av hydrofoba föreningar såsom E-vitamin, som i steg 1 i protokollet, har varit utförligt beskrivna9,14,28. Monodisperse partiklar produceras relativt eftersom tidsskalan för blandning är kortare än tidsskalan för sammanläggning och tillväxt av partiklarna. Specifikt, blandad vätska/antisolvent lösningen blir snabbt homogen, vilket möjliggör kärnbildning inträffa jämnt. Montering av segmentsampolymerer till partikeln ytbehandlar sedan ger sterisk stabilisering som stoppar partikel tillväxt5. Eftersom blandning tid i kammaren (turbulens) är en funktion av flödesvärden inlopp till den (CIJ) eller MIVM, finns det en inlopp takt, som inträffar efter övergången till turbulenta blandning, där partikelstorleken är väsentligen konstant13. Detta ger extra tålighet mot processen som vissa sats till sats variation i inlopp flöde (dvs, spruta depression hastighet) kan tolereras utan betydande inverkan på den slutliga NP-storleken som framgår av figur 3. Långsammare eller ojämn inlopp hastigheter kan leda till större partiklar eller mer polydisperse distributioner, som sett för misständning exempel. FNP har också utvidgats för att kapsla in hydrofil föreningar i nanopartiklar av inversen Flash NanoPrecipitation. Dessa inverterad nanopartiklar kan sedan användas för att skapa mikropartiklar eller vara belagd med PEG att skapa vatten-spridbar nanopartiklar25. De underliggande montering principerna desamma, även om det finns extra komplexiteten av crosslinking partikel kärnan. Detta är nödvändigt för stabilisering av partikeln i en vattenlösning miljö. I allmänhet räcker förhållandet 1:1 kostnad jämfört med polyacid blocket, även om de joniska interaktionerna kan främjas genom pH-justering genom tillägg av en bas19. I detta protokoll, har endast första processteget till formuläret inverterad NPs beskrivits.
Förutom snabb blandning är lyckad formulering av FNP eller iFNP begränsad till fall där flera villkor kan vara mötta9,14. Först, alla strömma ingångar måste vara blandbar. Medan emulsioner har använts för att producera NPs, kräver FNP en enhetlig lösning fas i mixern. Andra måste huvudkomponenten vara nästan olösliga på lösningsmedel villkoren i mixern (för CIJ, en 50/50 blandning av volym) att köra snabb kärnbildning. Annars en betydande del förblir oinkapslat eller kommer fällningen efter ytterligare spädning med antisolvent. MIVM kan aktivera högre antisolvent innehåll i blandningskammaren adress core material löslighet begränsningar. Det är ofta användbart att generera övermättnaden kurvor från löslighet data som en funktion av lösningsmedel sammansättning att vägleda process design9. Figur 6 visar representativa kurvor för två föreningar. Låg övermättnaden vid blandande kammare villkor förtjänster på olika kompositioner, vanligtvis med hjälp av MIVM. Högre övermättnaden gynnar kärnbildning av huvudkomponenten över partikel tillväxt men ett matchningsfel för monteringstid av materiellt kärna ur och stabilisatorn kan resultera i stora aggregat av den terapeutiska. D'Addio och Prud'homme har granskat tillämpningen av sådana övermättnaden kurvor i detalj9. Slutligen BKP molekylärt måste upplösas i lösningsmedel strömmen och den antisolvent strömmen måste vara selektiv för ett kvarter. BCP-reglerna måste vara tillräckligt amfifila att ge både en solvophobic drivkraft från blocket kollapsade att förankra stabilisatorn på partikeln ytbehandlar och för solvatiserade blocket att förmedla sterisk stabilitet till partikeln. Lösningsmedel än de som beskrivs i protokollet kan användas så länge de uppfyller dessa begränsningar.
Öva med manuell spruta drift kan förbättra framgång under screening. Som nämnts ovan, innebär ovan övergången till homogena, turbulent blandande villkor att små variationer i flödet tolereras i processen28. Skala upp till pump-driven, dator-kontrollerade flöden resulterar i ännu större vinster i konsistensen på grund av reproducerbara inlopp flödesvärden. Vid något tillfälle under efterbearbetning av partiklarna, kan okulärbesiktning eller DLS analys tyda på närvaro av stora aggregat vilket kan bero på tillfällig damm eller partikel instabilitet. Vid behov kan strömmen filtreras med ett lämpligt filter porstorlek. I avsaknad av aggregat, har vi funnit att mindre än 5% massa förloras vanligtvis när filtrering PEG-belagd nanopartiklar om nominella filtret storlek är större än fördelningen av partiklarnas storlek. När filtrering aggregat, Experimentell bestämning av massa förlorade under processen är nödvändigt. Kvantifiering av massa förlusten kan utföras på ett av två sätt. Totala fasta massan i en given volym kan bestämmas genom termogravimetrisk analys före och efter filtrering för att identifiera omfattningen av förändringen (se Tilläggsinformation avsnitt 2). Alternativt, partiklarna kan vara återvunna (t.ex., genom att frystorka den) och upplöst i ett bra lösningsmedel. Koncentrationen av materiellt kärna ur kan sedan direkt mätas med en lämplig teknik såsom ultraviolett-synligt spektrofotometri eller kromatografi.
För FNP, måste de återstående 10 vol % organiskt lösningsmedlet (t.ex., THF) tas bort från vattendispersion. Detta kan göras genom evaporativ destillation14,29, dialys30eller tangentiell flow filtrering31,32. Praktiska överväganden för varje bearbetningssteg beskrivs i beaktandeleden som tillhandahålls. För dialys är typiska membran 3,5 kDa eller 6-8 kDa cutoffs, även om större alternativ finns. Detta molekylvikt cutoff räcker för lösningsmedel borttagning när dialyseras för 24 h använder flera bad förändringar. Användning av tangentiella flow filtrering medför vissa processutveckling som var noga med att undvika inducerande aggregation på grund av koncentrationen polarisering membran yta. Vi har funnit att minska organiska lösningsmedel sammansättning under ett system-beroende värde, vanligtvis 2-10 vol.%, eliminerar aggregering membran yta. Efter bearbetning, bestäms lätt koncentrationen av nanopartiklar genom termogravimetrisk analys (se Tilläggsinformation avsnitt 2). Det är ofta önskvärt att transportera eller förvara partiklar i en mycket stabil form. Aqueous dispersioner kan enkelt frysas snabbt använda en torr-is/aceton blandning och sedan förvaras vid-80 ° C. Alternativt, torrt pulver kan erhållas genom att frystorka den33,34 eller spraya torkning24. Ofta måste en frysskyddmedel läggas till minska nanopartiklar aggregation under frysning eller torkning. Socker (sackaros, trehalos, etc.), poly(ethylene glycol) eller cyklodextrin kan undersökas för effektivitet över en serie koncentrationer av kontroll storleken av DLS35,36,37, 38. Vanliga NP stabilitetsproblem under behandling är ofta relaterade till löslighet eller fas separation i kärnan resulterar i rearrangering mot ett lägre energitillstånd under förhållanden där rörlighet ökas. Användning av samtidig kärnan material, alternativa stabilisatorer eller modifierad extern lösning sammansättning kan bidra till att förbättra stabilitet14,16,17,39,40, 41.
Som nämnts ovan, gör MIVM högre antisolvent innehåll i blandningskammaren när krävs för att uppnå hög övermättnaden. Det kan också möjliggöra fysisk åtskillnad av arter i mer än två strömmar när reaktivitet eller löslighet begränsningar kräver det. Ett exempel är bildandet av zein protein-stabiliserad nanopartiklar av den antibiotiska klofazimin24. Den hydrofoba klofazimin introduceras i en aceton ström; Zein introduceras i en 60% enprocentig vattenlösning ström; kasein, som komplex med zein, förs in med en vattenlösning buffert ström, och den fjärde stream är extra buffert att öka förhållandet mellan vatten till aceton och etanol. Två vätska strömmar krävs eftersom klofazimin och zein inte är lösligt i ett vanligt lösningsmedel. Denna process skulle inte kunna åstadkommas inom en två-jet CIJ mixer. Detta protein-stabiliserad formulering visar också att FNP inte är begränsat till BCP stabilisatorer. Janus partiklar har producerats utan stabilisator42 och en rad billiga stabilisatorer har påvisats för muntliga ansökningar24. Särskilt, kan sampolymerer såsom hydroxipropylmetylcellulosa användas i stället för block sampolymerer24. Kärnan material kan göras mer hydrofoba genom ett antal olika tekniker. Hydrofoba ion ihopparning har tillämpats för att kapsla in ett brett utbud av föreningar som har mellanliggande löslighet43,44,45. Extremt hydrofoba prodrugs har varit genereras och sedan inkapslade46. Nukleinsyror har införlivats genom komplexbildning med katjoniska lipider47. Ännu viktigare, har dessa studier visat att FNP kan producera en rad partikel ytan kemiska sammansättningar. Ytterligare, blandad stabilisatorer som innehåller en bråkdel av BCP som har modifierats med en inriktning ligand på kedjan slutet har använts. Detta möjliggör exakt kontroll över ligand innehåll på ytan eftersom partikeln sammansättning speglar indataström sammansättning23,48. Likaså är det möjligt att införliva flera huvudkomponenter samt, inklusive färgämnen och oorganiska nanopartiklar3,8.
Flash NanoPrecipitation är en skalbar metod för polymera nanopartiklar består av antingen en hydrofob och en hydrofil kärna. Om de kriterier som räknas upp ovan är uppfyllda, vanligen kapslas över 95% av materiellt kärna ur på hög massfraktionen i partikeln. De tre exemplen som presenteras här genomfördes på bänk skala, som kräver några milligram av material och cirka 0,5 mL i varje inlopp ström. Detta möjliggör snabb screening av partikel villkor för formulering optimering. Uppskalning av bly formuleringar till större batchstorlekar handlar om kör processen längre, som lätt kan uppnås genom användning av sprutpumpar eller Flödesregleringsventiler. Däremot ansikten att skala upp bulk tillägg nanoprecipitation väldokumenterade utmaningar att upprätthålla tillräcklig micromixing vid tidpunkten för tillägg och redovisning av effekten av att ändra fartygets geometri49. Detta är ett stort hinder, eftersom det är avgörande att tillverka partiklar på ett konsekvent sätt att möta FDA krav50. Mikrofluidik tekniker kan också producera uniform, reproducerbara nanopartiklar, men endast möjliggöra produktion i intervallet milligram. Till exempel rapporterade Karnik et al. produktionstakt 0,25 mg/min för en läkemedelsfrisättning studera51. Ytterligare skala upp innebär vanligtvis parallelization på hög kapitalkostnad12. Med FNP är det enkelt att producera 1 gram av nanopartiklar på 600 mg/min med en sprutpump och några beslag att ansluta till mixer öppningarna. FNP representerar följaktligen en tillgänglig lab-skala screeningmetod för såväl som en skalbar metod för NP produktion för translationell arbete.

Sedan slutet av 1990, har det varit en stadig ökning av antalet kliniska prövningar som sysselsätter nanomaterial1,2. Det stigande intresset återspeglar löftet om nanomaterial att förbättra biotillgängligheten av hydrofoba droger och möjliggöra förmånsbehandling inriktning inom kropp3. Polymera nanopartiklar (kallas nanopartiklar eller NPs här) utgör en växande andel av denna klass av material2. NPs har rönt intresse eftersom de har mycket avstämbara egenskaper som storlek, sammansättning och ytan funktionalisering4. När tillämpas på förvaltningen av svårlösliga läkemedel, har NPs ofta en kärna-shell struktur där de terapeutiska är inkapslade i hydrofoba kärnan och skalet består av en hydrofil polymer borste. Ett enkelt sätt att generera denna struktur sysselsätter en amfifila diblock sampolymer (BCP) bestående av nedbrytbar hydrofobisk block, som utgör del av partikel kärnan, och en hydrofil poly(ethylene glycol) (PEG) blockera, som bildar den polymer borsten och förmedlar sterisk stabilisering4,5.
Nanoprecipitation är en vanlig fabrication teknik för polymera nanopartiklar eftersom det är enkelt och inte energi intensiv6. I sin enklaste form innebär nanoprecipitation tillägg med pipett NP komponenter i ett organiskt lösningsmedel som aceton till en överskottet rörs vatten. Spädningsvätska till en utspädd vattenlösning förändringen resulterar i utfällning av olösliga huvudkomponenten. Stabilisatorn monterar på denna växande partikel yta, regisserad av adsorption av kollapsade hydrofoba block7,8,9,10. En enhetlig partikelstorleksfördelning erhålls när den lösningsmedel och vatten snabbt blanda för att bilda en homogen lösning. Blandning som är långsammare än kärnbildning och montering av komponenter resulterar i en större, mer polydisperse partikel befolkningen. Men lätt åtkomliga för ett enkelt test, metoden rörs batch resulterar i bred variation på grund av blandning inkonsekvens och är inte mottagliga för skala upp6,11. Mikrofluidik har dykt upp som en annan avenue till NP produktion som kan köras kontinuerligt. Detta produktionsmedel har nyligen granskats av Ding o.a. 11 . En gemensam strategi använder laminärt flöde med fokus för att minska skalan lösningsmedel längd till sub micron värden. Blandning av antisolvent sker genom diffusion, så litet flöde dimensioner är avgörande för att säkerställa enhetliga partiklar11,12. Parallelization av flera mikroflödessystem kammare för skala upp är problematiskt för stora tillverkningsvolymer.
De snabba blandning villkor som gynnar enhetliga nanoprecipitation i mikrofluidik kan växelvis produceras i trånga, turbulenta flöden. Flash NanoPrecipitation (FNP) sysselsätter speciella blandning geometrier att uppnå dessa villkor högre volymetrisk flöden än möjligt med mikrofluidik. Inlopp strömmar ange en blandningskammare under turbulenta förhållanden som leder till generation av virvlar, så att vätska/anti-solvent lamellerna bildar på längd skala av diffusion11,13. Således, enhetlig blandning på en tidsskala som är kortare än kärnbildning och tillväxt av den terapeutiska uppnås. Mixern trånga geometri tillåter inte strömma förbi i regionen där turbulenta energiupptagning uppstår och hela systemet upplever samma process historia13. Kärnbildning uppstår enhetligt i blandningskammare och partikel tillväxt fortsätter tills stoppades av montering av BCP-reglerna på den ytan9,14. Den blandad ström som innehåller stabila partiklar kan sedan spädas med ytterligare antisolvent att undertrycka Ostwald mognad av partiklar15,16,17.
En mixer med trånga impinging i jet (CIJ) är den enklaste mixer designen för FNP och tillåter blandning av två strömmar i en skalbar och kontinuerlig mode, som visas i figur 1A13. En multi inlopp vortex mixer (MIVM) utvecklades för att aktivera upp till fyra olika stream ingångar samtidigt fortfarande uppnå den snabba micromixing som krävs för enhetlig partikelbildning, som visas i figur 1B18. FNP möjliggör enkel formulering screening som lätt kan översättas till kommersiell skala produktion. Kontinuerlig pågrund av processen kräver större batchstorlekar inte nya fartyg men snarare längre körtider, möjliggör enkel översättning till kilogram produktion i samma utrustning tåget.
Hydrofil föreningar såsom peptider och proteiner ('biologics') kan också vara inkapslade i en process kallas inversen Flash NanoPrecipitation (iFNP). Tekniken kräver en amfifila BCP där ett kvarter är hydrofoba och den andra är en polyacid19. Det första steget innebär snabb blandning av en dimetyl sulfoxid (DMSO) dataström med den biologiska och BCP mot lipofilt lösningsmedel såsom diklormetan eller kloroform. Detta resulterar i bildandet av partiklar stabiliserad med hydrofoba block borsten. Här, benämns sådan arkitektur en 'omvända' NP. Kärnan innehåller den polyacid, som sedan ionically tvärbunden med en multivalenta cation. Detta stabiliserar partiklarna för bearbetning till en vattenlösning miljö i form av mikropartiklar eller PEG-belagd nanopartiklar av tekniker som har rapporterats i litteraturen19,20,21.
Detta protokoll kan användas för lab-skala produktion av Polymera core-shell nanopartiklar encapsulating antingen hydrofoba eller hydrofila föreningar. Underavsnitten i protokollet ge instruktioner om användningen av båda mixer klasser - den (CIJ) och MIVM. Läsaren bör kunna anpassa protokollet för romanen kärnkomponenter och reproducibly generera nanopartiklar av önskad storlek med hjälp av lämpliga mixern för stream ingångar. Tre exempel formuleringar använder FNP och iFNP presenteras nedan. Två sysselsätter CIJ mixern och en kräver MIVM15,22. Den första formuleringen visar inkapsling av en modell hydrofoba sammansatta av FNP. Den andra formuleringen visar inkapsling av en modell hydrofil förening av iFNP i en CIJ mixer. Den slutliga formuleringen ger ett exempel på protein inkapsling av iFNP med en MIVM. Protokollet för denna tredje formulering beskriver användningen av en småskalig, handhållna MIVM kallas den 'μMIVM'. Mixer design är mindre att möjliggöra förenklade formulering screening, men beteendet skalning är väl förstådda och mixern är inte en mikroflödessystem enhet22. Den sista delen av protokollet innehåller några anteckningar om uppskalning av bly formuleringar identifieras i screening. Dessa formuleringar är avsedda att ge åtkomstpunkter för lärande processen och följaktligen använda icke-nedbrytbara poly (styren)-baserade polymerer. Alternativa stabilisatorer har beskrivits i litteraturen, med ett antal biokompatibla kommersiella alternativen tillgängliga14,23,24.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confined Impinging Jets Mixer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-604</td>
			<td>Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug fitting</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-309</td>
			<td>Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-205</td>
			<td>Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet ferrule - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - CIJ</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>1517</td>
			<td>Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn&#39;t protrodue into mixing chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T425-4</td>
			<td>Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Norm-ject syringe (3 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53548-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E (&#945;-tocopherol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90669-50G-F</td>
			<td>Store cold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P13141-SEO</td>
			<td>Other block sizes acceptable depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene)1.8k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P2275-S</td>
			<td>Example hydrophobic core material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vial</td>
			<td>DWK Lifesciences</td>
			<td>74504-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk)</td>
			<td>National</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltodextrin DE 4-7</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>419672-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P5917-SAA</td>
			<td>Other block sizes acceptable depending on application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihdyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506-25G</td>
			<td>Hygroscopic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423300250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5503-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Inlet Vortex Mixer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet fitting - MIVM</td>
			<td>Idex Health &#38; Science</td>
			<td>P-942</td>
			<td>Combination with ferrule</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outlet tubing - MIVM</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Fit to ferrule ID.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-ring (MIVM)</td>
			<td>C.E. Conover</td>
			<td>MM1.5 35.50 V75</td>
			<td>Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer stand</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See Markwalter &#38; Prud&#39;homme for design.17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles

Utformningen av en terapeutisk förening till nanopartiklar (NPs) kan ge unika egenskaper. För dåligt vattenlösligt läkemedel, kan NP formuleringar förbättra biotillgänglighet och ändra narkotika distribution i kroppen. För hydrofil droger som peptider eller proteiner, kan inkapsling inom NPs också ge skydd från naturliga clearance mekanismer. Det finns några tekniker för produktion av Polymera NPs som är skalbar. Flash NanoPrecipitation (FNP) är en process som använder konstruerad blandande geometrier för att producera NPs med smala storlek distributioner och avstämbara storlekar mellan 30 och 400 nm. Detta protokoll ger instruktioner på laboratorieskala produktionen av core-shell polymera nanopartiklar av en Målstorlek som använder FNP. Protokollet kan genomföras för att kapsla in antingen hydrofil eller hydrofoba föreningar med endast smärre ändringar. Tekniken kan användas lätt i laboratorium vid milligram skala till skärmen formuleringar. Bly träffar kan direkt skalas upp till gram och kilo-skala. Som en kontinuerlig process innebär skala upp längre blandning processen körs tid snarare än översättning till nya Processkärl. NPs produceras av FNP är mycket laddade med terapeutiska, har en tät stabiliserande polymeren borste, och en storlek reproducerbarhet ± 6%.

Screening av NP formuleringar med FNP är snabb och kräver små kvantiteter av material (storleksordningen 1-10 mg). FNP protokollet att kapsla in hydrofoba föreningar såsom E-vitamin (steg 1) resulterar i en stabil, klar eller lätt opalescent NP dispersion. Dynamiska ljusspridning (DLS) tillhandahåller en robust sätt att karakterisera partikelstorlek. I figur 3visas processen ger NPs med en låg polydispertion på ett reproducerbart sätt. Den typiska polydispertion indexet (PDI) är mindre än 0,20, som indikerar en relativt monodisperse befolkningen. PDI erhålls från funktionen autokorrelation och genomförs ofta i instrumentet programvara. Det är ett förhållande av andra till första stund, där värden av 0,1 erhålls vanligtvis för monodisperse partiklar26. För fyra vitamin E/PS-b-PEG formulering replikat rapporterade, värdet var 0,12 ± 0,02 och den genomsnittliga diametern 107 ± 7 nm. En typisk ”feltändning” på grund av antingen ojämna depression av sprutor eller långsammare depression rapporteras också i figur 3. Polydispertion var opåverkad, men storleken var något större (135 nm). Inklusive detta prov är nya mätvärden för partikelstorlek 113 ± 14 nm. En misständning resulterar i perioder där kammaren innehåller bara en enda Strömtyp. Det är viktigt att hela strömmen upplever samma process historik och relativa mängder organiska och vattenaktig strömmar inom mixern. Utan en stabilisator produceras en ogenomskinlig lösning med synliga aggregat. DLS autokorrelation funktion för detta prov är icke-monoton och förfalla inte smidigt, som sett i den figur 3 infällt.
Partikel storlekskontroll av FNP demonstreras i figur 4, där varierar de relativa mängder core material – poly(styrene)1.8 k i detta fall – och PS -b-PEG stabilisator resulterade i partiklar storlekar som varierade från 49-152 nm. Dessa partikelstorlek genererades med THF strömmar som innehåller en totala masskoncentrationen av kärna och stabilisator av 20 mg/mL, 25%, 50% eller 75% av massan var poly(styrene) core materialet. Polydispertion av nanopartiklar var alltid mindre än 0,15. Omfattande diskussion om parametern effekter på partikelstorlek som produceras av FNP kan hittas i litteratur10. Lastning kan ställas in genom att hålla konstanten lösningsmedel volym och varierande relativa volymerna av core och stabilisator lager lösningar. Likaså kan den totala masskoncentrationen varieras genom att förbereda stamlösningar på andra värden än 10 mg/mL. Under vissa villkor är det möjligt att observera en tom micelle befolkning av DLS27. Detta har inte någon skadlig effekt än bredda den uppmätta partikelstorleksfördelning. När storlekarna är liknande, kan detta manifesteras som en enda bred topp snarare än två separata toppar.
Samma CIJ mixern kan också användas att kapsla in hydrofil föreningar av iFNP, som exemplifieras i steg 2 i protokollet. De partiklar som produceras i rapporterade formuleringen är omkring 65 nm med en låg polydispertion av 0,08. Storleksfördelning kan ses i figur 5A (streckade linjer). Effekten av crosslinking PAA karboxylsyra rester på partikel stabilitet framgår av DLS analys i ett starka lösningsmedel som DMSO, som visas i figur 5B. Autokorrelation funktion för brunn-tvärbunden partiklar bör börja nära värdet 1 och släpp kraftigt till 0 samtidigt karakteristiska som är relaterade till partikelstorlek (heldragen linje). Partiklar som sväller i stor utsträckning eller upplösa är inte tvärbundna och Visa minimal autokorrelation signal (streckad linje). För iFNP manifestera misslyckade försök på liknande sätt som beskrivs för FNP ovan. Synliga aggregat kan ses eller dålig DLS autokorrelation funktion form kan observeras. MIVM kan användas för FNP eller iFNP när mer än två inlopp strömmar krävs på grund av systemet begränsningar såsom löslighet eller kemisk inkompatibilitet. En småskalig version av MIVM (μMIVM) med dess mixer stativ visas i figur 2. Som med CIJ, kan denna mixer användas att kapsla in hydrofoba eller hydrofila föreningar22. I steg 3 beskrevs ett protokoll för inkapsling av en hydrofil protein, ägg, av iFNP. Fördelningen av partiklarnas storlek visas i figur 5A (heldragen linje). Storleken är ca 125 nm med en PDI av 0,16. Ett allmänt protokoll för spruta pump drift vid större skalor finns i steg 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig1.jpg"> Figur 1: Mixer montering och inre flöde mönster scheman. (A) den trånga inkräkta jets (CIJ) mixer med bifogade sprutor är placerad ovanför quench badet. Inte på bilden är en uppståndelse bar i injektionsflaskan quench bad och en uppståndelse tallrik. Blandande geometri avbildas i den utökade vyn visar de två stream inlopp som inkräktar i mitten av salen. (B) en multi inlopp vortex mixer (μMIVM) visas med glas sprutor och är placerad i stativet ovanför badkar dämpningen. Den mobila plattan och den mekaniska stannar har beskurits från bilden. Den utökade vyn visar vortex kammaren och inlopp kanalerna schematiskt. (C), en schematisk representation av core-shell NPs produceras av FNP. Red sfärer representerar den terapeutiska som i kombination med blå kollapsade polymer blocket, omfatta NP kärnan. Blocket gul polymer bildar borste lagret förmedla sterisk stabilisering till den NPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig2.jpg"> Figur 2: μMIVM terminologi och komponenter för montering. ΜMIVM kräver en mixer stå att aktivera enhetlig depression av fyra sprutor. I det här fallet måste sprutkolven höjder vara enhetliga för att säkerställa konsekvent mixning. Det kan alternativt styras med sprutpumpar. Mixer stativet med märkta komponenter visas till vänster i figuren. Till höger är nedmonterat mixern med o-ringen på plats på skivan med blandande geometri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig3.jpg"> Figur 3: Partikel storlek distribution av Polymera nanopartiklar som innehåller en kärna av vitamin E och stabiliseras med PS -b-PEG. Dynamiska ljusspridning (DLS) ger intensitet-viktade storlek distributioner som anger NP diameter fördelningen. Kurvor är genomsnittet av tre exemplar analyser för varje rättegång och har varit skalas för att producera identiska högsta toppar. De fyra replikat (heldragna linjer) indikerar hög reproducerbarhet av metoden (standardavvikelse = 7 nm). Dessutom ingår en representant misständning (streckad linje), såsom långsammare spruta eller ojämn depression av två sprutor, vilket resulterar i större partikeldiameter. Standardavvikelsen för NP storlek inklusive misständning var 14 nm. (Infälld) Utan på PS -b-PEG stabilisator, stora micron-skala aggregat (eller droppar, i fråga om en olja som vitamin E) bildas. DLS autokorrelation funktionen av en körning utan stabilisator (streckad linje) visas tillsammans med en representativ autokorrelation från en nanopartikel replikera (heldragen linje). Autokorrelation funktion visar ett antal karaktäristiska tidsskalor för det stickprov, som anger en polydisperse befolkning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig4.jpg"> Figur 4: partikel storlekskontroll av FNP genom varierande relativ nyckeltal för core material till stabilisator. De intensitet-viktade storlek distributionerna av tre formuleringar med en poly(styrene) kärna stabiliseras av PS -b-PEG är avbildade. Den totala masskoncentrationen i THF var 20 mg/mL och antisolvent vatten. Formuleringarna var beredda i en CIJ mixer. Fraktionen av massan består av materiellt kärna ur visas i förklaringen. Till exempel 25% core provet innehöll 5 mg/mL poly(styrene) och 15 mg/mL PS -b-PEG. De genomsnittliga storlekarna för 25% (heldragen linje), 50% (streckad linje) och 75% (blandade streckad linje) core belastningar var 49 nm, 96 nm och 152 nm, respektive. Alla PDI värden var mindre än 0,15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig5.jpg"> Figur 5: karakterisering av inverterad NPs gjort under en CIJ mixer eller μMIVM. (A), DLS kurvor är genomsnittet av tre exemplar analyser för varje formulering. Den streckade linjen visar fördelningen av storlek 3 k MD partiklar gjort i CIJ mixer medan den heldragna linjen är storlek distribution av OVA partiklar i μMIVM. (B), styrkan av crosslinking kan bedömas av DLS använda DMSO som spädningsvätska. DLS autokorrelation funktion anger styrkan av crosslinking genom inledande autokorrelation värdet och observation av en ren övergång till ett värde av noll. Den streckade linjen föreställer autokorrelation funktion för en partikel med ingen crosslinker visar en svag första signal och en bred förfalla time. Den heldragna linjen skildrar autokorrelation efter tillägg av en stark crosslinker (i detta fall, tetraethylenepentamine), som visar en stark initial signal och en definierad decay tidsskalan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig6.jpg"> Figur 6: övermättnaden, S, som en funktion av de relativa blandning nyckeltal av organiskt lösningsmedel till vatten. (A) jämförelse av högsta uppnåeliga övermättnaden för (○) boscalid, bekämpningsmedel och (■) peptid B, en sju-rester modell peptid. Den organiska strömmen innehåller boscalid vid en koncentration på 230 mg/mL och peptid B 200 mg/ml, mättnad koncentrationer. Det finns en maximal övermättnaden som beror på varje aktiv farmaceutisk ingrediens (API) / lösningsmedel system. (B) När koncentrationen av boscalid i organiska flödet minskas 20-faldigt, de villkor som där övermättnaden och nanoprecipitation är nått bli begränsad. Denna siffra återges med tillstånd från Elsevier9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles at JoVE.com

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash NanoPrecipitation (FNP) är en skalbar metod att producera polymera core-shell nanopartiklar. Lab-skala formuleringar för inkapsling av hydrofoba eller hydrofila therapeutics beskrivs.

Flash NanoPrecipitation för inkapsling av hydrofoba och hydrofil föreningar i polymera nanopartiklar

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Blixten nanoprecipitation, eller FNP tekniker som visas här erbjuder en skalbar och okomplicerad plattform för inkapsling hydrofoba eller hydrofila föreningar inuti polymera nanopartiklar. För tydlighetens skull kallas den teknik som används för att kapsla in biologiska läkemedel inversa blixtnanopitation, eller IFNP. De underliggande principerna är oförändrade, men den resulterande nanopartikelstrukturen är annorlunda.Generellt, nya användare behöver praxis att konsekvent driva inloppssprutorna när manuellt göra små nanopartikel partier. Större volymer kan produceras med datorstyrda sprutpumpar. Vårt protokoll ger också detaljer angående efterbearbetning av nanopartikellösningar, vilket ofta är avgörande för framgångsrik tillämpning av en formulering.Innan processen startas, kontrollera CIJ mixerbeslag, och se till att utloppsslangen inte pressas. Fyll sedan två fem milliliter polypropylengummi fria Luer lås sprutor med två till tre milliliter aceton, eller en annan rengöring lösningsmedel. Lås in sprutorna i inloppsadaptrarna, och ställ in monteringen över en avfallsbehållare.Tryck stadigt ned plungers för att skicka lösningsmedlet genom blandningskammaren under loppet av några sekunder. Ta sedan bort sprutorna och torka blandningen med en ström av kvävegas. Nästa, att börja förbereda lösningsmedel input stream, pipetten 0,25 milliliter av en 10 milligram per milliliter lösning av vitamin E, i stabilisator fri tetrahydrofuran, till en 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.Sedan, pipettera 0,25 milliliter av en 10 milligram per milliliter lösning av en block copolymer stabilisator i THF i samma rör. Vortex blandningen i fem till 10 sekunder, och sedan centrifug det på ettusen G i fem till 10 sekunder för att återvinna vätska som ansluter sig till locket. Förbered ett 1,5 milliliter centrifugeringsrör som innehåller 0,525 milliliter avjoniserat vatten som det anti-lösningsmedlet.Sedan pipettera fyra milliliter av avjoniserat vatten i en 20 milliliter scintillation injektionsflaska för att göra släcka badet. Placera en liten omrörning bar i injektionsflaskan. Placera den rena CIJ-mixern över släckbadet i ett rack eller provrörsblock på en omrörningsplatta.Börja röra om i släckbadet med ca 75 %av högsta möjliga hastighet. Sedan, montera en trubbig tippade nål till en en milliliter polypropylen gummi fri spruta, och dra upp anti-lösningsmedel. Utvisa försiktigt luftbubblor från sprutan, och ta sedan bort och släng nålen.Justera kolven så att vätskan kommer precis till slutet av sprutan. Fäst sedan sprutan på en av CIJ-inloppen. Dra lösningsmedelsblandningen i en andra spruta på samma sätt, och fäst den på det andra inloppet.För att bilda nanopartiklarna, tryck samtidigt ner båda plungers med en jämn likformig rörelse på mindre än 0,5 sekunder. Det är kritiskt att trycka ned sprutorna snabbt, jämnt, och smidigt. Du bör inte plötsligt slå sprutorna, men bör börja motionen redan i kontakt med topparna på sprutorna.Därefter ställer du in CIJ-mixern över avfallsbehållaren, utan att ta bort sprutorna för att säkerställa att holdup-volymen inte rinner ut i spridningen. Ta bort rörstången från scintillationsflaskan och locket. Ta sedan bort och kassera sprutorna för lösnings- och medellösningsmedel.Rengör mixern innan nästa blixt nanoprecipitation rättegång. För att förbereda ett prov för dynamisk ljusspridningsanalys, pipetter 100 mikroliter av spridningen till en cuvette. Tillsätt 900 mikroliter av släcka bad lösningsmedel, och blanda väl genom pipettering innan du startar provanalysen.För att börja montera mikro MIVM, placera O-ringen i mixergeometriskivan. Rikta in hålen i blandningsskivan med pinnarna på den övre skivan, och passa ihop dem, var noga med att inte tränga undan O-ringen. Lossa utloppsslangens passning i bottenmottagaren och skruva sedan fast de anslutna skivorna i mottagaren.Montera en skiftnyckel till pinnarna på den översta skivan, och dra åt monteringen. Dra åt utloppsslangens beslag så att den sitter stadigt mot mixergeometriskivans nedersta ansikte. Se till att sprutbeslagen på den övre skivan är ombonade.Höj mobilplattan på blandarstativet för att hålla den ur vägen, placera sedan den monterade mixern på stativet, med utloppsslangen gängad genom stödplattan. Placera därefter ett centrifugrör på 15 milliliter som innehåller 5,25 milliliter kloroform som släcka badet under utloppsslangen. Dra sedan 0,75 milliliter lösning A, som är en fem milligram per milliliter lösning av ovalbumin i dimetylsulfoxid i 10%vatten i volym, till en milliliter gas tight Luer lås spruta med en trubbig tippad nål.Rek ut försiktigt luftbubblor, ta bort nålen, och prima lösningen till slutet av Luer-tillpassningen. Anslut sprutan till ett blandarinlopp. Upprepa denna process med 0,75 milliliter vardera av lösning B, vilket är sex milligram per milliliter block copolymer stabilisator i DMSO, och lösning C, som är THF.Anslut sprutorna till blandarens inlopp medurs, i alfabetisk ordning. Förbered en 2,5 milliliter gastät spruta som innehåller 1,85 milliliter lösning D, som är kloroform, och anslut den till det fjärde inloppet. Bekräfta att det inte finns någon signifikant skillnad i spruthöjderna.Sedan, försiktigt greppa lagerhuset på varje sida av den mobila plattan, och sakta sänka plattan tills det bara knappt vilar jämnt ovanpå sprutor. För att generera nanopartiklar, stadigt och smidigt trycka ner plattan i ca 0,5 till en sekund. Ta sedan bort och locket på släcka badröret.Ta isär och rengör mixern när den är klar. För att arbeta med större volymer, ladda lösningarna i gastäta sprutor, och koppla polytetrafluoretylenslangar med Luer-beslag till sprutorna. Prime lösningarna till ändarna av slangen.Kläm fast sprutsprutorna i sprutpumpar, och fäst slangen på lämpliga blandarinlopp. Placera en liten avfallsflaska under utloppsslangen för insamling av startvolymen. Förbered släckbadet och förvara det i närheten.Samtidigt, starta pumparna, och låt cirka fem milliliter av spillvatten flöda in i avfallsflaskan. Sedan börjar samla nanopartiklarna i släcka badet som vanligt. En omrörningsplatta får användas för att blanda släckbadet om så önskas.Fyra replikat av FNP av polymera nanopartiklar med en hydrofoba kärna, beredd i CIJ mixer, visade hög replikerbarhet, och var relativt monodisperse, med en genomsnittlig diameter på 107 nanometer. En representativ misständning från långsam eller ojämn spruta depression, produceras något större partiklar, medan polydispersity var opåverkad i detta exempel, kan misständningar resultera i mer polydisperse distributioner. DLS auto-korrelationsfunktionen förmultnade smidigt för ett representativt polymert nanopartikelprov.Detta släta förfall observerades inte när formulering försökte utan blocket copolymer stabilisator, som producerade mikron skala oljedroppar istället. Den relativa mängden kärnmaterial till stabilisatorn kontrollerade partikelstorleken, som visas här, i nanopartiklar med en polystyrenkärna. Den PDI var under 0,15 i varje formulering.Nanopartiklar med hydrofila kärnor där de produceras av IFNP. Partiklar med en maltodextrin kärna, beredd i CIJ mixer, var cirka 65 nanometer i diameter, och hade en PDI på 0,08. Partiklar med en ovalbumin kärna beredd i mikro MIVM var cirka 125 nanometer i diameter, och hade en PDI på 0,16.FNP och IFNP är kraftfulla verktyg för bearbetning av molekyler och nanopartiklarna. Innan du utför antingen teknik, se till att överväga solubilities av varje komponent i alla lösningsmedel, eller lösningsmedel blandningar, för att säkerställa hög super mättnad under blandning. Den grundläggande tekniken är okomplicerad, men behärskar sprutan depression steg tar lite övning.Om du har problem med detta, överväga att använda en spruta pump setup som den som visas i den här videon för att förbättra konsistensen. För laddade hydrofila molekyler, eller molekyler med mellanliggande löslighet, kan FNP kombineras med hydrofoba jonparning för att möjliggöra effektiv inkapsling. FNP kan också användas för att kapsla in flera föreningar i samma nanopartikelkärna.Konsultera texten och andra litteraturresurser för att lära dig hur du bäst tar bort organiska lösningsmedel från nanopartikelspridningarna i önskad applikation. Det finns också en rad tekniker för att stabilisera nanopartiklar under lagring.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

En metod för äggblåsa Inkapsling och kultur i ett Proteolytically Nedbrytbara 3 dimensionellt system

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Lysrör Nanopartiklar för mätning av jonkoncentration i biologiska system

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering av Diblock polymera nanopartiklar genom Nanoprecipitation Teknik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Hydrofob Salt modifierade Nafion för enzymimmobilisering och stabilisering

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virala Nanopartiklar för<em&gt; In vivo</em&gt; Tumöravbildning

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Programmerings stamceller i terapeutiska Angiogenes använda biologiskt nedbrytbara polymera nanopartiklar

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Inkapsling av Cellfritt Transkription och översättning Maskiner i vesiklar för uppförande av Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipid Nanopartiklar (SLNs) för Intracellulär Targeting Tillämpningar

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produktion av metall nanopartiklar genom pulserad laserablation i vätskor: Ett verktyg för att studera de antibakteriella egenskaperna hos nanopartiklar

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...