Name: detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

يشكر المؤلفون وانغ على "الوطني معهد لعلوم الصحة البيئية" (نيس) والدكتور سوييوشي لعلى قراءة نقدية للمخطوطات، و "جيفرسون تانر" لتنفيذ إجراءات على شريط الفيديو. وأيد 1ZIAES070065 "المعاهد الوطنية للصحة منحة" (إلى K.S.K.) من "شعبة البحوث الداخلية" من نيس هذا العمل.

1-إعداد والبلازميدات المقايسة الهجين اثنين الثدييات
<ol><li>استخدام البلازميدات التالية: لوك pG5، ببيند-ERαEF، وميثاق-ERαEF. ملاحظة: والبلازميدات المتوفرة من المؤلفين عند الطلب ويتم إرسالها على ورق الترشيح. لوك pG5 هو بلازميد المراسل الذي يحتوي على تكرار خمسة من GAL4 تنصهر العناصر متجاوبة مع وحدة ?...

<ol>
	<li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F+domain+of+estrogen+receptor+&#945;+is+involved+in+species-specific,+tamoxifen-mediated+transactivation.">The F domain of estrogen receptor &#945; is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li><li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor.">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li><li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+estrogen+receptor/coactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen.">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li><li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization.">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li><li>Montano, M. M., M&#252;ller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor:+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists.">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), 814-825 (1995).</li><li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+&#945;+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions.">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor &#945; that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li><li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cell Culture Protocols. , (2011).</li><li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+&#945;+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element.">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor &#945; Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li><li>Huang, H. -. J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists.">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), 1778-1792 (2002).</li><li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries:+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta.">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li><li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+&#945;+L543A,+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists,+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity.">Estrogen receptor &#945; L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li></ol>

هنا، نحن وصف البروتوكول للمقايسة M2H، مع التركيز على شروط الفحص للكشف عن نشاط هوموديميريزاتيون قام ERα كمثال. وبصفة عامة، الإنزيم M2H ليست شعبية للتقييم ليجند-تعتمد على نشاط ثنائي قام ERα. هذا سبب الإعلان ERα حيازة دالة تنشيط النسخي؛ النشاط الذي يزعج، في بعض الحالات، نتائج التحليل M2H. ومع ذلك، ك?...

الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) منظم إستروجين يجند تعتمد على نسخ. الغاية هو المحافظة سيكوينسيوف الأحماض الأمينية ERα فيما بين الأنواع. بسبب التماثل أعلى بين الإنسان والفأر ERα، وهو فكر وظيفة هذه المستقبلات متطابقة كما والتفاضلية النشاط الاستروجيني المواد (مثلاً، تاموكسيفين) في هذه الأنواع هو الناجم عن اختلاف الأنواع الأيض الكيميائية بدلاً من الاختلافات الهيكلية من ERα. وقد حفظت ERα عالية مجال الهياكل المشتركة بين فوق عائلة مستقبلات النووية (NR)، عين أ لمجالات و. ه المجال أو المجال ملزم يجند (الإعلان) وتشمل جيب ملزم يجند ووظيفة التنشيط النسخي 2، المسماة بالعربية-2. المجال و هو مترجم متاخم للمجال الإلكتروني وهو المجال الأكثر متغير بين شمالي البحر الأحمر. وحتى بين الإنسان والفأر ERα، والتماثل في المجال و أقل بكثير من أن المجالات الأخرى1. ويعزز قام يجند متجهة من ERα هوموديميريزيشن البروتين ERα لربط عنصر الحمض النووي الإستروجين استجابة محددة مباشرة لتنظيم النسخ الجيني يجند تعتمد على (العمل الكلاسيكي من ERα). وقد كشفت الدراسات بلورية التفاضلية وضع اللولب 12 (AF-2 المجال الأساسية) مع استراديول (E2)-أو 4-هيدروكسي-تاموكسيفين (4OHT)-منضمة قام dimers2،3. المجال و ERα (الأحماض الأمينية 45) الاتصال اللولب 12 مباشرة. ومع ذلك، لا توجد معلومات فيما يتعلق بالأثر هذا التمديد من الأحماض الأمينية 45 (و المجال) من اللولب 12 على ثنائي قام ERα. في هذه الدراسة، ونظهر المساهمة في المجال و إلى إبلاغها هوموديميريزيشن قام ERα 4OHT-تعتمد على استخدام مقايسة (M2H) اثنين-هجين الثدييات.
والرزن M2H طريقة لإظهار تفاعلات البروتين البروتين في خلايا الثدييات إدخال المعينة بلازميد مختلفة ثلاث: البروتين هما التعبير والبلازميدات، التي تعبر عن GAL4 الحمض النووي ملزم المجال (DBD) الانصهار الانصهار قام ERα و VP16AD قام ERα، تنصهر GAL4RE لوسيفراس التعبير بلازميد مراسل. عندما تتفاعل الانصهار GAL4DBD قام ERα والانصهار VP16AD قام ERα (جعل ديمر) في الخلايا، هذا البروتين المعقدة يربط GAL4RE و، ثم، ينشط لوسيفراس التعبير الجيني من خلال وظيفة transactivation تعتمد على VP16AD. ويمكن تقييم مستوى هوموديميريزيشن قام بنشاط لوسيفراس.
الإنزيم (Y2H) اثنين-الهجين الخميرة هو أسلوب بديل يستند إلى المبدأ نفسه الذي يستخدم الخميرة كبيئة المضيف. أظهرت تقارير سابقة باستخدام نظام Y2H أن يزيد قام ERα البشرية والمجال اقتطاع E2-تعتمد على كواكتيفاتور التوظيف والختامية أن المجال و يمنع النسخ E2 بوساطة4. هذه النتيجة لا يتسق مع التقارير الأخرى التي أظهرت نشاط النسخي الموهنة ERα البشرية والمجال اقتطاع في خلايا الثدييات5،6. مؤخرا، أظهرت دراستنا، استخدام نظام M2H، أن كواكتيفاتور E2-تعتمد على نشاط التوظيف البشرية ERα قام يتناقص باقتطاع المجال و في خلايا الثدييات، ويتسق مع النسخ النشاط1. هذه الملاحظات تشير إلى أن دور التفاعل البروتين-بروتين الفسيولوجية تختلف بطريقة خاصة بنوع الخلية والسياق. يمكن أن تثبت مقايسة M2H البروتين-بروتين تفاعل النشاط في نفس السياق الخلوية التي تستخدم لتحديد النشاط الترانسكربتي. وهذا يوفر ميزة للمقايسة M2H مقارنة في Y2H أو في المختبر البروتين-بروتين التفاعل تحليلات أخرى.
لا تزال هناك أسئلة تتعلق بالآليات الجزيئية لنشاط مؤثر جزئي المغيرون مستقبل الإستروجين الانتقائي (SERMs) (مثلاً، 4OHT) لتنظيم النسخ ERα بوساطة. يمكن تطبيق فحوصات M2H المستندة إلى قام ERα بدراسة إليه نشاط مؤثر جزئي سيرمس في مختلف أنواع الخلايا الثديية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:891px;" width="891">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pG5-Luc</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E249A</td>
			<td style="width:360px;">Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pBIND</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E245A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">pACT</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E246A</td>
			<td>Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge Rotor</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing Buckets</td>
			<td>SORVALL</td>
			<td>75006441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Resuspension Solution (CRA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Lysis Solution (CLA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neutralization Solution (NSA)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Column Wash Solution (CWB)</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A8102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Midicolumns</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>A7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">51200038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BenchMark fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum</td>
			<td>Gemini-Bio</td>
			<td>100-119</td>
			<td>Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31053028</td>
			<td>for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Passive Lysis 5X Buffer</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td style="width:112px;">Promega</td>
			<td>E1980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax L microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">SoftMax Pro Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting the ligand-binding domain dimerization activity of estrogen receptor alpha using the mammalian two-hybrid assay

الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) منظم إستروجين يجند تعتمد على نسخ. هو يحافظ تسلسل البروتين ERα عالية بين الأنواع. وقد كان يعتقد أن وظيفة الإنسان والفأر ERαs مطابق. علينا أن نظهر تأثير التفاضلية 4-هيدروكسي-تاموكسيفين (4OHT) على الماوس والبشرية ERα ملزم يجند المجال (الإعلان) ثنائي النشاط باستخدام المقايسة (M2H) اثنين-الهجين الثدييات. والرزن M2H يمكن إثبات كفاءة الإعلان هوموديميريزيشن النشاط في خلايا الثدييات، الاستفادة من تعداء من اثنين والبلازميدات التعبير البروتين (GAL4 الحمض النووي ملزم المجال [دبد] الانصهار الإعلان و VP16 transactivation المجال [VP16AD] الانصهار الإعلان) عنصر المراعية GAL4 (GAL4RE) تنصهر بلازميد مراسل لوسيفراس. عند الانصهار GAL4DBD الإعلان والانصهار VP16AD قام وجعل من ديمر في الخلايا، هذا البروتين المعقدة يربط GAL4RE، وثم، ينشط تعبير جينات لوسيفراس من خلال نشاط النسخ تعتمد VP16AD. التنشيط بوساطة 4OHT لوسيفراس أعلى في الخلايا HepG2 التي تم transfected مع الماوس قام ERα الانصهار البروتين التعبير والبلازميدات مما في الإعلان ERα البشرية الانصهار البروتين التعبير بلازميد transfected الخلايا. هذه النتيجة تشير إلى أن فعالية الماوس 4OHT-تعتمد على نشاط هوموديميريزيشن قام ERα أعلى من البشر ERα الإعلان. بشكل عام، استخدام الإنزيم M2H أنه ليس مثاليا لتقييم نشاط ثنائي قام مستقبلات النووية، يغاندس ناهضة تعزيز مستوى النشاط قام القاعدية والذي يعوق الكشف عن نشاط ثنائي قام. ووجدنا أن 4OHT لا يعزز النشاط القاعدي قام ERα. وهذا عامل أساسي لكونه قادراً على تحديد وكشف بنشاط ثنائي الإعلان تعتمد على 4OHT بنجاح باستخدام مقايسة M2H. قد يتم تطبيق فحوصات M2H المستندة إلى قام ERα بدراسة نشاط مؤثر جزئي المغيرون مستقبل الإستروجين الانتقائي (مثلاً، 4OHT) في مختلف أنواع الخلايا الثديية.

يعرض الشكل 3 مخطط الاستجابات الممكنة في تركيبة (ط) وتركيبة (ثانيا) بلازميد transfected الخلايا. وترد النتائج التجريبية في الشكل 4. يظهر نشاط مجموعة (ط) (pG5-لوك + ببيند-mERαEF + ميثاق) التحفيز من 10 نانومتر E2 (الشكل 4أ)، لأنه يتضمن ...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay at JoVE.com

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

نحن نقدم طريقة لتحليل 4-هيدروكسي-تاموكسيفين-المعتمدة على الإستروجين مستقبلات ألفا ملزم يجند المجال ثنائي النشاط باستخدام مقايسة الهجين اثنين الثدييات.

الكشف عن نشاط ثنائي ملزم يجند المجال الإستروجين مستقبلات ألفا باستخدام مقايسة الهجين اثنين الثدييات

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

حتى هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول قدرة يغاندسات إستروجين لتنظيم مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا وآليات التضمينات مستقبلات هرمون الاستروجين الانتقائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه هو طريقة بسيطة. أنه يدل على ligand تعتمد على هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا ligand ربط المجال نشاط ال ديمرين في الخلايا.إثبات الإجراء سيكون تانر جيفرسون، طالب ما بعد الدكتوراه من مجموعتنا. يستخدم هذا الأسلوب ثلاثة بلازميدات مختلفة للكشف عن مستقبلات الإستروجين liga binding المجال نشاط ال ديمرينيم في الخلايا. pG5-لوك هو plasmid مراسل لوسيفيراز للكشف عن فعالية النشاط الخافت.pBIND الماوس هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF هو عامل النسخ GAL4 GAL4 المستجيبة للgalctose DNA ملزمة للماوس الرئيسي تنصهر ألفا ليغاند مجال تجليد التعبير plasmid الذي يربط مع عنصر الاستجابة GAL4 على مراسل pG5-لوك. pACT الماوس هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF هو فيروس الهربس البسيط transx جزء بروتين VP16 تنشيط المجال تنصهر هرمون الاستروجين الماوس مستقبلات ألفا ليغاند تجليد المجال التعبير plasmid التي لا تربط مباشرة إلى pG5-لوك مراسل. عندما يكون يغاند المناسبة موجودة, البروتينات المستمدة من مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس pBIND ألفا EF وpACT مستقبلات هرمون الاستروجين الفا EF plasmids ربط من خلال مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ligand مجال ملزم.يتم تحديد كفاءة التممير من قبل نشاط لوسيفالاس. الخطوة الأكثر أهمية هي السيطرة على نشاط هرمون الاستروجين الماوس pBIND مستقبلات ألفا EF المشتقة البروتين. يجب تقييم نشاط هرمون الاستروجين المستمدة من مستقبلات ألفا ligand ربط المجال في كل ليغاند دون مستقبلات هرمون الاستروجين pACT ألفا EF plasmid قبل تحليل مستقبلات هرمون الاستروجين تعتمد على ligand يميّد المجال.تبدأ بإضافة تركيبات البلازميد المناسبة في اثنين من أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر لكل تركيبة. إعداد تركيبتين من خليط الحمض النووي. أول أنبوب يحتوي على pG5 لوك، pBIND-هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF، وbsasmids pACT فارغة.أنبوب الثاني يحتوي على pG5-لوك، pBIND-هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF، وpACT-هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا EF plasmids. للتعجيل بالحمض النووي، أضف 1/9 من حجم خليط الحمض النووي من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس و20X ثلاثة أسيتات الصوديوم المولر حجم 100٪ الإيثانول إلى خليط الحمض النووي في كل أنبوب ودوامة الأنابيب. تخزين الخلائط في 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل الطرد المركزي في أقصى سرعة في صباح اليوم التالي.تجاهل supernatants وإعادة تعليق الكريات غير مرئية في 120 ميكرولتر من 75٪ الإيثانول لكل أنبوب، مع الحرص على شطف أي الحمض النووي عالقة في الدواخل من الأنابيب. بعد الطرد المركزي الثاني في ظل نفس الظروف، والتخلص من عظمى وتجفيف الحمض النووي في فراغ المكثف لمدة 30 دقيقة. لtransfection، وغسل خلايا سرطان الكبد البشري المعدة مرتين مع 0.5 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة PBS لكل غسل وتغذية الخلايا مع 0.5 ملليلتر من 37 درجة مئوية جديدة الفينول الأحمر خالية MEM تكملها 10٪ الفحم جردت الحرارة تنشيط مصل البقر الجنين واثنين من millimolar L-الجلوتامين.بعد ذلك، تعليق خليط الحمض النووي المجفف البلازميد ومبيد الانبعاثات في الحجم المناسب من DMEM لكل عدد من الآبار في أنابيب الطرد المجهري 1.5 ملليلتر الفردية. إضافة حجم متساو من مُكْشف نقل الملوثات إلى كل أنبوب خليط الحمض النووي البلازمي المُعلَّق من DMEM. بعد حضانة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف 25 ميكرولترات من خليط الحمض النووي إلى الآبار التجريبية المناسبة لطبقة ثقافة خلايا سرطان الكبد الكبدية البشرية التي تبلغ 24 بئرًا لمدة ست ساعات في حاضنة ثقافة الخلايا.ونهاية الحضانة، واستبدال المتوسطة transfection مع 0.5 ملليلتر من 37 درجة مئوية جديدة الفينول الأحمر خالية MEM تكملها مع 10٪ الفحم تجريدها من الحرارة المعطلة FBS، اثنين من ملليمولار L-الجلوتامين، 1٪ بنسلين الستربتوميسين، وليغاند لكل بئر وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلايا لآخر 16 إلى 18 ساعة. في صباح اليوم التالي، وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في البئر وإرفاق الخلايا من كل بئر مع 100 ميكرولترات من العازلة الانحلال السلبي في بئر وهز قوية مع خلاط دوامة. ثم تجميد الخلايا في النيتروجين السائل.في يوم مقايسة لوسيفيراز المزدوجة ، اهز الليسات على شاكر حتى تصل اللوحة إلى درجة حرارة الغرفة ، ونقل 10 ميكرولترات من الليسيت إلى آبار فردية من لوحة بلاستيكية بيضاء من 96 بئرًا. ثم قراءة نشاط لوسيفراز من كل عينة الخلية lysate على قارئ microplate. علاج pBIND الماوس مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا EF وبلازميدات pACT الخلايا العابرة مع 10 استراديول نانومولار يحفز نشاط luciferase كما مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ليغاند ملزم المجال يحتوي على التفكك في مجال التانسلوب تعتمد على ليجوند، AF-2.واحد و 10-نانوموللار التركيزات ومع ذلك, حث على نشاط لوسيفيراز في الخلايا transerd مع مزيج من pBIND وpACT الماوس مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا EF plasmids, مما يشير إلى جدوى هذا الإجراء لتقييم مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ligand مجال الربط نشاط التمرم في ما يصل إلى نانومولار واحد من العلاج استراديول. العلاج مع 4-hydroxy-تاموكسيفين لا تثير نشاط لوسيفيراز في مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس pBIND ألفا EF وبلازميد بلازميد الخلايا المصابة, مما يشير إلى أن لا يتم تنشيط وظيفة AF-2 من مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا من قبل هذا ليغاند. ما يصل إلى 10 تركيزات نانومولار ومع ذلك, يدفع نشاط لوسيفيرايز في الخلايا transerd مع مزيج من pBIND وpACT مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس ألفا EF plasmids, مما يشير إلى أن هذا الإجراء هو ممكن لتقييم مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ligand ربط المجال نشاط ال ديمر في ما يصل إلى 10 نانومولر من 4-hydroxy-تامينفينوكسي العلاج.النشاط من مزيج من pBIND وpACT الماوس هرمون الاستروجين مستقبلات ألفا ligand تجليد المجال التعبير plasmids مع 4-hydroxy-تاموكسيفين هو أعلى بكثير من مزيج من pBIND وpACT مستقبلات هرمون الاستروجين الإنسان ألفا ligand تجليد المجال التعبير plasmids. وهذا يشير إلى أن 4-hydroxy-تاموكسيفين تعتمد على نشاط التجانس من مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس المجال ملزم ألفا ليغاند هو أكثر فعالية من مستقبلات الإستروجين الإنسان ألفا ليغاند ملزم المجال. وعلاوة على ذلك، فإن 4-hydroxy-تاموكسيفين تعتمد على نشاط التجانس من مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس ألفا ليغاند مجال ملزم يحتوي على المجال F الإنسان هو أقل بكثير من ذلك من نوع هرمون الاستروجين الماوس البرية مستقبلات ألفا ليغاند ملزم المجال.في المقابل، 4-hydroxy-تاموكسيفين تعتمد على نشاط التجانس من مستقبلات الإستروجين الإنسان المجال ملزم ألفا ligand التي تحتوي على نطاق F الماوس أعلى بكثير من ذلك من نوع هرمون الاستروجين البشري مستقبلات ألفا ليغاند مجال ملزم. وهذا يشير إلى أن المجال F له تأثير على الأنواع المحددة 4-hydroxy-تاموكسيفين تعتمد على مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ليغاند الربط مجال النشاط. أثناء محاولة هذا الإجراء, من المهم أن نتذكر لاختبار النشاط القاعدي من GAL4 الحمض النووي ملزمة المجال تنصهر مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا ligand نشاط المجال مع ligand الخاص بك.وينبغي أن يكون هذا النشاط هو نفس معاملة المركبات.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

أسلوب العامة للكشف عن تكوين نيتروساميدي في الأيض في المختبر من نيتروسامينيز من الفسفرة P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

تقييم عملية الهجرة وغزو الخلية: مقارنة من الصفر فيديو المستندة إلى مجهر الجرح المقايسة والمقايسة الدائرة Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

باستخدام المقايسة دوت لتحليل هجرة أوراق الخلية

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

كريسبر/Cas9 باستخدام الجينات للتحقيق في نشاط النمطان Calreticulin المسخ في الخلايا المكونة للدم سيتوكين تعتمد على تحرير

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

إجراء شامل تقييم أداء نيوفاسكولاريزيشن هيمانجيوبلاستوما المفترضة استخدام كروي تنتشر في التحليل في المختبر

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Osteosarcoma متلازمة لي-Fraumeni الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث المستمدة من المريض باستخدام النمذجة

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

رامان الرنين المزودة بسطح نثر راتيوميتري نانوبروبي للكشف عن سرطان المبيض المجهرية عن طريق مستقبلات حمض الفوليك استهداف

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) خلايا T للعلاج المناعي بالتبني

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

في المختبر إنشاء خط الخلايا السرطانية للراس والرقبة المهندسة جينيا باستخدام نظام كاس 9 الفيروسات المرتبطة Adeno

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

رسم خرائط للعلاقات بين الهيكل والوظيفة لعوامل النسخ غير المنضبطة باستخدام التحليل النسخي

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...